鼠骨髓間充質(zhì)干細胞移植對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸的修復作用研究*

高福來　紀桂賢　張利利　李莉　崔紅梅

(秦皇島市第一醫(yī)院，河北 秦皇島 066000)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)是指發(fā)生在結(jié)腸和直腸的一類慢性非特異性炎癥，病變局限于腸粘膜及粘膜下層，患者表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、粘液膿血便等[1]。有文獻報道[2]，UC患者發(fā)生結(jié)直腸癌的風險隨著患病時間會顯著升高，30年后可達18%。癌癥是UC患者死亡的主要原因。近年來UC在我國的發(fā)病率也有明顯升高趨勢。由于其病因及發(fā)病機制尚不明確，臨床沒有特異性治療方法，主要采用對癥治療，效果一般，患者病情易反復，且遷延不愈，嚴重影響患者健康和生活質(zhì)量[3]。陳巧玲等[4]研究采用重組色素上皮源性因子腺病毒(Ad-PEDF)轉(zhuǎn)染小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)后，評估MSCs作為攜帶PEDF基因載體的可行性，為鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的進一步應(yīng)用提供了借鑒。骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)是具有多向分化能力的干細胞[5]，通過不同的條件干預(yù)，能夠分為神經(jīng)元、干細胞、成骨細胞、脂肪細胞和內(nèi)皮細胞等，在細胞替代治療和基因治療中具有重要的臨床價值，但是國內(nèi)外對于BMSCs治療潰瘍性結(jié)腸炎的研究較少。故在本次研究中，通過對UC模型大鼠采用骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療，觀察其對大鼠結(jié)腸的修復作用，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1　材料與方法

1.1材料雄性BALA/c健康大鼠80只(SPF級)，8周齡，體重151～200g，購自凱學生物科技(上海)有限公司，許可證號：NO.0152068。所有大鼠分籠飼養(yǎng)1周，環(huán)境條件為20～24℃，相對濕度55%～60%，自然光照周期。

1.2試劑胎牛血清，購于Invitrogen公司；DMEM培養(yǎng)基，購于Thermo公司；PBS緩沖液，購于Solarbio公司；葡聚糖硫酸鈉(DSS)，購于MP Biomedicals公司；D-乳酸(D-LAC)、二胺氧化酶(DAO)ELISA試劑盒，購于Sigma公司；IL-6、IL-10、TNF-αELISA試劑盒，購于北京百奧萊博科技有限公司；髓過氧化物酶(MPO)檢測試劑盒，購于南京建成生物工程研究所；淋巴細胞分離液，購于天津灝陽生物有限公司。

1.3儀器石蠟切片機，購于LEITZ公司；光學顯微鏡，購于洛陽惠爾納米科技有限公司；組織搗碎勻漿機，購于天津博天勝達科技發(fā)展有限公司；臺式離心機，購于湖南赫西儀器裝備有限公司；自動酶標儀，購于昆山吉和力儀器有限公司；超凈工作臺，購于蘇州凈化設(shè)備儀器公司。

1.4方法

1.4.1細胞提取取2只大鼠，采用10%的水合氯醛450mg/kg進行腹腔麻醉，腿部消毒，無菌條件下切開皮膚、肌肉，將兩側(cè)股骨分離取出，置于無菌紗布上，除盡股骨上的軟組織，剪掉股骨兩端。使用5ml注射器抽取2ml肝素生理鹽水，從一端插入骨髓腔，沖洗出骨髓，收集骨髓于無菌離心管內(nèi)。然后離心處理，3000r持續(xù)5min，棄去上清液，加入3ml生理鹽水重懸；再取一個無菌離心管，加入密度為1.092的大鼠淋巴細胞分離液12ml，取3ml骨髓細胞懸液加入此管內(nèi)，離心處理，3000r持續(xù)20min，此時管內(nèi)分4層，從上向下吸取第2層液體，置于無菌離心管內(nèi)，用5ml無菌血清DMEM培養(yǎng)液洗滌，再次離心，3000r持續(xù)5min，棄去上清液，加入2mlPBS緩沖液；取16μlPKH26加入一個裝有2mlDihentC的離心管內(nèi)，然后將骨髓細胞混合懸液加入此管中，孵育5min，緩慢搖勻，加入4ml胎牛血清，孵育1min，加入8mlDMEM培養(yǎng)液洗滌，離心，3000r持續(xù)10min，棄去上清液，用DMEM繼續(xù)洗滌3次，棄去上清液，加入6ml生理鹽水重懸。

1.4.2大鼠分組與造模選擇75只大鼠，按照隨機數(shù)字表法，將其分為正常組、模型組、低濃度組、中濃度組和高濃度組各15只。正常組大鼠給予正常飲食水飼養(yǎng)。其余4組大鼠建立UC模型：將DSS溶于蒸餾水中，配制成5%DSS溶液，給予大鼠飲用1周，然后給予大鼠蒸餾水飲用1周，如此反復4次，UC模型建立。低、中、高濃度組大鼠采用尾靜脈注射BMSCs懸液0.4ml，細胞濃度分別為0.5×106/ml、1×106/ml和2×106/ml。模型組和正常組大鼠尾靜脈注射0.4ml生理鹽水。正常飲食水飼養(yǎng)。每組大鼠在移植后第0、7、21d各處死5只大鼠，對相關(guān)情況及指標進行觀察檢測。

1.5觀察指標①大鼠活動和體征的觀察：記錄大鼠每天體重、大便性狀和便血情況，并采用疾病活動指數(shù)(DAI)進行評分，每項分為0～4分，總分12分，分數(shù)越高，大鼠病情越嚴重。②大鼠血清相關(guān)指標的檢測：抽取大鼠內(nèi)眥靜脈血2ml，離心處理，取上清液即為血清，使用檢測試劑盒，按照說明書操作，檢測TNF-α、IL-6、IL-8、D-LAC、DAO含量。③病理切片的制作：將大鼠處死后，取距離肛門10cm以上的結(jié)腸組織，使用10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋處理，切片，HE染色后封片，光學顯微鏡下觀察。④MPO的測定：將大鼠處死后，稱取結(jié)腸組織，按照重量：體積=1:19的比例加入HTAB緩沖液，制成5%的組織勻漿，然后加入PBS緩沖液，在460nm波長下，測定吸光度值，計算出MPO的含量。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠結(jié)腸組織病理切片觀察①正常組大鼠結(jié)腸粘膜結(jié)構(gòu)完整，無水腫、潰瘍，無炎癥。②模型組大鼠結(jié)腸粘膜明顯減少或消失，充血水腫，有潰瘍，大量炎性細胞浸潤。③④⑤各濃度組大鼠結(jié)腸充血水腫情況好于模型組，潰瘍和糜爛減少，炎性細胞減少，并且隨著濃度的升高，結(jié)腸粘膜結(jié)構(gòu)越好。

圖1　各組大鼠結(jié)腸組織病理切片F(xiàn)igure 1　Colonic histopathological sections of rats in different groups注：①正常組，②模型組，③低濃度組，④中濃度組，⑤高濃度組

2.2各組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-8含量比較模型組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-8含量明顯高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；低、中、高濃度組TNF-α、IL-6、IL-8含量均低于模型組，并且隨著濃度的升高，各組TNF-α、IL-6、IL-8含量均降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

2.3各組大鼠不同時間段血清D-LAC含量比較移植后第0d，正常組大鼠血清D-LAC含量明顯低于其余各組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；移植后第7d，模型組與低濃度組大鼠血清D-LAC含量高于其余組(P<0.05)；移植后第21d，低、中、高濃度組大鼠血清D-LAC含量與正常組無差異(P>0.05)，但低于模型組(P<0.05)，見表2。

2.4各組大鼠不同時間段血清DAO含量比較移植后第0d，正常組大鼠血清DAO含量明顯低于其余各組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；移植后第7d，模型組與低濃度組大鼠血清DAO含量高于其余組(P<0.05)；移植后第21d，各組大鼠血清DAO含量均無差異(P>0.05)，見表3。

表1　各組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-8含量比較Table 1　Comparison of serum TNF-α, IL-6 and IL-8 content of rats in different groups

注：與模型組比較，①P<0.05；與低濃度組比較，②P<0.05；與中濃度組比較，③P<0.05

表2　各組大鼠不同時間段血清D-LAC含量比較Table 2　Comparison of serum D-LAC content in different time periods of rats in different groups

注：與模型組比較，①P<0.05；與低濃度組比較，②P<0.05

表3　各組大鼠不同時間段血清DAO含量比較Table 3　Comparison of serum DAO content in different time periods of rats in different groups

注：與模型組比較，①P<0.05；與低濃度組比較，②P<0.05

2.5各組大鼠不同時間段結(jié)腸MPO含量比較移植后第0d，正常組大鼠結(jié)腸MPO含量明顯低于其余各組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。移植后第7d，模型組與低濃度組大鼠結(jié)腸MPO含量高于其余組(P<0.05)；移植后第21d，各組大鼠結(jié)腸MPO含量均無差異(P>0.05)，見表4。

2.6各組大鼠不同時間段DAI評分比較移植后第0、7、21d，正常組大鼠DAI評分均為0，明顯低于其余各組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；移植后第7、21d，各組DAI評分均下降，低、中、高濃度組低于模型組，且隨著濃度的升高，DAI評分越低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表5。

表4　各組大鼠不同時間段結(jié)腸MPO含量比較Table 4　Comparison of colonic MPO content in different time groups of rats in different groups

注：與模型組比較，①P<0.05；與低濃度組比較，②P<0.05

表5　各組大鼠不同時間段DAI評分比較Table 5　Comparison of DAI scores in different time periods of rats in different groups

注：與模型組比較，①P<0.05；與低濃度組比較，②P<0.05；與中濃度組比較，③P<0.05

3　討論

骨髓間充質(zhì)干細胞是來自于中胚層的干細胞，主要存在于骨髓中[6],因其具有增殖傳代能力強、多向分化潛能、不存在倫理問題和排斥反應(yīng)等特點，是最有前途的組織工程種子細胞[7]，在不同條件下可以向成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、心肌細胞以及神經(jīng)細胞分化[8-9]。潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病數(shù)近年來有明顯增多趨勢，患者病程長，病情進行性加重，而且會伴發(fā)大量嚴重并發(fā)癥，如腸梗阻、腸穿孔、出血等[10]，嚴重影響了患者的生活質(zhì)量。由于其病因及發(fā)病機制不明，主要認為以炎癥免疫機制[7]為主，盡管治療方法較多，但大多為抗炎對癥治療，缺乏特異性，難以根治。骨髓間充質(zhì)干細胞具有很強的分化能力，可以通過不同的條件誘導形成多種細胞組織，而且可以向炎癥、損傷的組織遷移[12]。有文獻報道稱[13]，BMSCs還有特殊的免疫特點，可以在異體內(nèi)存活分化。因此采用BMSCs移植治療UC的研究也逐漸增多，但對其作用機制的研究相對較少。

正常的腸道內(nèi)環(huán)境的保護作用主要是依靠腸粘膜屏障，由腸粘膜上皮和細胞間連接復合體組成[14]，能夠分隔腸腔內(nèi)物質(zhì)，防止腸道內(nèi)菌群失調(diào)。其中腸粘膜屏障功能的主要指標是腸道通透性[15]的檢測，包括腸粘膜的形態(tài)學檢查，血液D-LAC和DAO的檢測。正常人體內(nèi)D-LAC含量極低，一方面是自身不合成，另一方面是缺乏代謝的相關(guān)酶，主要是由腸道內(nèi)細菌代謝或裂解產(chǎn)生。當腸道通透性增加時，細菌增多，產(chǎn)生大量的D-LAC進入血液。DAO是腸絨毛上皮細胞的標記酶，當腸粘膜受損時，細胞內(nèi)的DAO大量入血[16]。兩種物質(zhì)均能夠間接反映腸粘膜的損傷程度，從而提示腸道屏障功能。

結(jié)腸粘膜細胞作為維持腸道功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，UC經(jīng)常伴隨結(jié)腸粘膜上皮細胞加速凋亡，而且由于腸道內(nèi)產(chǎn)生大量的炎性細胞因子以及介質(zhì)，進一步加劇了損傷腸粘膜屏障功能[17-18]。在本研究中，經(jīng)過干細胞移植后，觀察大鼠結(jié)腸鏡下切片，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠結(jié)腸粘膜明顯減少或消失，充血水腫，有潰瘍，大量炎性細胞浸潤，提示UC大鼠腸道屏障功能被破壞。低、中、高濃度組大鼠結(jié)腸充血水腫情況好于模型組，潰瘍和糜爛減少，炎性細胞減少，而且結(jié)腸的狀態(tài)呈明顯的濃度相關(guān)性，說明干細胞移植能夠明顯改善UC大鼠腸粘膜損傷情況，修復腸道屏障。模型組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10含量明顯高于正常組(P<0.05)，說明潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生發(fā)展與炎癥反應(yīng)有關(guān)。TNF-α、IL-6、IL-8都是重要的促炎癥細胞因子，可由巨噬細胞和T細胞分泌[19]，通過誘導和促進炎癥反應(yīng)，使腸道黏膜屏障被破壞，以至于產(chǎn)生潰瘍，而且加強了細胞通透性，引起中性粒細胞大量浸潤[20]，加重炎癥。低、中、高濃度組TNF-α、IL-6、IL-10含量均低于模型組，并且隨著濃度的升高，各組TNF-α、IL-6、IL-10含量均降低(P<0.05)，說明干細胞移植具有抑制炎癥反應(yīng)的作用。移植后第7d，模型組與低濃度組大鼠血清D-LAC、DAO、組織MPO含量高于其余組(P<0.05)；移植后第21d，低、中、高濃度組大鼠血清D-LAC、DAO、組織MPO含量與正常組無差異(P>0.05)，這說明高濃度的干細胞移植治療，可以明顯修復大鼠腸道屏障，起效時間快。MPO是中性粒細胞的一種酶，可以用來反應(yīng)結(jié)腸組織的炎癥反應(yīng)程度[21]。移植后第7、21d，各組DAI評分均下降，低、中、高濃度組低于模型組，且隨著濃度的升高，DAI評分越低(P<0.05)，這提示干細胞移植能夠改善大鼠病情，緩解腸道癥狀[22]。

4　結(jié)論

采用鼠骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療潰瘍性結(jié)腸炎大鼠，能夠明顯改善大鼠病情，其機制可能是通過抑制炎癥因子的分泌，從而減輕炎癥反應(yīng)，使腸道屏障功能恢復。但具體的作用機制還需要進一步深入研究。