MicroRNA-125a-5p表達對彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤耐藥及臨床預(yù)后的影響*

韓瑩，楊文秀，濮珍紅，萬瓏

（1.貴州醫(yī)科大學(xué) 病理學(xué)教研室，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，貴州 貴陽 550004）

彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL）是成人最常見的非霍奇金淋巴瘤，其發(fā)病占非霍奇金淋巴瘤的30%～40%[1]。由于分子遺傳學(xué)、臨床過程和預(yù)后、形態(tài)學(xué)及免疫表型等方面的差異，DLBCL是一組異質(zhì)性的淋巴瘤。目前，利妥昔單抗+CHOP方案為DLBCL的標(biāo)準(zhǔn)治療方案，只能使50%的患者得到持續(xù)緩解，約45%患者則表現(xiàn)出原發(fā)耐藥和緩解后復(fù)發(fā)[2]。腫瘤的臨床分期、國際預(yù)后指數(shù)（international prognosis index, IPI）和增殖活性等是惡性腫瘤常用的預(yù)后評估因素，DLBCL的遺傳學(xué)改變和腫瘤細(xì)胞的免疫表型對其臨床預(yù)后和治療效果有明顯影響，但發(fā)現(xiàn)IPI同分值的DLBCL患者預(yù)后差異較大[3]。因此，尋找DLBCL的新型預(yù)后評估因素很有意義。MiRNA是非編碼調(diào)控型RNA分子，可影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展及臨床進程。MicroRNA-125a（miR-125a）在DLBCL細(xì)胞群中能靶向抑制腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白3基因（the tumor necrosis factor,alpha-induced protein 3 gene, TNFAIP3, A20），進而激活NF-κB通路而影響腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡，腫瘤的侵襲性和耐藥性等[4-6]。有研究證明[7]，多藥耐藥基因1（multi-drugs resistance gene, MDR1）啟動子上存在一個NF-κB結(jié)合位點，同時在預(yù)后不良的DLBCL患者中miR-125b表達上調(diào)。據(jù)此，本研究通過檢測DLBCL患者腫瘤組織中miR-125a-5p的mRNA水平以及P糖蛋白（P-glycoprotein, P-gp）表達、細(xì)胞增殖核抗原（nuclcar-associated antigen, Ki-67）蛋白表達對預(yù)后的影響，探討miR-125a-5p表達在DLBCL臨床過程和預(yù)后評估中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2006年1月-2016年12月于貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科診斷的彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者和檔案石蠟標(biāo)本，按照WHO 2016年淋巴瘤分類更新的標(biāo)準(zhǔn)，篩選出非特指的DLBCL患者，將腫瘤組織大小超過0.5 cm直徑的90例DLBCL納入研究（DLBCL組），并以8例淋巴結(jié)反應(yīng)性增生患者作為研究對照（對照組）。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器P-gp單克隆抗體（英國Abcam公司），Ki67單抗、二抗及其他免疫組織化學(xué)檢測試劑（北京中杉金橋公司），Trizol試劑盒（美國Invitrogen公司），DEPC水（日本Sigma公司），miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Gene Copoeia公司）。紫外分光光度計（Nano Drop1000，美國Thermo Sciencific公司），CFX Connect Real-time PCR檢測系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）。

1.2.2 蘇木素-伊紅染色 按照常規(guī)病理操作規(guī)范進行[8-9]。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色 采用PV二步法，以枸櫞酸鹽（pH=6.0）進行高壓熱修復(fù)。一抗稀釋度：P-gp單克隆抗體1∶50，Ki67單抗1∶100。二抗及其他免疫組織化學(xué)檢測試劑遵循實驗步驟，按照說明書依次添加。P-gp陽性對照為心肌組織，Ki67陽性對照為反應(yīng)性增生淋巴結(jié)，空白對照以0.01 mol PBS（pH=7.2）代替一抗。

判讀標(biāo)準(zhǔn)：隨機選擇10個高倍鏡視野（×400）計數(shù)1 000個細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)，取10個高倍鏡視野均數(shù)為其陽性率。P-gp陽性信號定位在細(xì)胞膜和細(xì)胞漿，以腫瘤細(xì)胞陽性率＞20%為陽性，＜20%為陰性。

1.2.4 miR-125a-5p檢測 ①總RNA提?。菏灲M織切片、脫蠟、組織消化，采用Trizol試劑盒提取DLBCL及淋巴結(jié)反應(yīng)性增生石蠟組織的總RNA，將提取的總RNA溶解至0.1%的DEPC水中，采用紫外分光光度計測定RNA濃度和純度，在260～280 nm波長范圍檢測光密度值，控制在1.8～2.0之間以滿足檢測所需RNA質(zhì)量；②RNA逆轉(zhuǎn)錄：將模板總RNA置于冰上溶解，采用miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，嚴(yán)格按照說明書操作。在冰上配制反應(yīng)體系：1 μl 205 u/μl poly A polymerase、1 μl RTase Mix、5 μl 5×PAP/RT Buffer、不同體積總RNA，以ddH2O補足反應(yīng)體系，總體積達到25 μl。輕柔混勻，12 000 r/min離心2 min后將反應(yīng)液置于PCR儀，37℃孵育60 min，然后85℃孵育5 min終止反應(yīng)，置入4℃保存；③實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）：選用All-in-OneTMmiRNA qPCR Mix試劑盒，內(nèi)參基因選用U6，按照試劑盒說明書操作。內(nèi)參U6引物和目的has-miR-125a-5p引物購自美國Gene Copoeia公司，嚴(yán)格遵照試劑盒操作說明書，每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔，于八聯(lián)管中配制反應(yīng)體系 ：10 μl All-in-One qPCR Mix、2 μl All-in-oneTMmiRNA qPCR Primer、2 μl Universal Adaptor PCR Primer、2 μl cDNA、4 μl ddH2O，總體積達20 μl；輕柔混勻，12 000 r/min離心2 min，CFX Connect real-time PCR檢測系統(tǒng)中進行，設(shè)置反應(yīng)程序：95℃ 10 min，95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃（收集熒光信號）10 s 45個循環(huán)，95℃ 10 s，熔解曲線溫度：65～95℃，每5秒升高0.5℃；④分析每個樣本的Ct值，以U6作為內(nèi)參，由公式2-ΔΔCt計算miR-125a-5p的相對表達量。ΔCt=miR-125a-5p Ct平均值-U6 Ct平均值，ΔΔCt=DLBCL組ΔCt-對照組ΔCt。以2-ΔΔCt中位數(shù)作為分界值，將DLBCL患者組分為miR-125a-5p高表達組和低表達組。

1.3 隨訪

主要采用電話隨訪、門診及住院病例復(fù)查及信訪。隨訪開始時間為首次明確病理診斷，隨訪截止時間為2016年12月31日，總生存期（overall survival,OS）時間計算從診斷確立到DLBCL引起的死亡或隨訪終止，無復(fù)發(fā)生存期（relapse free survival,RFS）時間計算從診斷確立到DLBCL復(fù)發(fā)、死亡或隨訪終止，與本病不相關(guān)的死亡算為截尾。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件，兩組間獨立樣本采用Mann-WhitneyU檢驗，miR-125a-5p表達與臨床病理特征參數(shù)統(tǒng)計采用χ2檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier法及Log-rank檢驗，采用COX風(fēng)險比例模型對各個協(xié)變量進行效應(yīng)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床病理特征

90例DLBCL中，男性55例，女性35例，男女比為1.6∶1.0；發(fā)病年齡20～85歲，中位年齡64歲；原發(fā)于淋巴結(jié)內(nèi)41例，淋巴結(jié)外49例；non-GCB DLBCL型64例，GCB-DLBCL型26例；Ann Arbor臨床分期Ⅰ期27例，Ⅱ期33例，Ⅲ期6例，Ⅳ期24例；乳酸脫氫酶（LDH） 109～245 u/L 68例，＜245 u/L 22例；IPI評分0～1分25例，2分32例，3分26例，4～5分7例。

2.2 miR-125a-5p在DLBCL組和對照組中的表達

在DLBCL組和對照組中miR-125a-5p表達量分別為3.532（0.230，10.960）和1.015（0.340，2.540），與對照組比較，miR-125a-5p在DLBCL組中高表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（U=113.00，P=0.001），見圖1。

圖1 兩組miR-125a-5p相對表達量

2.3 miR-125a-5p表達與DLBCL患者臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)miR-125a-5p的表達水平，以中位數(shù)值為界，將90例DLBCL患者分為miR-125a-5p高表達組（n=47）、miR-125a-5p低表達組（n=43）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-125a-5p的表達在正常LDH與LDH升高患者之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.427，P=0.020），在GCB與non-GCB患者中差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.744，P=0.009），而在不同年齡（＜60歲 vs ＞60歲）、性別、原發(fā)部位、Ann Arbor臨床分期和IPI評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.4 miR-125a-5p表達對P-gp蛋白表達的影響

在miR-125a-5p高表達組中P-gp蛋白陽性表達率為61.7%（29/47），而低表達組P-gp蛋白陽性率為39.5%（17/43），兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且高表達組高于低表達組。見圖2和表2。

表1 DLBCL患者中miR-125a-5p表達與臨床病理相關(guān)性

圖2 DLBCL中P-gp表達情況 （PV×400）

表2 miR-125a-5p與P-gp的表達 例

2.5 miR-125a-5p表達水平對患者預(yù)后的影響

圖3 兩組生存曲線圖

圖4 兩組生存曲線圖

在90例DLBCL患者中，完整隨訪資料的有51例，隨訪率達到56.7%，隨訪時間0.5～120.5個月（中位隨訪時間58個月）。本研究以51例患者miR-125a-5p表達水平的中位數(shù)值為界，分為miR-125a-5p的mRNA的高表達組和低表達組，Kaplan-Meier及Log-rank檢驗分析結(jié)果顯示，miR-125a-5p低表達組的中位生存時間65個月高于高表達組34個月，低表達組中位無復(fù)發(fā)生存時間60個月高于高表達組36個月，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（見圖3、4）。單因素COX回歸分析顯示：Ann Arbor分期Ⅲ、Ⅳ期、miR-125a-5p高表達與不良預(yù)后相關(guān)；多因素COX風(fēng)險模型分析顯示，Ann Arbor分期Ⅲ、Ⅳ期和miR-125a-5p高表達均可作為DLBCL患者評估預(yù)后的因素（見表3、4）。

表3 總生存期單因素COX風(fēng)險模型回歸分析

表4 總生存期多因素COX風(fēng)險模型回歸分析

3 討論

DLBCL是一組生長迅速、侵襲性高、預(yù)后具有高度異質(zhì)性的惡性非霍奇金淋巴瘤。近年來，IPI評分已經(jīng)成為評價DLBCL患者預(yù)后的金標(biāo)準(zhǔn)，盡管IPI評分能夠預(yù)測某些特定免疫亞型患者的病情進展，但是對于患病早期就需要了解病情變化以便進行早期治療的患者卻受到很多限制[10-11]。根據(jù)基因表達譜分型發(fā)現(xiàn)，相對non-GCB DLBCL、GCB-DLBCL患者有更好的預(yù)后，但是檢測價格過于昂貴不利于臨床上廣泛應(yīng)用和開展[12]。因此，對于能夠真正指導(dǎo)個體化治療和影響臨床進程的指標(biāo)，需要進一步探索和發(fā)現(xiàn)。

miRNA分子在轉(zhuǎn)錄后水平作用于靶標(biāo)mRNA，調(diào)控細(xì)胞的增殖凋亡及耐藥等生物學(xué)特征，同時作為抑癌基因或者癌基因影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展[13]。多種miRNA分子在DLBCL中都有異常表達，其表達水平直接影響DLBCL的預(yù)后。LAWRIE等[14]曾經(jīng)分析80例DLBCL患者中464種不同miRNA分子，發(fā)現(xiàn)miRNA能夠相對準(zhǔn)確地預(yù)測淋巴瘤的分型，有效地表明miRNA與淋巴瘤分化之間存在著密切的關(guān)系，為疾病早期診斷提供依據(jù)。miR-125家族包括miR-125a和miR-125b，WANG等[15]研究發(fā)現(xiàn)，高表達miR-125b的DLBCL患者預(yù)示復(fù)發(fā)、不良預(yù)后，它的失調(diào)先于臨床表現(xiàn)的出現(xiàn)和影像學(xué)診斷，可作為評價治療效果的新型預(yù)后靶向分子。

有報道認(rèn)為[16-17]，早期非小肺癌患者和肺癌細(xì)胞株中miR-125a-5p的表達量降低，在肺癌細(xì)胞中的表達水平可影響P53的表達和細(xì)胞凋亡。目前，miR-125a在DLBCL中的表達及其在藥物抵抗和風(fēng)險評估等方面中的作用少見報道。

NF-κB通路是本課題組研究DLBCL的發(fā)生、耐藥及預(yù)后等臨床進程中涉及的最重要的通路，A20基因TNFAIP3，是一個新的腫瘤抑制基因，它編碼的A20蛋白是一種具有雙重功能的鋅指蛋白，它通過裂解MALT1泛素鏈（一種NFκB活化相關(guān)因子）或通過抑制IκB的磷酸化而抑制NFκB的活化[18]。國內(nèi)外和本課題組前期的研究都發(fā)現(xiàn)，部分DLBCL中存在A20基因的缺失突變、錯義突變和甲基化，且ABCDLBCL中A20甲基化發(fā)生率高于GCB-DLBCL，還發(fā)現(xiàn)A20的突變和甲基化與NF-κB活化及其下游靶基因MDR1編碼的P-gp蛋白表達上調(diào)有關(guān)，A20突變的DLBCL中MDR1編碼的產(chǎn)物P-gp蛋白表達增多[19]。有研究報道[4]A20基因是miR-125a和miR-125b的直接靶標(biāo)，后兩者經(jīng)常在DLBCL中獲得和/或過表達，這種異常表達抑制A20而導(dǎo)致NF-κB異?；罨?。本研究通過檢測DLBCL腫瘤組織發(fā)現(xiàn)，DLBCL中miR-125a-5p的表達水平升高，且miR-125a-5p與腫瘤免疫表型之間存在相關(guān)性，推測miR-125a-5p在DLBCL中的上調(diào)表達也通過抑制A20的表達而促進NFκB的活化，異?；罨腘Fκ-B通過調(diào)節(jié)其下游靶基因而影響DLBCL的發(fā)生和發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，90例非特指DLBCL病例中，miR-125a-5p上調(diào)表達病例的耐藥蛋白P-gp的表達明顯升高，推測這可能是miR-125a-5p抑制A20表達而間接活化NF-κB的結(jié)果，并可能與DLBCL耐藥有關(guān)。

近年來，在CHOP方案和利妥昔單抗+CHOP方案治療DLBCL過程中，miRNA分子所發(fā)揮的預(yù)后潛在診斷價值越來越受到關(guān)注[20-21]，本研究通過追蹤51例DLBCL患者10年以上的生存及復(fù)發(fā)等情況，以miR-125a-5p表達的中位數(shù)為閾值，發(fā)現(xiàn)高表達組患者的OS和RFS均低于低表達組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義；單因素及多因素COX生存分析：患者的性別、年齡、免疫分型、原發(fā)部位、LDH、IPI評分及Ki67表達高低均與DLBCL預(yù)后沒有相關(guān)性，而高表達miR-125a-5p、Ann Arbor分期Ⅲ、Ⅳ可作為預(yù)后危險指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-125a-5p表達與Ann Arbor臨床分期不存在相關(guān)性，而兩者均與不良預(yù)后相關(guān)可能原因是，淋巴瘤Ann Arbor分期是按照病變累及的部位和范圍進行劃分，miR-125a-5p表達與DLBCL累及的部位和范圍無相關(guān)，而它們對預(yù)后的影響可能分別各自存在著一定的機制和原因，等待進一步去探索和發(fā)現(xiàn)。同本實驗結(jié)果不同的是，黃然欣等[22]發(fā)現(xiàn)，血清LDH水平可影響非霍奇金淋巴瘤（NHL）預(yù)后，正常血清LDH組比高LDH組藥物治療的有效率高。有研究發(fā)現(xiàn)[23]，將miRNA分子與IPI結(jié)合來建立存活率模型進行腫瘤的臨床結(jié)局評判會比單個模型更有利，而本實驗中并未發(fā)現(xiàn)IPI評分與DLBCL患者預(yù)后存在相關(guān)性，聯(lián)合評判到底取決于miRNA分子類別，還是與miRNA與IPI評分之間建立的關(guān)系模型有關(guān)，有待進一步研究。

綜上所述，miR-125a-5p在DLBCL中發(fā)揮著類似癌基因的作用，且可能靶向作用于A20基因，活化NF-κB通路介導(dǎo)MDR1/P-gp途徑，使患者對化療藥物產(chǎn)生抵抗影響預(yù)后，同時miR-125a-5p可作為評判DLBCL預(yù)后的分子標(biāo)志物，未來的實驗研究可一步步證實該結(jié)果的可靠性。