干旱脅迫對成藥期黨參生理特性的影響

王惠珍　陸國弟　陳紅剛　崔治家　杜弢　王亞麗

摘要：目的 研究成藥期黨參在干旱脅迫下的生理特性變化，揭示黨參響應(yīng)干旱脅迫的生理機(jī)制。方法 采用盆栽控水試驗，設(shè)置正常供水、輕度脅迫、中度脅迫和重度脅迫4個水分處理，通過測定黨參葉片相對含水量、細(xì)胞膜透性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量、抗氧化酶活性等指標(biāo)，研究干旱脅迫對黨參生理特性的影響。結(jié)果 隨干旱脅迫程度增加，黨參葉綠素a、葉綠素總含量和葉片相對含水量呈逐漸降低趨勢，葉綠素b無明顯變化；電導(dǎo)率呈先增加后降低的趨勢，丙二醛含量呈先增加后降低再增加的趨勢，超氧陰離子產(chǎn)生速率無明顯變化；過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）活性呈逐漸增加趨勢，超氧化物歧化酶無明顯變化；脯氨酸含量呈先增加后降低的趨勢，可溶性糖呈降低趨勢，可溶性蛋白無明顯變化。結(jié)論 干旱脅迫下，黨參通過增加脯氨酸含量調(diào)控細(xì)胞滲透勢，同時提高抗氧化酶POD和CAT活性，減輕膜脂過氧化產(chǎn)物對細(xì)胞的傷害。

關(guān)鍵詞：黨參；干旱脅迫；膜透性；保護(hù)酶；滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.03.016

中圖分類號：R282.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）03-0072-05

Abstract： Objective To study the physiological characteristics of Codonopsis Radix under drought stress； To reveal the physiological mechanism of Codonopsis Radix in response to drought stress. Methods Method of pot experiment was used to set up 4 water treatments： normal water supply， mild stress， moderate stress and severe stress. Through the determination of leaf relative water content， cell membrane permeability， osmotic adjustment contents and protective enzyme activity， the effects of drought stress on physiological characteristics of Codonopsis Radix were studied. Results With the drought stress increased， the chlorophyll a， total chlorophyll content and leaf relative water content of Codonopsis Radix decreased， but chlorophyll b had no obvious change； The conductivity increased first and then decreased； MDA contents increased first and then decreased and then increased； There was no significant change in the rate of superoxide anion production； POD and CAT activity increased； SOD had no significant change； The proline content increased first and then decreased； soluble sugar decreased； soluble protein had no significant change. Conclusion Under the condition of drought stress， by increasing the content of proline to regulate cell osmotic potential， Codonopsis Radixcan increase the antioxidant enzyme activity to reduce membrane lipid peroxidation damage to cells.

Keywords： Codonopsis Radix； drought stress； membrane permeability； protective enzyme； osmotic adjustment substance

我國干旱及半干旱地區(qū)面積廣，非干旱地區(qū)作物在生長季節(jié)也會發(fā)生不同程度的干旱。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國每年由干旱給農(nóng)業(yè)造成的損失相當(dāng)于其他所有環(huán)境因子的總和[1]。目前已在柴胡、蒲公英、金釵石斛、忍冬、文冠果等藥用植物上進(jìn)行了抗旱特性和耐旱機(jī)制研究[2-6]。

黨參Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.為桔?？贫嗄晟荼局参?，以干燥根入藥，具補中益氣、健脾益肺功效，用于脾肺氣虛、食少倦怠、咳嗽虛喘、心悸氣短、內(nèi)熱消渴等。甘肅渭源、隴西等地是黨參主產(chǎn)區(qū)。多年種植經(jīng)驗得出，黨參具有耐旱性，但其耐旱機(jī)制鮮見報道。因此，本研究通過盆栽控水試驗，探討干旱脅迫下黨參生理特性變化，為深入研究黨參抗旱或耐旱機(jī)制奠定基礎(chǔ)，也為半干旱地區(qū)黨參規(guī)范化栽培提供依據(jù)。

1 材料

試驗種苗為渭源縣清源鎮(zhèn)藥農(nóng)自育一年生黨參幼苗，帶有飽滿越冬芽，種苗根長16.0～18.0 cm、根頭直徑2.5～3.0 mm，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)杜弢教授鑒定為黨參Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.。

試驗選用盆口直徑25 cm、高30 cm的塑料水桶，底部均勻打孔以防積水爛根。土壤為沙壤土，pH 8.12，有機(jī)質(zhì)0.32%，全氮0.10%，速效磷53.2 mg/kg，速效鉀147.32 mg/kg。

臺式低溫高速離心機(jī)（Eppendorf 5418，德國艾本德股份公司），超純水分離系統(tǒng)（Molecular，北京科思佳科技有限責(zé)任公司），紫外分光光度計（752N型，上海精科實業(yè)有限公司），電導(dǎo)率測定儀（DDS-307，杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司）。

2 方法

2.1 盆栽試驗

于渭源縣清源鎮(zhèn)劉家河村實施盆栽試驗。每盆裝土19 kg，于2016年4月5日移栽，每盆4株，正常供水，直至出苗（4月25日）后15 d（5月10日），選取長勢一致的植株作為供試材料，進(jìn)行水分處理。

采用單因素完全隨機(jī)設(shè)計，根據(jù)黨參產(chǎn)區(qū)渭源縣2014年和2015年降雨量[7]及黨參生長發(fā)育情況，以全年降雨量480 mm為基礎(chǔ)，減去根莖類藥材農(nóng)閑期降雨量（約80 mm），分別設(shè)置360 mm（輕度脅迫）、320 mm（中度脅迫）和280 mm（重度脅迫）3個干旱處理，以400 mm灌溉量為對照（CK），各10次重復(fù)。從5月10日開始至收獲按180 d計算，每3 d灌溉1次，灌溉量換算結(jié)果見表1。

2.2 測定指標(biāo)

2.2.1 葉綠素含量

采用80%丙酮提取，分光光度計比色測定，以mg/g表示。

2.2.2 葉片相對含水量

取待測葉片，流水沖洗，去離子水沖洗后，濾紙吸干表面浮水，稱鮮重（Wf），浸入蒸餾水中10 h，取出，吸干表面浮水，稱飽和鮮重（Wt），置烘箱105 ℃殺青15 min，80 ℃恒溫烘至恒重，稱干重（Wd），計算相對含水量（RWC）。RWC（%）=（Wf-Wd）÷（Wt-Wd）×100%。

2.2.3 膜脂過氧化相關(guān)指標(biāo)

①細(xì)胞膜透性：采用電導(dǎo)儀測定。細(xì)胞膜透性（%）=L1/L2×100%。式中，L1為各處理葉片殺死前外滲液的電導(dǎo)值，L2為各處理葉片殺死后外滲液的電導(dǎo)值。②超氧陰離子產(chǎn)生速率：采用羥胺氧化法測定。取0.2 g植物材料，加入0.05 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.8）1.0 mL于冰浴研磨，12 000 r/min離心15 min，取上清液0.5 mL，加入磷酸緩沖液0.5 mL和10 mmol/L鹽酸羥胺1 mL，25 ℃靜置1 h，加入17 mmol/L對氨基苯磺酸1 mL和7 mmol/L α-萘胺1 mL，25 ℃靜置20 min，測其530 nm波長處吸光度（OD值），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算，以nmol/（min·g）表示。③丙二醛：采用硫代巴比妥酸法。取0.5 g樣品，加入2 mL預(yù)冷的0.05 mol/L pH 7.8磷酸緩沖液，加入少量石英砂，在經(jīng)過冰浴的研缽內(nèi)研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到5 mL刻度離心試管，將研缽用緩沖液洗凈，清洗液移入離心管中，最后用緩沖液定容至5 mL。在4500 r/min離心10 min。吸取2 mL上清液于刻度試管中，加入含0.5%硫代巴比妥酸的5%三氯乙酸溶液3 mL，于沸水浴上加熱10 min，迅速冷卻，4500 r/min離心10 min，取上清液，以蒸餾水為對照，于532、600 nm波長處測定吸光度，以?mol/g表示。

2.2.4 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量

①脯氨酸：采用酸性茚三酮法，以?g/g表示；②可溶性蛋白：采用考馬斯亮藍(lán)G-250法，以?g/g表示；③可溶性糖：采用蒽酮比色法，以?g/g表示。

2.2.5 抗氧化酶活性

①超氧化物歧化酶（SOD）活性：采用氮藍(lán)四唑（NBT）光化還原法，以A560條件下抑制NBT光化還原50%的酶用量為1個酶活性單位（U/g）；②過氧化物酶（POD）活性：采用愈創(chuàng)木酚法，以每分鐘內(nèi)A470變化0.01為1個酶活性單位[U/（g·min）]；③過氧化氫酶（CAT）活性：采用紫外吸收法，以每分鐘A240變化0.01為1個酶活性單位[U/（g·min）]。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Excel 2007和SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)用—x±s表示，采用新復(fù)極差法進(jìn)行處理間的比較。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 干旱脅迫對黨參葉綠素含量的影響

在持續(xù)控水條件下，干旱對黨參葉綠素產(chǎn)生顯著影響，隨干旱脅迫增強(qiáng)呈降低趨勢。輕度脅迫下，葉綠素a、葉綠素a/b值和葉綠素總含量與CK比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；中度、重度脅迫下，葉綠素a較CK分別下降17.2%、27.7%（P<0.05），葉綠素總含量較CK分別下降13.7%、20.0%（P<0.05）；各干旱處理下葉綠素b含量與CK比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見表2。

3.2 干旱脅迫對黨參葉片相對含水量的影響

葉片水分是維持植物體正常生理作用的基礎(chǔ)。成藥期黨參葉片相對含水量隨干旱脅迫程度的增加呈下降趨勢，輕度、中度、重度脅迫分別較CK降低7.3%、7.3%、21.25%，僅重度脅迫與CK比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見圖1。

3.3 干旱脅迫對黨參葉片細(xì)胞膜透性的影響

干旱脅迫下，植物體細(xì)胞膜受到損傷，細(xì)胞膜透性增加，細(xì)胞內(nèi)含物外滲，電導(dǎo)率增大。細(xì)胞膜透性的大小可以用相對電導(dǎo)率來衡量，其值越大，表明電解質(zhì)的滲漏量越多，細(xì)胞膜受傷害程度越重。在持續(xù)控水條件下，輕度脅迫的細(xì)胞膜透性較CK增加4.5%，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），中度脅迫較CK增加14.2%（P<0.05），而重度脅迫下的細(xì)胞膜透性略低于CK。結(jié)果見圖2。

3.4 干旱脅迫對黨參葉片超氧陰離子產(chǎn)生速率和丙二醛含量的影響

在持續(xù)控水條件下，黨參葉片超氧陰離子產(chǎn)生速率隨干旱程度的增強(qiáng)呈先增加后降低的變化趨勢（見圖3），輕度、中度、重度脅迫黨參超氧陰離子產(chǎn)生速率分別較CK升高16.5%、10.4%、11.3%（P<0.05），3個干旱脅迫處理間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；黨參葉片MDA含量隨干旱脅迫程度增強(qiáng)呈先增加后降低再增加的變化趨勢（見圖4），重度脅迫MDA含量較CK增加25.8%（P<0.05），輕度、中度脅迫與CK比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

3.5 干旱脅迫對黨參滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

在遇到逆境條件時，植物會通過增加體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量來維持滲透壓，避免細(xì)胞受到傷害。脯氨酸是重要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。輕度和重度干旱脅迫黨參脯氨酸含量均低于CK，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；中度干旱脅迫較CK增加20.7%（P<0.05）。此結(jié)果與細(xì)胞膜透性的變化趨勢一致?？扇苄蕴请S干旱程度增加呈降低趨勢，可溶性蛋白無明顯變化。從3種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的總積累量分析（依次為52.98、51.94、58.27、47.04 ?g/g），中度脅迫顯著高于CK，輕度脅迫與CK間無明顯差異，重度脅迫顯著低于CK。結(jié)果見圖5。

3.6 干旱脅迫對黨參抗氧化酶活性的影響

通過測定持續(xù)控水后黨參葉片抗氧化酶活性可知，隨干旱脅迫程度增加，POD、CAT和SOD活性均呈不同程度的增加趨勢（見圖6～圖8）。輕度、中度脅迫黨參葉片POD活性與CK無明顯差異，重度脅迫較CK增加19.2%（P<0.05）；輕度、中度、重度脅迫黨參葉片CAT活性分別較CK增加14.4%、19.3%、38.5%（P<0.05），輕度和中度脅迫無明顯差異；各處理間SOD活性無明顯差異。

4 討論

干旱通常會引起植物水分虧缺，進(jìn)而延緩、停止或破壞植物的正常生長[8]，并通過抑制葉片伸展等使光合作用受到抑制，進(jìn)一步影響植物的生長發(fā)育[9]。

干旱使核糖體的形成受到影響，從而抑制了葉綠體層中捕光Chla/b-Pro復(fù)合體的合成，阻礙了葉綠素積累，且葉綠素a對活性氧的反應(yīng)較葉綠素b敏感，其破壞程度往往大于葉綠素b，導(dǎo)致葉綠素總含量和葉綠素a/b比值下降，其下降程度與抗旱性呈極顯著負(fù)相關(guān)[10]。本研究結(jié)果顯示，隨著干旱程度的加重，黨參葉綠素a、a/b值和總含量均下降，但降幅較小，且輕度干旱脅迫并未阻礙黨參葉綠素合成，說明黨參的耐旱性較強(qiáng)。

植物相對含水量常被用來衡量干旱脅迫程度。已有研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫后，大麗花和杠柳等種子植物的葉片相對含水量仍在60%以上[11-12]，金釵石斛在75%以上[6]，細(xì)葉小羽蘚在8.36%[3]，表明不同植物抵御干旱脅迫的能力不同。本研究結(jié)果顯示，黨參葉片相對含水量隨干旱程度的增加而降低，但仍可維持在67.9%以上，尤其是在輕度和中度干旱脅迫下，黨參葉片相對含水量穩(wěn)定在CK水平左右，以維持正常的生理代謝。說明黨參與抗旱植物杠柳、金釵石斛等相似，具有較強(qiáng)的抗旱性。

細(xì)胞膜透性反映膜的穩(wěn)定性。MDA具有很強(qiáng)的毒性，膜質(zhì)過氧化程度可用MDA含量表示，作為植物受脅迫傷害程度的重要指標(biāo)。本試驗結(jié)果表明，輕度脅迫下黨參葉片細(xì)胞膜透性和MDA含量均維持在較低水平；中度脅迫時，膜透性顯著增加，而MDA含量有所下降；重度脅迫下，MDA含量開始增加，但與韃靼忍冬（MDA增加32%以上）[7]相比，黨參葉片MDA含量增幅較小，說明黨參耐旱性較強(qiáng)。本研究結(jié)果還顯示，干旱脅迫下黨參葉片超氧陰離子產(chǎn)生速率先降低后增加，且輕度、中度和重度脅迫的超氧陰離子產(chǎn)生速率在0.128～0.134 ?mol/（min·g）范圍內(nèi)，說明黨參具有較強(qiáng)的耐旱性。

滲透調(diào)節(jié)是植物響應(yīng)水分脅迫的一個重要生理保護(hù)機(jī)制，脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白作為重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在干旱脅迫下大量增加是植物的第一生理反應(yīng)[13]。干旱條件下滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累有助于細(xì)胞原生質(zhì)與環(huán)境滲透平衡，防止水分散失，緩解逆境對植物的危害[14]。本研究結(jié)果表明，輕度脅迫下，黨參葉片脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量均無明顯變化，說明輕度干旱脅迫未對黨參細(xì)胞構(gòu)成危害；中度脅迫下，脯氨酸含量顯著增加，可溶性糖和可溶性蛋白無明顯變化，說明脯氨酸是黨參響應(yīng)干旱的首要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，這與對甘草[15]、銀柴胡[2]的研究結(jié)果一致；重度脅迫下，脯氨酸含量有所下降，這與對細(xì)葉小羽蘚[3]、蒲公英[4]的研究結(jié)果一致。因此，黨參在遇到干旱脅迫時，首先積累脯氨酸含量維持細(xì)胞滲透壓，但重度干旱脅迫下黨參脯氨酸含量降低是否與體內(nèi)代謝紊亂有關(guān)，還有待進(jìn)一步研究。

植物在長期進(jìn)化過程中，為了抵御各種逆境條件，最大限度減少對自身的傷害，形成了各種保護(hù)機(jī)制。SOD、POD、CAT三者協(xié)同作用，防御活性氧或其他過氧化自由基對細(xì)胞膜系統(tǒng)的傷害[16]。本研究結(jié)果表明，隨著干旱脅迫程度的增加，CAT和POD活性呈增加趨勢，說明黨參在干旱脅迫條件下，可以通過增加抗氧化酶活性，迅速清除體內(nèi)膜脂過氧化產(chǎn)生的活性氧自由基和MDA，增強(qiáng)抗性。這與對蒲公英的研究結(jié)果[4]一致。

綜上所述，在輕度干旱脅迫下，黨參各生理指標(biāo)均處于正常水平，說明黨參具有耐旱性；在中度和重度干旱脅迫下，黨參體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和抗氧化酶活性迅速增加，說明黨參具有較強(qiáng)的抗旱能力。因此，從黨參生理特性變化的角度考慮，農(nóng)耕時期降雨量≥320 mm的干旱地區(qū)均可進(jìn)行黨參規(guī)范化種植。

參考文獻(xiàn)：

[1] 吳文芳，李隆云.藥用植物抗旱研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011， 39（24）：14647-14648，14707.

[2] 郎多勇，崔佳佳，周達(dá)，等.干旱脅迫對銀柴胡生長及生理生化特性的影響[J].中國中藥雜志，2014，39（11）：1995-1999.

[3] 陳文佳，張楠，杭璐璐，等.干旱脅迫與復(fù)水過程中遮光對細(xì)葉小羽蘚的生理生化影響[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2013，24（1）：57-62.

[4] 吳嘉雯，王慶亞.干旱脅迫對野生和栽培蒲公英抗性生理生化指標(biāo)的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2010，26（2）：264-271.

[5] 吳顯芝，乙引.干旱脅迫對金釵石斛幼苗生理生化的影響[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34（1）：18-20.

[6] 姚正陽，張秋良.干旱脅迫對韃靼忍冬生理生化指標(biāo)的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（11）：5199-5200，5203.

[7] 王惠珍，連中學(xué)，陸國弟，等.黨參種苗等級與藥材產(chǎn)量及質(zhì)量的關(guān)系[J].中國中藥雜志，2016，41（21）：3950-3955.

[8] 謝志玉，張文輝，劉新成.干旱脅迫對文冠果幼苗生長和生理生化特征的影響[J].西北植物學(xué)報，2010，30（5）：948-954.

[9] 尹麗，胡庭興，劉永安，等.干旱脅迫對不同施氮水平麻瘋樹幼苗光合特性及生長的影響[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2010，21（3）：569-576.

[10] 周海軍，顧洪如，沈益新，等.干旱脅迫下兩種鈍葉草的生長和生理響應(yīng)差異[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2008，24（6）：805-809.

[11] 范蘇魯，苑兆和，馮立娟，等.干旱脅迫對大麗花生理生化指標(biāo)的影響[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2011，22（3）：651-657.

[12] 安玉艷，郝文芳，龔春梅，等.干旱-復(fù)水處理對杠柳幼苗光合作用及活性氧代謝的影響[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2010，21（12）：3047-3055.

[13] XUE L L， ANJUM S A， WANG L G， et al. Influence of straw mulch on yield， chlorophyll contents， lipid peroxidation and antioxidant enzymes activities of soybean under drought stress[J]. J Food Agric Environ，2011，9（2）：694.

[14] ANJUM S A， XIE X Y， WANG L C， et al. Morphological， physiological and biochemical responses of plants to drought stress[J]. Afr J Agric Res，2011，6（9）：2062.

[15] 李明，王根軒.干旱脅迫對甘草幼苗保護(hù)酶活性及脂質(zhì)過氧化作用的影響[J].生態(tài)學(xué)報，2002，22（4）：503-507.

[16] NEELAM M， AJAY K G. Effect of salt stress on proline metabolism in two high yidlding genotypes of green gram[J]. Plant Sci， 2005，169：331.

（收稿日期：2017-05-04）

（修回日期：2017-05-23；編輯：陳靜）