溫針灸對神經(jīng)痛大鼠脊髓白細胞介素—6及細胞信號轉(zhuǎn)導抑制因子3的影響

俞向梅　楊意州　劉建波　李長征　龔德貴　王志福

摘要：目的 觀察溫針灸對神經(jīng)痛大鼠脊髓白細胞介素-6（IL-6）、細胞信號轉(zhuǎn)導抑制因子3（SOCS3）的影響，探討其治療神經(jīng)痛的作用機制。方法 實驗大鼠隨機分為正常組、模型組、溫針組、IL-6組，每組6只。模型組建立坐骨神經(jīng)慢性限制性損傷神經(jīng)痛模型，不干預；溫針組造模成功第5日后，選取“脾俞”“腎俞”溫針灸治療，共10次；IL-6組造模成功第5日起，脊髓鞘內(nèi)注射重組IL-6，共3次。電子觸覺測量機械痛行為學，ELISA和RT-PCR檢測脊髓IL-6、SOCS3 mRNA及小膠質(zhì)細胞活化標記物Iba-1的表達。結(jié)果 與模型組比較，溫針組機械痛閾值明顯升高（P<0.01），Iba-1含量明顯降低（P<0.01），脊髓背角IL-6 mRNA表達明顯降低（P<0.01），SOCS3 mRNA表達明顯升高（P<0.01）。結(jié)論 溫針灸能減輕神經(jīng)痛大鼠痛敏反應，其機制可能與抑制脊髓小膠質(zhì)細胞活化、下調(diào)IL-6表達和上調(diào)SOCS3表達有關。

關鍵詞：神經(jīng)病理性疼痛；溫針灸；脊髓；白細胞介素-6；細胞信號轉(zhuǎn)導抑制因子3；神經(jīng)炎癥；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.03.014

中圖分類號：R245 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）03-0064-04

Abstract： Objective To observe effects of warming acupuncture therapy on expressions of IL-6 and SOCS3 in spinal cord in rats with neuropathic pain； To discuss its mechanism for treating neuropathic pain. Methods Experimental rats were randomly divided into： normal group， model group， warming acupuncture and IL-6 group， with 6 rats in each group. Sciatic nerve chronic constriction injury neuralgia model was established in the model group， without intervention. After modeling for 5 days in the warming acupuncture group， “Pishu” and “Shenshu” acupoints were chosen for warming acupuncture therapy for 10 times. After modeling for 5 days in the IL-6 group， IL-6 group was successfully intrathecally injected 3 times with recombinant IL-6. After finishing all experiments， the mechanical pain behavior was measured with electronic Frye fibers. The mRNA levels of IL-6 and SOCS3 and protein concentration of spinal Iba-1were detected with ELISA and RT-PCR analysis. Results Compared with model group， mechanical withdrawal thresholdsin the warm acupuncture group significantly increased， and the content of Iba-1 decreased significantly （P<0.01）； The mRNA level of IL-6 decreased significantly （P<0.01）， and the mRNA level of SOCS3 significantly increased （P<0.01）. Conclusion Warming acupuncture therapy can reduce the pain response in rats with neuropathic pain through inhibiting spinal cord microglial activation， down-regulating the gene expression of lL-6 and up-regulating the gene expression of SOCS3.

Keywords： neuropathic pain； warming acupuncture therapy； spinal cord； IL-6； SOCS3； nerve inflammation； rats

神經(jīng)病理性疼痛（簡稱“神經(jīng)痛”），是由軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或相關疾病而造成的疼痛。按國際上神經(jīng)痛發(fā)病率約8%推算，中國約有0.9億神經(jīng)痛患者。有研究顯示，溫針灸脾俞、腎俞有健脾益腎、活血化瘀的功效，對各種神經(jīng)痛具有明顯的鎮(zhèn)痛作用[1-3]。本課題組前期研究表明，神經(jīng)痛發(fā)生時，脊髓中樞出現(xiàn)明顯的神經(jīng)炎癥現(xiàn)象，且與脊髓白細胞介素（IL）-6、細胞信號轉(zhuǎn)導抑制因子3（SOCS3）表達存在密切聯(lián)系[4-5]。本實驗觀察溫針灸對神經(jīng)痛大鼠機械痛敏反應及IL-6、SOCS3表達的影響，探討其治療神經(jīng)痛的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠24只，5～6周齡，體質(zhì)量200～220 g，上海斯萊克實驗動物責任有限公司，動物許可證號SCXK（滬）2012-0002。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學SPF級實驗動物中心，分籠適應性喂養(yǎng)1周，將大鼠稱重并編號。所有實驗均遵照國際動物保護和使用指南的規(guī)定實施。

1.2 主要試劑與儀器

4-0鉻制羊腸線，上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品股份有限公司；華佗牌一次性針灸針（0.28 mm×15 mm）、清艾條，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司；Recombinant Rat IL-6（貨號400-06），美國PeproTech（派普泰克）公司；IL-6、SOCS3、GAPDH引物，生工生物工程（上海）股份有限公司合成。IQ5多重實時熒光定量PCR儀器，美國Bio-Rad公司；38450-電子觸覺測量儀（電子Von Frey），意大利Ugo Basile公司。

1.3 分組及造模

采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為正常組、模型組、溫針組和IL-6組，每組6只。模型組建立坐骨神經(jīng)慢性限制性損傷（CCI）神經(jīng)痛模型，不干預；溫針組造模成功第5日起，選取“脾俞”“腎俞”溫針灸治療，每日1次，共10次；IL-6組造模成功第5日起，脊髓鞘內(nèi)注射重組IL-6，共3次。參考文獻[4-5]方法制作CCI神經(jīng)痛模型。大鼠腹腔注射10%水合氯醛（4 mL/kg）麻醉，右側(cè)后肢皮膚切開，肌肉鈍性分離，暴露坐骨神經(jīng)，在坐骨神經(jīng)中段用4-0鉻制羊腸線松扎四道，致CCI神經(jīng)痛大鼠模型，術(shù)后用青霉素粉末預防感染。模型建立后，術(shù)后第5、14日觀察實驗大鼠機械痛行為學變化。

1.4 溫針灸干預

針灸穴位參照大鼠穴位圖譜[6]，取雙側(cè)“脾俞”（大鼠第12胸椎旁開7 mm）、雙側(cè)“腎俞”（大鼠第2腰椎旁開7 mm）溫針灸治療。安靜環(huán)境、室溫（20±2）℃，將大鼠軀干固定于木架上，頭部與四肢可自由活動，靜置20 min，將一次性針灸針刺入穴位，針刺后在針尾上搓捏少許艾絨點燃施灸，只待燃盡，除去灰燼，留針30 min后取針。正常組自由飲食活動，不進行任何干預。

1.5 鞘內(nèi)注射白細胞介素-6

大鼠取俯臥位，實驗者食指定位于大鼠脊柱L5-6間隙，右手持微量注射器從間隙垂直緩慢進針，以大鼠尾巴出現(xiàn)顫動或突然的側(cè)向甩動作為穿刺成功的標志，注入相應藥物。在第5、10、14日，鞘內(nèi)注射20 ng/μL重組IL-6溶液，10 μL/次。

1.6 觀察指標

1.6.1 機械痛行為測試

測試環(huán)境為10 cm×20 cm×20 cm有機玻璃籠，將大鼠放入籠內(nèi)靜置10 min，采用電子Von Frey法進行檢測，即利用不同強度的纖毛刺激大鼠足掌中心部位，引起大鼠縮爪反應。最小能引起縮爪反應的纖毛壓力即為大鼠的縮爪反應閾值（g），以此反應大致的機械痛敏情況。

1.6.2 脊髓小膠質(zhì)細胞標記物Iba-1、白細胞介素-6、細胞信號轉(zhuǎn)導抑制因子3檢測

第14日全部實驗結(jié)束后，迅速新鮮取材脊髓（L4-5節(jié)段）背角置于液氮中，-80 ℃冰箱保存待測。

ELISA檢測脊髓小膠質(zhì)細胞標記物Iba-1表達。①取脊髓背角組織勻漿離心，提取上清液；②96孔酶標板上加樣，每孔加入標準品或待測樣品100 μL，將反應板混勻后置37 ℃ 40 min；③用洗滌液將反應板洗滌4～6次，濾紙上印干；④每孔加入蒸餾水和第一抗體工作液各50 μL（空白除外）。將反應板混勻后置37 ℃ 20 min；⑤按步驟③再次洗板；⑥每孔加酶標抗體工作液100 μL。將反應板置37 ℃ 10 min，如前步驟再次洗板；⑦每孔加入底物工作液100 μL，置37 ℃暗處反應15 min；⑧每孔加入100 μL終止液混勻，30 min內(nèi)于酶標儀450 nm處測吸光度，畫出標準曲線，根據(jù)樣品OD值計算出相應Iba-1含量。

RT-PCR檢測脊髓SOCS3、IL-6 mRNA表達。組織總RNA提取：冰浴取出新鮮脊髓背角組織，每50～100 mg組織加1 mL Trizol試劑，冰浴超聲勻漿15～20 s；每1 mL Trizol試劑加0.2 mL氯仿，快速震蕩15 s，冰浴5 min，4 ℃、12 000×g離心15 min；加與水等體積預冷的異丙醇，緩慢混勻，冰浴15 min，4 ℃、12 000×g離心10 min，棄上清，吸干異丙醇；加75%乙醇，重懸沉淀，4 ℃、7500×g離心8 min，棄上清，消毒濾紙上吸干乙醇；重復以上步驟，傾去乙醇，空氣干燥；干燥后將沉淀溶于DEPC水，置70 ℃貯存，沉淀加乙醇于20 ℃可長期貯存；取4 μL總RNA溶液稀釋至1 mL，紫外分光光度計檢測OD260和OD280值，測定其濃度和純度。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈：PCR管中依次加入Total RNA、Oligo（dT）15 primer、DEPC H2O（Rnase-free），70 ℃變性5 min，冰浴5 min；隨后加入5×M-MLV Reaction buffer、10 mmol/L dNTPs、RNase inhibitor、M-MLV Reverse Transcriptase、DEPC H2O，37 ℃水浴60 min，95 ℃水浴5 min， 冰浴5 min。PCR擴增：PCR管依次加入2×Taq PCR Master Mix、Sense primer、Antisense primer、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、dd H2O，混勻，瞬時離心。94 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s，57 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，72 ℃ 10 min；實時熒光定量PCR儀進行樣本分析。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示，符合正態(tài)分布用方差分析，不符合正態(tài)分布用秩和檢驗中獨立樣本比較。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 溫針灸對模型大鼠機械痛行為的影響

與正常組比較，模型組大鼠造模后第5、14日，機械痛閾值明顯降低（P<0.01）；造模后第14日與模型組比較，溫針組大鼠機械痛閾值明顯升高（P<0.01），IL-6組大鼠機械痛閾值明顯降低（P<0.01）。結(jié)果見圖1。

2.2 溫針灸對模型大鼠脊髓小膠質(zhì)細胞標記物Iba-1的影響

術(shù)后第14日，與正常組比較，模型組大鼠脊髓Iba-1含量顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，溫針組大鼠脊髓Iba-1含量顯著降低（P<0.01），IL-6組大鼠脊髓Iba-1含量顯著升高（P<0.01）。結(jié)果見圖2。

2.3 溫針灸對模型大鼠脊髓白細胞介素-6、細胞信號轉(zhuǎn)導抑制因子3 mRNA表達的影響

術(shù)后第14日，與正常組比較，模型組大鼠脊髓IL-6、SOCS3 mRNA表達顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，溫針組大鼠脊髓IL-6 mRNA表達顯著降低，SOCS3 mRNA表達顯著升高（P<0.01），IL-6組大鼠脊髓IL-6 mRNA表達顯著升高（P<0.01），SOCS3 mRNA表達顯著降低（P<0.01）。結(jié)果見圖3。

3 討論

神經(jīng)痛可歸屬中醫(yī)學“痹證”范疇。灸法是一種溫熱刺激，有溫經(jīng)散寒、扶陽固脫、活血化瘀的功效，正如《靈樞·官能》“針所不為，灸之所宜”。腎俞為腎的背俞穴，具有疏經(jīng)益氣、補腎益精作用；脾俞為脾之背俞穴，具有健脾益氣通絡作用。大鼠脾俞、腎俞解剖深層鄰近腎上腺免疫器官，針灸腎上腺鄰近背俞穴（脾俞、腎俞），刺激相應節(jié)段交感神經(jīng)纖維，可影響神經(jīng)遞質(zhì)或激素釋放，調(diào)節(jié)機體免疫功能。

在神經(jīng)痛的發(fā)生及發(fā)展中，外周神經(jīng)損傷刺激達一定閾值時，脊髓膠質(zhì)細胞激活可釋放炎性因子（IL-6、IL-1β等），參與維持脊髓中樞敏化狀態(tài)，并出現(xiàn)“神經(jīng)炎癥”現(xiàn)象[7-8]。SOCS3作為SOCS家族蛋白中的重要一員，在周圍神經(jīng)損傷及神經(jīng)炎癥中發(fā)揮重要的作用；坐骨神經(jīng)損傷SOCS3表達不斷升高，抑制周圍神經(jīng)巨噬細胞的聚集；IL-6作為多功能細胞因子，參與炎癥及神經(jīng)痛的發(fā)生發(fā)展過程[9-10]。SOCS3作為IL-6信號通路的首要抑制劑，可通過結(jié)合IL-6受體亞基gp130或JAKs蛋白，從而抑制炎癥反應[11-12]。有研究顯示，神經(jīng)痛發(fā)生時，CCI大鼠脊髓小膠質(zhì)細胞顯著激活，脊髓IL-6表達顯著上調(diào)，應用小膠質(zhì)細胞抑制劑米諾環(huán)素可顯著抑制IL-6表達，減輕機械痛覺過敏[13]。此外，小膠質(zhì)細胞高表達SOCS3蛋白可抑制JAK/STAT3信號通路，降低IL-6表達，減輕神經(jīng)炎癥反應[14]。

前期研究表明，在CCI大鼠中，SOCS3存在于小膠質(zhì)細胞中，電針可抑制脊髓膠質(zhì)細胞活化，并進一步上調(diào)膠質(zhì)細胞中SOCS3表達水平，并反饋性抑制IL-6細胞因子釋放，發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用[5]。本實驗結(jié)果也顯示，神經(jīng)痛發(fā)生時，脊髓小膠質(zhì)細胞顯著激活，脊髓IL-6表達顯著上調(diào)，鞘內(nèi)注射IL-6可降低SOCS3 mRNA表達，進一步加劇痛敏反應；溫針灸效果類似電針，可顯著抑制脊髓小膠質(zhì)細胞的活化，上調(diào)脊髓SOCS3 mRNA表達，降低脊髓IL-6釋放，從而減輕機械痛敏反應。

綜上所述，溫針灸“脾俞”“腎俞”能減輕CCI大鼠機械痛敏化反應，可能與降低脊髓神經(jīng)炎癥、促進脊髓SOCS3表達有關，但其具體作用機制有待于今后深入研究。

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（收稿日期：2017-09-22）

（修回日期：2017-10-25；編輯：華強）