杜仲皮、杜仲雄花醇提取物對模型小鼠氣道變應性炎癥的影響

王健英　陳曉俊　張磊　王凱　侯劍偉　符勝光　潘穎宜　袁穎

摘要：目的 觀察杜仲皮、杜仲雄花醇提物對雞卵清蛋白（OVA）所致小鼠氣道變應性炎癥的影響，探討其作用機制。方法 實驗第0、7日，OVA腹腔注射致敏，繼而滴鼻激發(fā)21 d，建立小鼠氣道變應性炎癥模型。實驗小鼠隨機分為正常組、模型組、杜仲皮醇提物組（杜仲皮組）、杜仲雄花醇提物組（杜仲雄花組）和地塞米松組，各給藥組給予相應藥物灌胃。肺組織行HE、PAS染色，觀察支氣管及周圍肺組織病理改變，ELISA檢測小鼠血清OVA-IgE、白細胞介素（IL）-4、干擾素-γ（IFN-γ）、IL-13水平，免疫組化檢測小鼠肺組織細胞間黏附分子-1（ICAM-1）、血管內皮生長因子（VEGF）、基質金屬蛋白酶9（MMP9）、組織金屬蛋白酶抑制劑1（TIMP1）表達，流式細胞術檢測小鼠外周血Th17+細胞表達，RT-PCR檢測小鼠肺組織腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-6 mRNA表達。結果 模型組小鼠肺組織可見嗜酸性粒細胞及其他炎癥細胞浸潤，支氣管痙攣，黏液分泌增加，杜仲皮組和杜仲雄花組小鼠肺組織病理明顯改善。與正常組比較，模型組小鼠血清OVA-IgE、IL-4、IL-13水平升高，IFN-γ水平降低（P<0.05，P<0.01），肺組織ICAM-1、VEGF、MMP9表達增強，TIMP1表達降低（P<0.01），外周血IL-17+細胞增加，肺組織TNF-α、IL-6 mRNA表達均升高（P<0.01）；與模型組比較，杜仲皮組和杜仲雄花組小鼠血清OVA-IgE、IL-4、IL-13水平明顯下調（P<0.01），ICAM-1、VEGF表達明顯下調（P<0.05，P<0.01），TIMP1表達升高，外周血IL-17+細胞降低，肺組織IL-6 mRNA表達降低（P<0.05，P<0.01），杜仲皮組還可誘導IFN-γ分泌（P<0.01），下調TNF-α mRNA表達（P<0.05），杜仲雄花組MMP9表達明顯下調（P<0.05）。結論 杜仲皮、杜仲雄花醇提物可能通過降低模型小鼠OVA-IgE產生，抑制Th2類細胞因子分泌，下調Th17細胞，抑制促炎細胞因子表達，對氣道變應性炎癥有一定抑制作用。

關鍵詞：杜仲皮；杜仲雄花；氣道變應性炎癥；細胞因子；黏附分子；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.03.010

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）03-0042-06

Abstract： Objective To investigate the effects of alcohol extract of bark and male flower of Eucommia ulmoides Oliv. on airway allergic inflammation induced by chicken ovalbumin （OVA） in mice； To explore its mechanism of action. Methods On day 0， day 7， mice were intraperitoneally injected OVA for sensitization， followed by nasal stimulation for 21 days to establish airway allergic inflammation mice models. The mice were divided into normal group， model group， alcohol extract of bark of Eucommia ulmoides Oliv. group， alcohol extract of male flower of Eucommia ulmoides Oliv. group， and Dexamethasone group. Each medication group was given relevant medicine for gavage. The lung tissue was embedded in HE and PAS dyeing， to observe the pathological changes of bronchus and

surrounding lung. The levels of serum OVA-IgE， IL-4， IFN-γ and IL-13 were measured by ELISA. The expression of ICAM-1， VEGF， MMP9 and TIMP1 were detected by immunohistochemistry. Flow cytometry was used to detect the expression of Th17 cells in peripheral blood. The expressions of TNF-α and IL-6 mRNA in lung tissue were detected by RT-PCR. Results The model group showed changes of airway allergic inflammatory such as eosinophils and other inflammatory cell infiltration， bronchial spasm， and mucus secretion. Lung histopathology in alcohol extract of bark and male flower of Eucommia ulmoides Oliv. groups was improved significantly （P<0.05）. Compared with the normal group， the levels of serum OVA-IgE， IL-4 and IL-13 increased in model group， while the level of IFN-γ decreased （P<0.05， P<0.01）. The expressions of ICAM-1， VEGF and MMP9 increased， while the expression of TIMP1 decreased （P<0.01）； peripheral blood IL-17+cells increased （P<0.01）； the expressions of TNF-α and IL-6 mRNA increased. Compared with the model group， the levels of serum OVA-IgE， IL-4 and IL-13 decreased in alcohol extract of bark and male flower of Eucommia ulmoides Oliv. groups （P<0.05， P<0.01）； the expressions of ICAM-1 and VEGF decreased （P<0.05， P<0.01）； the expression of TIMP1 increased. Alcohol extract of bark and male flower of Eucommia ulmoides Oliv. could down-regulate IL-17+cells， reduce the expression of IL-6 mRNA （P<0.05， P<0.01）. Alcohol extract of bark of Eucommia ulmoides Oliv. group could induce the secretion of IFN-γ （P<0.01）， and down-regulate the expression of TNF-α mRNA （P<0.05）. Alcohol extract of male flower of Eucommia ulmoides Oliv. group could significantly down-regulate the expression of MMP9 （P<0.05）. Conclusion Alcohol extract of bark and male flower of Eucommia ulmoides Oliv. can induce the production of OVA-IgE， inhibit secretion of Th2 cytokines， inhibit the expression of adhesion molecules， depress Th17 cells， so as to inhibit the airway allergic inflammation.

Keywords： bark of Eucommia ulmoides Oliv.； male flower of Eucommia ulmoides Oliv.； airway allergic inflammation； cytokines； adhesion molecules； mice

杜仲Eucommia ulmoides Oliv.屬杜仲科植物，是我國特有植物，杜仲傳統(tǒng)藥用部位為樹皮，具有補肝腎、強筋骨的功效，用于肝腎不足之腰膝酸痛、筋骨無力。杜仲雄花目前多作為花茶應用，有研究顯示，其具有良好的鎮(zhèn)靜催眠及抗氧化、抑菌作用[1-2]。前期研究表明，杜仲皮、杜仲雄花均有一定的抗炎、調節(jié)免疫、鎮(zhèn)痛、抑菌等作用[3]。氣道變應性炎癥反應屬于Ⅰ型變態(tài)反應，臨床主要表現(xiàn)為變應性鼻炎和支氣管哮喘。本研究觀察杜仲皮、杜仲雄花對雞卵清蛋白（OVA）所致小鼠氣道變應性炎癥模型的影響，探討其作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

雄性Balb/c小鼠50只，SPF級，6周齡，體質量（20±2）g，上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，動物合格證號SCXK（滬）2013-0016。分籠飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學動物實驗中心SPF級動物實驗室。

1.2 藥物及制備

杜仲皮購自上?？禈蝻嬈瑥S，批號201601103，杜仲雄花購自湖北張家界，經上海中醫(yī)藥大學生藥教研室吳靳榮副教授鑒定，實驗所用樣品分別為杜仲科植物杜仲的干燥皮、雄花的干燥品。分別取杜仲皮、杜仲雄花各100 g。適當粉碎，加8倍量70%乙醇加熱回流提取，減壓濃縮后干燥備用。醋酸地塞米松片，天津力生制藥有限公司，0.75 mg/片，批號14011232。

1.3 主要試劑與儀器

OVA（V級），美國Sigma公司；氫氧化鋁凝膠，美國Sigma；ELISA試劑盒（即用型），美國Peprotech公司；一抗：細胞間黏附分子-1（ICAM-1）、血管內皮生長因子（VEGF），美國Abcam公司；基質金屬蛋白酶（MMP）9，美國Abcam公司；組織金屬蛋白酶抑制劑（TIMP1），美國Abcam公司；EnVision試劑（HRP/Rabbit）即用型，丹麥Dako公司；Anti-Mouse 白細胞介素（IL）-17A FITC，eBioscience；RT-PCR試劑盒，日本Takara Bio公司。Synergy HT多功能酶標儀，Biotek；全自動輪轉式石蠟切片機型號RM2265，Leica公司；顯微鏡DMM-300D，上海蔡康光學儀器有限公司；流式細胞儀，Becton Dickinson Facscalibour公司；Applied Biosystems?的PCR熱循環(huán)儀，美國ABI公司。

2 實驗方法

2.1 造模及分組

于實驗第0日，實驗小鼠分別腹腔注射200 μL 1%OVA+氫氧化鋁凝膠[100 μgOVA+100 μL Al（OH）3]。第7日加強免疫1次。隨機分為正常對照組、模型組、杜仲皮醇提物組（杜仲皮組）、杜仲雄花醇提物組（杜仲雄花組）、地塞米松組，每組10只。于實驗第14日開始，用微量移液器給小鼠滴鼻2%OVA生理鹽水溶液（200 μg OVA+100 μL生理鹽水）20 μL/只激發(fā)，隔日1次，連續(xù)21 d。

2.2 給藥

于實驗第14日開始，給藥組分別給予杜仲皮醇提物、杜仲雄花醇提物4 g原藥材/（kg·d）和醋酸地塞米松0.125 mg/（kg·d）藥液灌胃。給藥體積均為0.2 mL/次，每日1次，連續(xù)21 d。

2.3 取材

于實驗第36日，最后1次激發(fā)后24 h處理動物。摘眼球取血，部分外周血抗凝，其余部分靜置2 h后離心取血清，置-80 ℃冰箱保存，直至測定。脫頸處死小鼠。心臟生理鹽水灌洗后，取右肺組織立即置于液氮中冷凍，后轉移至-80 ℃冰箱保存，直至測定。取左肺組織，浸泡于10%中性甲醛中固定48 h，用于組織病理切片、免疫組化檢測。

2.4 肺組織病理觀察

取肺組織，經脫水、透明、浸蠟與包埋，將蠟塊常規(guī)切片、脫蠟，HE、PAS染色，中性樹脂膠封片，于200倍光鏡下觀察。

2.5 血清卵清蛋白特異性IgE、白細胞介素-4、干擾素-γ、白細胞介素-13含量檢測

取小鼠血清，ELISA測定血清OVA-IgE、IL-4、干擾素-γ（IFN-γ）、IL-13含量，按照試劑盒說明書進行操作。

2.6 免疫組化檢測肺組織細胞間黏附分子-1、血管內皮生長因子、基質金屬蛋白酶9和組織金屬蛋白酶抑制劑1表達

DAB顯色，以細胞質或細胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒作為陽性判定標準。400倍光鏡下每張切片隨機選取5個視野拍照，用Image-Pro Plus圖像分析軟件進行吸光度（OD值）及陽性面積分析。比較各組ICAM-1、VEGF、MMP9、TIMP1陽性表達的差異。計算目標蛋白表達指數(shù)[陽性區(qū)域面積（%）×OD值]。

2.7 流式細胞術檢測外周血白細胞介素-17+細胞的表達

取大鼠抗凝全血0.5 mL置于試管中，放入紅細胞裂解液1 mL，靜置10 min；1500 r/min離心2 min，棄上清液，PBS洗2遍，1500 r/min離心2 min，棄上清液，調細胞濃度為1×105；細胞固定液固定15 min，2500 r/min離心5 min，棄上清液混勻，再加破膜劑（1∶10）破膜20 min，2500 r/min離心5 min，混勻，再加IL-17AFTIC抗體，孵育30 min。流式細胞儀檢測。

2.8 RT-PCR檢測肺組織腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-6 mRNA表達

取肺組織100 mg放入去核酶試管內，加3 mL預冷Trizol液，超聲勻漿60 s，按Trizol說明書進行操作，選取RNA，檢測IL-6和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）RNA濃度。cDNA合成：5×PrimeScript RT Master Mix 2 μL，總RNA（250 ng/μL）2 μL，加RNase Free dH2O至總體積為10 μL，混合后37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s反轉錄，進行PCR擴增。引物序列見表1。反應體系總體積為20 μL：SYBR Premix Ex Taq 10 μL，PCR Forward Primer（10 μmol/L）0.4 μL，PCR Reverse Primer（10 μmol/L）0.4 μL，Template（<100 ng）2 μL，dH2O（sterile distilled water）7.2 μL。擴增條件：預變性95 ℃ 30 s，變性95 ℃ 5 s，退火及延伸60 ℃ 30 s，40 cycles。用相對定量2-ΔΔCT法計算各基因的相對表達量。

3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據以—x±s表示，組間比較用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

4 結果

4.1 肺組織病理變化

正常組支氣管及肺泡未見明顯異常，PAS染色陰性；模型組細支氣管高度痙攣，管腔狹窄，黏膜皺襞形成，支氣管上皮杯細胞化生，黏液分泌物增多，支氣管及血管周圍大量嗜酸性粒細胞及中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞浸潤，PAS染色可見支氣管壁大量陽性細胞；杜仲皮組細支氣管輕度痙攣，腔內少量黏液分泌物，支氣管及血管周圍嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞浸潤，PAS染色可見支氣管壁陽性細胞；杜仲雄花組細支氣管未見明顯痙攣，腔內未見分泌物，僅見支氣管及血管周圍少量嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞浸潤，PAS染色可見支氣管壁陽性細胞；地塞米松組細支氣管未見明顯痙攣，腔內無黏液分泌物，支氣管及血管周圍嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞浸潤，PAS染色可見支氣管壁陽性細胞。見圖1、圖2。

4.2 杜仲皮、杜仲雄花醇提物對模型小鼠血清卵清蛋白特異性IgE含量的影響

與正常組比較，模型組血清OVA-IgE水平明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，杜仲皮組、杜仲雄花組OVA-IgE水平均明顯降低（P<0.01）。見圖3。

4.3 杜仲皮、杜仲雄花醇提物對模型小鼠血清白細胞介素-4、干擾素-γ、白細胞介素-13水平的影響

與正常組比較，模型組血清IL-4、IL-13含量明顯升高，IFN-γ水平明顯降低（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，杜仲皮組、杜仲雄花組IL-4、IL-13含量明顯降低（P<0.05，P<0.01），杜仲皮組IFN-γ水平明顯升高（P<0.01）。見圖4。

4.4 杜仲皮、杜仲雄花醇提物對模型小鼠肺組織細胞間黏附分子-1、血管內皮生長因子水平的影響

與正常組比較，模型組肺組織ICAM-1、VEGF表達明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，杜仲皮組、杜仲雄花組ICAM-1、VEGF表達明顯降低（P<0.05，P<0.01）。見圖5。

4.5 杜仲皮、杜仲雄花醇提物對模型小鼠肺組織基質金屬蛋白酶9和金屬蛋白酶組織抑制劑1水平的影響

與正常組比較，模型組肺組織MMP9表達明顯升高，TIMP1表達明顯降低（P<0.01）；與模型組比較，杜仲雄花組MMP9表達明顯降低（P<0.05），杜仲皮組、杜仲雄花組TIMP1表達明顯升高（P<0.05，P<0.01）。見圖6。

4.6 杜仲皮、杜仲雄花醇提物對模型小鼠外周血淋巴細胞白細胞介素-17+細胞表達的影響

與正常組比較，模型組外周血淋巴細胞IL-17+細胞表達明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，杜仲皮組、杜仲雄花組IL-17+細胞表達明顯降低（P<0.05，P<0.01）。見圖7。

4.7 杜仲皮、杜仲雄花醇提物對模型小鼠肺組織腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-6 mRNA表達的影響

與正常組比較，模型組肺組織TNF-α、IL-6 mRNA表達明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，杜仲皮組、杜仲雄花組IL-6 mRNA表達明顯降低（P<0.01），杜仲皮組TNF-α mRNA表達明顯降低（P<0.05）。見圖8。

5 討論

杜仲主要成分有環(huán)烯醚萜類、杜仲膠、木脂素類及苯丙素類等化合物，其中木脂素類及環(huán)烯醚萜類所占比例較大，其次是黃酮類及其他類化合物。現(xiàn)代臨床多用于治療骨質疏松癥、骨關節(jié)炎、風濕及類風濕性關節(jié)炎等[4]。迄今杜仲對氣道變應性炎癥的作用鮮有研究，但有報道杜仲雄花可抑制IgE介導的小鼠皮炎模型，可抑制血清IgE、IL-4，上調IFN-γ[5]。杜仲為補肝腎之品，在肺腎兩虛型或腎陽虛型哮喘中亦有應用。前期研究發(fā)現(xiàn)，杜仲皮與杜仲雄花均表現(xiàn)出較明顯的抗炎作用。為探討杜仲對氣道變應性炎癥的作用，本研究應用OVA氫氧化鋁凝膠腹腔注射，OVA生理鹽水滴鼻激發(fā)，建立小鼠氣道變應性炎癥模型，給予杜仲皮、杜仲雄花醇提取物灌胃給藥，觀察肺組織病理改變，血清OVA-IgE水平，血清IL-4、IFN-γ、IL-13細胞因子水平，肺組織黏附分子ICAM-1、VEGF表達，肺組織基質金素蛋白酶MMP9、TIMP1表達。結果表明，杜仲皮、杜仲雄花醇提物均可改善氣道變應性炎癥，減輕支氣管上皮杯細胞化生，減少黏液分泌，減少支氣管及血管周圍嗜酸性粒細胞及中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞浸潤，減輕支氣管痙攣。杜仲皮、杜仲雄花醇提物均可抑制血清中OVA特異性IgE水平，表明對OVA致敏小鼠有抗過敏作用。氣道變應性炎癥存在著Th2類細胞因子過度表達，Th1/Th2失衡[6]。IL-13由Th2細胞產生，可誘導B細胞增殖和分化，促進IgE合成，活化嗜酸性粒細胞，延長嗜酸性粒細胞的存活，誘導氣道高反應性等，在哮喘發(fā)生中起重要的致病作用。炎癥滲出以及杯狀細胞肥大、增生及黏膜下黏液腺增生可致黏液分泌亢進。過多的黏液可以形成黏液栓，阻塞氣道。IL-4和IL-13可誘導黏液分泌[7]。杜仲皮、杜仲雄花醇提物可下調血清IL-4水平，杜仲皮醇提物可上調IFN-γ，杜仲皮、杜仲雄花醇提物可下調血清IL-13水平，對Th1/Th2細胞因子平衡有一定的調節(jié)作用。

ICAM-1是免疫球蛋白超家族成員之一，其與VEGF相互作用后可介導白細胞從血液循環(huán)中遷移到肺組織的炎癥部位，這在支氣管哮喘發(fā)病機制中起著重要作用[8-9]。二者與氣道血管生成與氣道重塑密切相關。杜仲皮、杜仲雄花醇提物均可抑制肺組織ICAM-1、VEGF表達。

MMPs具有影響細胞遷移、降解結構蛋白的能力，被認為在氣道重塑中起重要作用，MMP9是呼吸系統(tǒng)疾病中主要的MMP。TIMP1是MMP9的活性特異性抑制劑[10]。杜仲雄花醇提物可抑制肺組織MMP9表達，杜仲皮、杜仲雄花醇提物均可上調TIMP1表達，從而對MMP9活性有一定抑制作用。

Th17細胞分泌的IL-17A是強大的促炎細胞因子，其主要生物學功能是促進多種細胞釋放炎性因子（如IL-6、TNF-α、IL-8等）而導致炎性反應。Th17細胞作為促炎細胞可誘導哮喘、自身免疫病的發(fā)生[11]。本實驗模型組外周血淋巴細胞IL-17+細胞表達增加，肺組織IL-6、TNF-α mRNA表達上調，杜仲皮、杜仲雄花醇提物均可下調Th17細胞及IL-6 mRNA表達，杜仲皮醇提物能抑制TNF-α mRNA表達。

綜上所述，杜仲皮、杜仲雄花醇提物可能通過抑制Th2類細胞因子，調節(jié)Th1/Th2細胞因子平衡，下調Th17細胞，抑制炎癥因子聚集趨化及MMP活性，減少特異性IgE生成，減輕炎癥反應作用，從而改善肺組織病理，抑制氣道變應性炎癥。杜仲皮和杜仲雄花可能成為潛在的氣道變應性炎癥的治療藥物。后期還將進一步研究杜仲皮、杜仲雄花對氣道炎癥的作用機制，為杜仲的進一步開發(fā)利用提供依據。

參考文獻：

[1] 李欣，劉嚴，樊金玲，等.杜仲雄花脂溶性生物堿的鎮(zhèn)靜催眠作用研究[J].包裝與食品機械，2011，29（5）：9-12，40.

[2] 李欣，王利平，楊梅，等.杜仲雄花正丁醇提取物抑菌活性研究[J].中國食物與營養(yǎng)，2014，20（5）：53-56.

[3] 陳曉俊，王鳳琛，袁穎，等.杜仲皮、杜仲葉、杜仲雄花的藥效學比較研究[J].甘肅中醫(yī)藥大學學報，2016，33（5）：5-8.

[4] 欒慶祥.杜仲化學成分和藥理作用研究進展[J].安徽農業(yè)科學，2016， 44（9）：153-156.

[5] 黃紅瑩，李濤，杜紅巖，等.杜仲雄花水提取液治療物應性皮炎的實驗研究[J].免疫學雜志，2011，27（2）：119-121.

[6] BERGERON C， BOULET L P. Structural changes in airway diseases：characteristics， mechanisms， consequences， and pharmacologic modulation[J]. Chest，2006，129（4）：1068-1087.

[7] GANDHI N A， PIROZZI G， GRAHAM NMH. Commonality of the IL-4/IL-13 pathway in atopic diseases[J]. Expert Rev Clin Immunol，2017， 13（5）：425-437.

[8] MUKHOPADYAY S， MALIK P， ARORA S K， et al. Intercellular adhesion molecule-1 as a drug target in asthma and rhinitis[J]. Respirology，2014，19（4）：508-513.

[9] MANTHEI D M， SCHWANTES E A， MATHUR S K， et al. Nasal lavage VEGF and TNF-α levels during a natural cold predict asthma exacerbations[J]. Clin Exp Allergy，2014，44（12）：1484-1493.

[10] CHAUDHURI R， MCShARRY C， BRADY J， et，al. Low sputum MMP-9/TIMP ratio is associated with airway narrowing in smokers with asthma[J]. Eur Respir J，2014，44（4）：895-904.

[11] BULLENS D M， TRUYEN E， COTEUR L， et al. IL-17 mRNA in sputum of asthmatic patients：linking T cell driven inflammation and granulocytic influx？[J]. Respir Res，2006，7：135-138.

（收稿日期：2017-07-12）

（修回日期：2017-08-04；編輯：華強）