辣蓼黃酮乙酸乙酯部分對(duì)脂多糖誘導(dǎo)內(nèi)毒素血癥小鼠生化指標(biāo)和炎性細(xì)胞的影響

谷俐媛　陶俊宇　吳苑瀅　宋漫玲　胡庭俊

摘要：目的 觀察辣蓼黃酮乙酸乙酯（FEA）部分對(duì)內(nèi)毒素血癥小鼠生化指標(biāo)和炎性細(xì)胞的影響，探討其作用機(jī)制。方法 采用酶解-超聲偶聯(lián)法提取辣蓼全草中總黃酮，結(jié)合大孔樹(shù)脂純化富集獲得辣蓼黃酮乙酸乙酯（FEA）部分，脂多糖（LPS）刺激小鼠建立內(nèi)毒素血癥模型。實(shí)驗(yàn)小鼠分為空白組、模型組和FEA高、中、低劑量組，各給藥組給予相應(yīng)濃度藥液。測(cè)定腸組織丙二醛（MDA）和髓過(guò)氧化物酶（MPO）的含量，肝組織總抗氧化能力（T-AOC）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）的活性，血清還原型谷胱甘肽（GSH）含量與溶菌酶（LZM）、酸性磷酸酶（ACP）的活性，RT-PCR檢測(cè)肺組織腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、干擾素（IFN）-α、IFN-γ和白細(xì)胞介素-2（IL-2）含量。結(jié)果 與空白組比較，模型組小鼠腸組織MDA、MPO和血清ACP水平升高，肝組織T-AOC、T-SOD、GSH-Px和血清GSH、LZM水平降低，血清、腸組織和肝組織TNF-α升高，肺組織TNF-α、IFN-α、IFN-γ和IL-2 mRNA表達(dá)升高；與模型組比較，F(xiàn)EA各劑量組小鼠腸組織MDA、MPO和血清ACP水平降低，F(xiàn)EA中、高劑量組肝組織T-AOC、T-SOD、GSH-Px和血清GSH、LZM水平升高，F(xiàn)EA各劑量組小鼠血清、腸組織和肝組織TNF-α含量顯著降低，肺組織TNF-α、IFN-α、IFN-γ和IL-2 mRNA表達(dá)顯著降低；FEA高劑量組較模型組小鼠肺組織、回腸和結(jié)腸病理形態(tài)明顯改善。結(jié)論 FEA部分能降低LPS誘導(dǎo)小鼠內(nèi)毒素血癥的炎性損傷，對(duì)機(jī)體具有保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：辣蓼；黃酮乙酸乙酯；內(nèi)毒素血癥；生化指標(biāo)；炎性細(xì)胞；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.04.009

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）04-0040-06

Abstract： Objective To observe the effect of flavonoids ethyl acetate （FEA） from Polygonum hydropiper L. on biochemical indexes and inflammatory cytokines in mice with endotoxemia； To expore the mechanism. Methods Total flavonoids in the whole plant of Polygonum hydropiperum L. were extracted by enzymolysis-ultrasonic coupling method. The FEA part were obtained by extracting and separating， followed with macroporous resin purification and enrichment. The animal model of endotoxemia was established by stimulation of lipopolysaccharide （LPS） in mice. Experimental mice were divided into blank group， model group， FEA high-， medium-， and low-dose groups. Each administration group was given the corresponding concentration of herb liquor. The concentration of malondialdehyde （MDA） and myeloperoxidase （MPO） in intestinal tissue， total antioxidant capacity （T-AOC）， superoxide dismutase （T-SOD） activity and glutathione peroxidase （GSH-Px） activity in liver tissue， glutathione （GSH）， lysozyme （LZM） and acid phosphatase （ACP） in serum were determined. The contents of tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interferon （IFN）-α， IFN-γ and interleukin-2 （IL-2） in lung tissue were detected by RT-PCR. Results Compared with blank group， the levels of MDA， MPO in intestinal tissue and serum ACP of model mice were increased， while T-AOC， T-SOD， GSH-Px in liver tissue， serum GSH and LZM levels were decreased； TNF-α in serum， intestinal and liver tissues were increased， the expressions of TNF-α， IFN-α， IFN-γ and IL-2 mRNA in lung tissue were increased. Compared with the model group， the levels of MDA， MPO in intestinal tissue and serum ACP were decreased in all dose of FEA groups； The levels of T-AOC， T-SOD， GSH-Px in liver tissue， serum GSH and LZM of FEA medium and high-dose groups were increased. The content of TNF-α in mice serum， intestinal and liver tissues of all dose of FEA groups were significantly reduced， and the expressions of TNF-α， IFN-α， IFN-γ and IL-2 mRNA in lung tissues were significantly decreased. The pathological morphology of mice lung， ileum and colon tissues of FEA high-dose group were significantly ameliorated than model group. Conclusion FEA can attenuate inflammation injury of endotoxemia mice induced by LPS， which has protective effects for organism.

Keywords： Polygonum hydropiperum L.； FEA； endotoxemia； biochemical index； inflammatory cell； mice

辣蓼是蓼科蓼屬一年生草本植物，被廣泛用于慢性鼻炎、皮脂腺囊腫的治療，其抗氧化成分主要為黃酮苷類成分異槲皮苷和黃酮苷元類成分槲皮素[1]。內(nèi)毒素血癥由革蘭陰性菌感染引起，以敗血性休克為標(biāo)志，常伴發(fā)腦、心、腎、肝臟等重要器官的衰竭[2]。革蘭陰性菌感染時(shí)脂多糖（LPS）的釋放會(huì)引起腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素（IL）-1β等初級(jí)炎癥因子的釋放。有研究表明，在內(nèi)毒素血癥早期抑制此類因子能有效緩解炎癥[3]。黃酮類藥物憑借其顯著的抗炎與抗氧化功效、低毒易得的特點(diǎn)，近年來(lái)引起廣泛的關(guān)注與應(yīng)用[4]。但關(guān)于辣蓼總黃酮對(duì)內(nèi)毒素血癥保護(hù)效果的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究采用酶解-超聲偶聯(lián)法提取辣蓼全草中的總黃酮，經(jīng)萃取分離雜質(zhì)，結(jié)合大孔樹(shù)脂純化富集獲得辣蓼黃酮乙酸乙酯（FEA）部分。前期研究表明，小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞（RAW264.7）受到LPS刺激12 h內(nèi)活性氧（ROS）與一氧化氮（NO）的釋放急劇增多，但經(jīng)FEA處理后1 h能明顯減少LPS誘導(dǎo)的ROS釋放量；在FEA預(yù)處理1 h后能減少LPS刺激所誘導(dǎo)的促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的釋放，有助于降低炎癥損傷；此外，F(xiàn)EA預(yù)處理1 h后能增加抗炎因子IL-10的生成[5]。為了進(jìn)一步考察FEA的體內(nèi)抗炎效果，本實(shí)驗(yàn)采用LPS刺激小鼠建立內(nèi)毒素血癥小鼠模型，觀察FEA部分對(duì)LPS誘導(dǎo)內(nèi)毒素血癥小鼠生化指標(biāo)和炎性細(xì)胞的影響，探討其作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

雄性昆明種小鼠80只，5～6周齡，SPF級(jí)，體質(zhì)量18～22 g，廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（桂）2014-0002。飼養(yǎng)于溫度22～25 ℃、濕度50%～80%環(huán)境，自由攝食飲水。

1.2 藥物

FEA部分，廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室提取。

1.3 主要試劑與儀器

LPS（大腸桿菌055：B5，批號(hào)011M4001V），胰酶（批號(hào)031M7358V），SIGMA；還原型谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、溶菌酶（LZM）、酸性磷酸酶（ACP）、髓過(guò)氧化物酶（MPO）、總抗氧化能力（T-AOC）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒，南京建成生物工程研究所；超純RNA提取試劑盒，康為世紀(jì)公司；PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser 反轉(zhuǎn)錄試劑盒，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ熒光定量PCR染料，TAKARA公司；EnSpire多功能熒光酶標(biāo)儀，PerkinElmer公司；實(shí)時(shí)定量PCR儀（BIO-RAD公司，型號(hào)CFX 96），純水系統(tǒng)（MERCK MILLIPORE公司，型號(hào)Direct-Q 5UV），ZT-12M生物組織自動(dòng)脫水機(jī)、YB-6LF型生物組織石蠟包埋機(jī)、YT-7FB生物組織攤烤片機(jī)，孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司；輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（型號(hào)RM2245），徠卡纖維系統(tǒng)貿(mào)易有限公司；微量離心機(jī)（型號(hào)5418），Eppendorf公司；制冰機(jī)，SANYO公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組和給藥

適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，80只小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組和FEA高、中、低劑量組，每組16只。FEA高、中、低劑量組分別按200、100、50 mg/kg劑量灌胃FEA部分溶液0.2 mL，模型組灌胃LPS（17 mg/kg）溶液0.2 mL，空白組灌胃雙蒸水10 mL/kg，每日1次，連續(xù)3 d，最后1次給藥1 h后，空白組腹腔注射0.9%氯化鈉10 mL/kg，其余各組腹腔注射LPS溶液（17 mg/kg）0.2 mL，24 h后眼球采血并處死，分離受試小鼠肺、小腸、肝組織待測(cè)。

2.2 生化指標(biāo)和炎癥因子測(cè)定

取小鼠小腸組織，用冰生理鹽水制備10%回腸組織勻漿液，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定腸組織勻漿MDA含量和MPO活性，并用考馬斯亮藍(lán)試劑盒測(cè)定其總蛋白含量。取肝組織勻漿上清液，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定肝臟組織勻漿T-AOC、T-SOD、GSH-Px的活性，并用考馬斯亮藍(lán)試劑盒測(cè)定其總蛋白含量。

取小鼠血清，嚴(yán)格按照試劑盒步驟測(cè)定血清GSH含量及LZM、ACP活性。ELISA試劑盒測(cè)定血清、腸組織勻漿及肝組織勻漿TNF-α含量。

2.3 組織病理學(xué)觀察

取小鼠右肺及回腸、結(jié)腸各1～2 cm，福爾馬林固定，其余腸組織于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫?%甲醛溶液固定，石蠟切片，常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腸組織病理學(xué)變化。

2.4 RT-PCR檢測(cè)肺組織腫瘤壞死因子-α、干擾素-α、干擾素-γ和白細(xì)胞介素-2基因表達(dá)

取分離所得的肺組織，按試劑盒說(shuō)明書(shū)提取RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，對(duì)目的基因與內(nèi)參基因分別用實(shí)時(shí)定量PCR儀和熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系嚴(yán)格按PCR儀說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。引物序列見(jiàn)表1。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間比較用方差分析，多重比較用LSD法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 一般狀況

小鼠注射LPS后8 h，扎堆蜷縮，攝食量減少或停止，12 h后各給藥組和模型組出現(xiàn)腹瀉現(xiàn)象且模型小鼠開(kāi)始出現(xiàn)死亡。結(jié)果見(jiàn)表2。

4.2 辣蓼黃酮乙酸乙酯部分對(duì)模型小鼠腸組織丙二醛含量和髓過(guò)氧化物酶活性的影響

與空白組比較，模型組小鼠腸組織勻漿MDA含量、MPO活性顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，F(xiàn)EA中、高劑量組小鼠腸組織勻漿MDA含量顯著降低，F(xiàn)EA各劑量組腸組織勻漿MPO活性顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)表3。

4.3 辣蓼黃酮乙酸乙酯部分對(duì)模型小鼠肝組織總抗氧化能力、總超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性的影響

與空白組比較，模型組小鼠肝組織勻漿T-AOC水平降低但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），T-SOD、GSH-Px水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，F(xiàn)EA中、高劑量組小鼠肝組織勻漿T-AOC水平顯著升高，F(xiàn)EA各劑量組小鼠肝組織勻漿T-SOD、GSH-Px水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)表4。

4.4 辣蓼黃酮乙酸乙酯部分對(duì)模型小鼠血清還原型谷胱甘肽、溶菌酶和酸性磷酸酶活性的影響

與空白組比較，模型組小鼠血清GSH、LZM活性降低但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），ACP活性顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，F(xiàn)EA中、高劑量組小鼠血清GSH、LZM活性顯著升高，ACP活性顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)表5。

4.5 辣蓼黃酮乙酸乙酯部分對(duì)模型小鼠血清、腸組織和肝組織腫瘤壞死因子-α含量的影響

與空白組比較，模型組小鼠血清、腸組織和肝組織TNF-α顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，F(xiàn)EA各劑量組小鼠血清、腸組織和肝組織TNF-α含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)圖1。

4.6 辣蓼黃酮乙酸乙酯部分對(duì)模型小鼠肺組織腫瘤壞死因子-α、干擾素-α、干擾素-γ和白細(xì)胞介素-2基因表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組小鼠肺組織TNF-α、IFN-α、IFN-γ和IL-2 mRNA表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，F(xiàn)EA各劑量組小鼠肺組織TNF-α、IFN-α、IFN-γ和IL-2 mRNA表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)圖2。

4.7 辣蓼黃酮乙酸乙酯部分對(duì)模型小鼠肺組織病理形態(tài)的影響

模型組較空白組小鼠肺泡壁明顯增厚，F(xiàn)EA各劑量組較模型組小鼠肺泡壁增厚現(xiàn)象減輕，F(xiàn)EA高劑量組效果最好。模型組較空白組小鼠肺組織有大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，并有大面積滲出液漏出，肺毛細(xì)血管充血、出血，F(xiàn)EA高劑量組較模型組小鼠肺組織滲出液漏出現(xiàn)象減輕，中性粒細(xì)胞未減少。結(jié)果見(jiàn)圖3。

4.8 辣蓼黃酮乙酸乙酯部分對(duì)模型小鼠回腸組織病理形態(tài)的影響

空白組小鼠回腸組織結(jié)構(gòu)完整，可見(jiàn)完整的絨毛；模型組小鼠回腸組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)很大程度的破壞，黏膜下層變薄，存在絨毛大量脫落的現(xiàn)象；FEA高劑量組小鼠回腸組織結(jié)構(gòu)完整，與空白組比較無(wú)明顯差異。結(jié)果見(jiàn)圖4。

4.9 辣蓼黃酮乙酸乙酯部分對(duì)模型小鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)的影響

空白組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整，可見(jiàn)完整的絨毛；模型組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)很大程度的破壞，黏膜下層變薄，存在絨毛大量脫落的現(xiàn)象；FEA高劑量組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整，可見(jiàn)完整的絨毛，與空白組比較無(wú)明顯差異。結(jié)果見(jiàn)圖5。

5 討論

黃酮具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗氧化性等作用。有研究表明，腹腔注射槲皮素與黃豆苷元能顯著降低血中TNF-α水平，從而降低LPS誘導(dǎo)的敗血癥肺損傷[6-7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)EA通過(guò)提升小鼠體內(nèi)肝臟抗氧化防御酶促體系的活性可降低LPS對(duì)小鼠機(jī)體的損傷；抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的產(chǎn)生，降低肺組織TNF-α、IFN-α、IFN-γ及IL-2 mRNA的表達(dá)，減輕LPS對(duì)小鼠組織的損傷尤其是肺組織的損傷。

本實(shí)驗(yàn)用FEA預(yù)處理3 d，能降低LPS對(duì)小鼠回腸與結(jié)腸的結(jié)構(gòu)損傷，降低LPS刺激下腸道MDA的生成，從而降低氧化應(yīng)激損傷。腸組織MPO在腸組織局部含量的升高可反映中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的程度。FEA預(yù)處理后MPO含量的降低表明腸道中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象減少。SOD是清除氧自由基的重要酶系，對(duì)細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，可阻止氧化自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)大，是生物體內(nèi)氧自由基清除系統(tǒng)的重要防線。FEA預(yù)處理能顯著提升小鼠肝臟T-SOD水平，提高小鼠肝臟總T-AOC，對(duì)抗LPS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。有研究表明，給予抗氧化劑或提升機(jī)體抗氧化力有助于降低敗血癥損傷，在LPS誘導(dǎo)的豬與大鼠敗血癥模型中，N-乙酰半胱氨酸的抗氧化與降低敗血癥損傷功效已被證實(shí)，提示在敗血癥病程中降低氧化損傷有助于提高動(dòng)物存活率[8-9]。GSH不僅能消除機(jī)體自由基還可以提高機(jī)體免疫力，作為體內(nèi)一種重要的抗氧化劑，保護(hù)許多蛋白質(zhì)和酶等分子中的巰基。有研究顯示，運(yùn)用還原型谷胱甘肽治療輪狀病毒腸炎合并肝功能異常30例，結(jié)果表明療效可靠，提示GSH能一定程度上緩解腸炎[10]。在本實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)EA預(yù)處理3 d，一方面提升肝組織GSH-Px活性，另一方面提升血清GSH含量，為清除機(jī)體內(nèi)各處自由基提供物質(zhì)基礎(chǔ)。類似研究也表明，阿魏酸對(duì)LPS誘導(dǎo)的大鼠敗血癥模型可升高GSH-Px、GSH與SOD水平，并降低MDA水平及DNA的損傷[11]?？傊現(xiàn)EA通過(guò)提升小鼠體內(nèi)肝臟的抗氧化防御酶促體系的活性從而降低LPS對(duì)小鼠機(jī)體帶來(lái)的損傷。

溶酶體是重要的細(xì)胞器，內(nèi)含多種水解酶如ACP，參與細(xì)胞的消化、防御等重要生理過(guò)程。模型組小鼠受到LPS刺激，導(dǎo)致ACP過(guò)多釋放，細(xì)胞產(chǎn)生自溶、組織發(fā)生變性，而FEA能通過(guò)提升機(jī)體的抗炎、抗氧化能力，從而降低機(jī)體的炎癥損傷，這在本實(shí)驗(yàn)肺組織、腸組織HE病理觀察結(jié)果均有體現(xiàn)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組腸組織、血清和肝組織TNF-α均顯著增加。這種現(xiàn)象一方面利于TNF-α誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞釋放IL-1β，刺激其他細(xì)胞因子的生物合成，形成逐級(jí)放大的瀑布樣連鎖反應(yīng)，誘導(dǎo)大范圍的組織細(xì)胞損害；另一方面，這些炎癥因子特別是IL-2不僅能促進(jìn)NK細(xì)胞的增殖，還能促使NK細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α，這就導(dǎo)致機(jī)體源源不斷的生成TNF-α，發(fā)生惡性循環(huán)，對(duì)肺組織產(chǎn)生較強(qiáng)的毒性作用。FEA預(yù)處理3 d能有效降低腸組織、血清和肝組織TNF-α的含量，而肺組織TNF-α、IFN-α、IFN-γ及IL-2 mRNA的表達(dá)量也能得到顯著抑制。

綜上，F(xiàn)EA部分能降低LPS誘導(dǎo)的小鼠內(nèi)毒素血癥的炎性損傷，對(duì)機(jī)體有一定的保護(hù)作用，其具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2017-07-25）

（修回日期：2017-09-17；編輯：華強(qiáng)）