EGFR、Her-2及Hsp90α在食管腺癌患者中的表達(dá)及病理研究

姜　波　高愛民　盛　瑩　文　進(jìn)　趙勝乾　王仰坤

食管腺癌可以說是我國比較常見的1種惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著人們的生命健康。根治性手術(shù)雖然能夠切除病變早期的食管腺癌，但是大多數(shù)患者就診時屬于進(jìn)展期。輔助化療治療該病效果理想，能夠降低患者的腫瘤分期，改善進(jìn)展期切除率，從而延長患者的生存期[1]。不過進(jìn)展期患者的預(yù)后方面，還缺乏統(tǒng)一的評估方案，同時術(shù)前對化療效果的預(yù)測也缺乏可靠的醫(yī)學(xué)證據(jù)。如果能夠篩選食管腺癌預(yù)后評估的可靠指標(biāo)，有利于防止盲目用藥給患者帶來非必要的痛苦。本研究在此分析EGFR、Her-2及Hsp90α的表達(dá)在食管腺癌患者中的表達(dá)及同病理學(xué)特征之間的關(guān)系，現(xiàn)報告如下。

1　資料與方法

1.1　一般資料

選取2013年1月至2015年12月我院收治的食管腺癌患者30例為研究組，男性27例，女性3例，年齡22～56歲，平均(37.2±1.9)歲。同時選取同期胃鏡下食管活檢正常的健康人員30例為對照組，男性26例，女性4例，年齡23～51歲，平均(35.2±2.3)歲。兩組研究對象均知情同意，經(jīng)過倫理委員會同意。

1.2　方法

1.2.1儀器與試劑脫水機(jī)為PELOIUSII，包埋機(jī)EGl140H，染色機(jī)ST5020，切片機(jī)RM2135，顯微鏡DMlOoo，均為德國徠卡公司生產(chǎn)。兔抗人EGFR抗體、兔抗人Her-2抗體、兔抗人HSP90Α抗體，均由上海艾博抗公司生產(chǎn)。兔抗人SP法試劑盒，北京金橋公司生產(chǎn)[2]。

1.2.2實驗方法常規(guī)染色，切取厚度5.0 μm的切片，烤箱當(dāng)中放置1 h，冷卻后相繼添加二甲苯、乙醇15 min，去除之后使用自來水進(jìn)行沖洗。之后使用蘇木精5 min并使用自來水進(jìn)行沖洗，酒精脫水之后使用樹膠封片，在顯微鏡條件下觀察[3]。

1.2.3免疫化學(xué)檢測檢測食管腺癌組織當(dāng)中的EGRF表達(dá)、HER-2表達(dá)以及HSP90Α表達(dá)。蠟塊5 μm切片后烤箱干燥2 h，常規(guī)脫蠟之后添加二甲苯20 min以及無水乙醇10 min，之后應(yīng)用自來水進(jìn)行沖洗?？乖迯?fù)方面，把切片浸入枸櫞酸液當(dāng)中浸泡，高壓鍋中修復(fù)3 min后冷卻，使用生理鹽水沖洗10 min[4]。室溫條件下孵育20 min，生理鹽水沖洗10 min后滴加一抗(EGRF、HER-2以及HSP90Α)。室溫放置20 min之后生理鹽水沖洗，并DA顯色。自來水沖洗之后使用蘇木精復(fù)染，酒精脫水之后應(yīng)用樹膠進(jìn)行封片[5]。

1.3　觀察指標(biāo)

陽性對照方面，應(yīng)用已知的EGFR、Her-2以及HSP90Α陽性切片使用相同方法染色，作為陽性對照。陰性對照方面，使用生理鹽水PS代替一抗，將操作結(jié)果當(dāng)作陰性對照。由兩名以上的病理科醫(yī)師閱片，切片隨機(jī)計數(shù)20個高倍鏡下(×400)視野當(dāng)中的陽性細(xì)胞，統(tǒng)計染色細(xì)胞數(shù)量以及強(qiáng)度[6]。

Hsp90α結(jié)果分析方面，陽性評分(0～10%計0分，11%～25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，76%～100%計4分，并進(jìn)行染色強(qiáng)度評分(不著色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。相加得到結(jié)果，0～1分是(-)，2～3分是(+)，4～5分是(++)，6～7分是(+++)。將(-)以及(+)判斷為陰性，(++)是弱陽性，(+++)定為強(qiáng)陽性，++以上為陽性結(jié)果[7]。

EGRF以及HER-2結(jié)果分析方面，染色為零是完全陰性-：+，細(xì)胞膜染色>10%，同時間斷分布，未曾環(huán)繞胞膜；++，>10%的細(xì)胞膜中度陽性同時連續(xù)染色，環(huán)繞細(xì)胞膜；+++，>10%的細(xì)胞膜強(qiáng)陽性同時連續(xù)染色，環(huán)繞細(xì)胞膜；-及+屬于陰性；++屬于弱陽性，+++屬于強(qiáng)陽性。其中++以上判斷為陽性。

1.4　統(tǒng)計學(xué)方法

2　結(jié)果

食管腺癌組織中EGFR、Her-2及Hsp90α表達(dá)陽性率顯著高于正常鱗狀上皮，差異均有統(tǒng)計學(xué)(P<0.05)。見表1。

表1　兩組EGFR、Her-2及Hsp90α表達(dá)情況比較(例，%)

HSP90α表達(dá)與腫瘤浸潤深度、腫瘤細(xì)胞分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期以及脈管侵犯等因素相關(guān)(P<0.05)，EGFR表達(dá)與腫瘤TNM分期、細(xì)胞分化、浸潤深度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素相關(guān)(P<0.05)，Her-2表達(dá)與患者的腫瘤細(xì)胞分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期等因素相關(guān)(P<0.05)，見表2。

食管腺癌組織中Hsp90α表達(dá)與EGFR表達(dá)存在正相關(guān)(P<0.05)，Hsp90α表達(dá)與Her-2表達(dá)存在正相關(guān)(P<0.05)，Her-2表達(dá)與EGFR表達(dá)無相關(guān)性(P>0.05)，具體見表3。

3　討論

食管腺癌發(fā)生發(fā)展以及轉(zhuǎn)移等同各方面的因素相關(guān)，具體的作用機(jī)制還不夠明確，尋找食管腺癌分子靶標(biāo)還有靶向藥物已經(jīng)成為臨床研究的熱點(diǎn)[8]。本研究借助于分析食管腺癌組織當(dāng)中EGFR表達(dá)、Her-2表達(dá)以及Hsp90a表達(dá)情況，同時判斷三者同患者病理特征之間的關(guān)系，從而判斷患者的預(yù)后情況，也為臨床的靶向治療提供可靠的分子學(xué)判斷依據(jù)。EGFR屬于酪氨酸激酶的1種，轉(zhuǎn)導(dǎo)信號的方式同腫瘤侵襲以及轉(zhuǎn)移等存在著直接的聯(lián)系。研究結(jié)果顯示，50%左右的食管腺癌患者存在和EGFR的過度表達(dá)，并且同患者的預(yù)后質(zhì)量較差存在聯(lián)系。EGFR表達(dá)同患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期以及生存期等存在聯(lián)系，也跟腫瘤血管增殖、轉(zhuǎn)移侵襲以及細(xì)胞凋亡等因素相關(guān)[9]。本研究的結(jié)果顯示，食管腺癌患者癌組織當(dāng)中的EGFR表達(dá)要顯著高于正常組織(P<0.05)。病理分析結(jié)果顯示，EGFR表達(dá)同患者年齡、性別、腫瘤位置以及分化程度等缺乏明顯聯(lián)系，同浸潤深度、TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素存在正相關(guān)(P<0.05)。有研究顯示，食管腺癌患者手術(shù)之后的生存期隨著EGFR的表達(dá)上升而逐漸下降[10]。這意味著EGFR表達(dá)同食管腺癌患者的浸潤、轉(zhuǎn)移還有預(yù)后等存在聯(lián)系。在食管腺癌當(dāng)中表達(dá)的差異，需要在選擇EGFR靶向藥物進(jìn)行食管腺癌患者治療的過程當(dāng)中明確具體的治療策略。

表2　EGFR、Her-2及Hsp90α表達(dá)與食管腺癌病理特征的關(guān)系/例

表3　食管腺癌組織中EGFR、Her-2及Hsp90α表達(dá)的關(guān)系

Her-2同樣是酪氨酸激酶的一種，在各種惡性腫瘤當(dāng)中呈現(xiàn)出高表達(dá)，例如肺癌、結(jié)直腸癌以及卵巢癌等。過表達(dá)同乳腺癌患者的臨床分期以及分化程度等存在正相關(guān)，同患者的預(yù)后質(zhì)量存在負(fù)相關(guān)，可以說是乳腺癌患者重要的預(yù)后判斷指標(biāo)。近年研究人員發(fā)現(xiàn)Her-2在胃癌的發(fā)展過程當(dāng)中同樣發(fā)揮著重要的影響，并且曲妥珠單抗經(jīng)過歐盟以及日本的注冊應(yīng)用到治療Her-2存在過表達(dá)的胃癌患者當(dāng)中[11]。食管腺癌患者當(dāng)中Her-2的表達(dá)方面，還存在著一定程度的爭議，大部分研究人員認(rèn)為這一比例不高于30%。有研究人員認(rèn)為Her-2的過表達(dá)同患者的年齡、性別、分化程度以及腫瘤大小等缺乏直接的聯(lián)系，但是同腫瘤的浸潤深度還有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素存在密切聯(lián)系，并Her-2的過表達(dá)會影響到患者的生存率以及生存期現(xiàn)[12]。本研究的結(jié)果顯示，食管腺癌患者癌組織當(dāng)中的Her-2表達(dá)率要顯著于正常組織(P<0.05)，同時表達(dá)情況同管腺癌患者年齡、性別、分化程度以及腫瘤位置等因素?zé)o關(guān)，不過同患者腫瘤的浸潤深度存在負(fù)相關(guān)，同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移還有TNM分期等因素存在正相關(guān)。除此之外，也有研究人員認(rèn)為Her-2表達(dá)同食管腺癌患者手術(shù)之后的生存期存在聯(lián)系，隨著表達(dá)程度的上升，患者的生存期越來越短，這表明Her-2同食管腺癌患者的預(yù)后質(zhì)量存在聯(lián)系[13]。不過因為Her-2的表達(dá)率比較低，同時研究的樣本量不多，因此食管腺癌當(dāng)中Her-2的變化還需要后續(xù)的深入研究。

Her-2以及EGFR的分子學(xué)功能存在著密切的聯(lián)系，Her-2缺乏顯著的單體活性，需要借助于二聚體才能夠生成活化信號。在細(xì)胞膜遭到EGF的處理之后，Her-2以及EGFR就能夠在功能上發(fā)揮反向激活效果。EGF同EGFR以及Her-2二聚體之間的結(jié)合，要高于EGF受體二聚體的結(jié)合。同時異質(zhì)二聚體同均質(zhì)二聚體對比而言，無論在人體的正常細(xì)胞當(dāng)中還是在腫瘤細(xì)胞當(dāng)中，生長活性都顯著上升。因為Her-2配體還不夠清晰，傳導(dǎo)信號需要借助于其它的二聚體來發(fā)揮相互影響，或者是借助于同EGFR家族當(dāng)中的受體來發(fā)揮作用。與此同時，在食管腺癌轉(zhuǎn)移過程當(dāng)中，EGFR以及Her-2共同過表達(dá)發(fā)揮著不容忽視的重要影響。聯(lián)合過表達(dá)同食管腺癌患者的發(fā)生發(fā)展以及預(yù)后質(zhì)量存在這密切的聯(lián)系，這一關(guān)系得到研究人員的普遍認(rèn)同。本研究的結(jié)果顯示，食管腺癌患者的組織當(dāng)中，EGFR表達(dá)以及HER-2表達(dá)存在著正相關(guān)，這表明兩者在食管腺癌發(fā)病過程當(dāng)中存在著聯(lián)系。

Hsp90α屬于EGFR以及Her-2分子的伴侶，在腫瘤發(fā)生發(fā)展環(huán)節(jié)都有重要的影響。Hsp90α在多種人類惡性腫瘤組織當(dāng)中呈現(xiàn)出高表達(dá)的狀態(tài)，并且同腫瘤出現(xiàn)、轉(zhuǎn)移以及惡性行為存在著密切的聯(lián)系。有研究人員通過實驗發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌患者當(dāng)中Hsp90的表達(dá)表達(dá)率超過72%，要明顯高于患者癌旁組織當(dāng)中的40%以及正常黏膜組織當(dāng)中的20%，同時腫瘤浸潤加深之后，Hsp90表達(dá)也越來越高。也有研究人員分析宮頸癌患者病理組織當(dāng)中Hsp90的表達(dá)情況，結(jié)果表明示Hsp90表達(dá)同宮頸癌患者的病理分級缺乏顯著的關(guān)聯(lián)性[14]。食管腺癌患者當(dāng)中Hsp90表達(dá)同患者手術(shù)之后生存時間的對比還不夠明確。本研究的結(jié)果顯示，食管腺癌組織當(dāng)中的Hsp90α表達(dá)率要顯著高于正常組織(P<0.05)，并且同食管腺癌患者年齡、性別、腫瘤分化程度以及腫瘤位置無明顯聯(lián)系，同食管腺癌的TNM分期、浸潤深度還有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素存在正相關(guān)(P<0.05)。有研究人員借助于檢測食管腺癌患者的Hsp90α表達(dá)情況，同患者的生存時間進(jìn)行對比，結(jié)果顯示Hsp90α的表達(dá)程度同食管腺癌患者手術(shù)之后的生存期存在著直接的聯(lián)系，Hsp90α的表達(dá)越強(qiáng)，那么食管腺癌患者的生存期也就越短。這意味著Hsp90α能夠當(dāng)作食管腺癌患者預(yù)后質(zhì)量判斷的可靠指標(biāo)。食管腺癌患者當(dāng)中Hsp90α表達(dá)以及EGFR表達(dá)存在正相關(guān)，因此理論層面而言，聯(lián)合應(yīng)用將Hsp90還有EGFR當(dāng)作靶點(diǎn)的治療藥物可以提高藥物治療的敏感性，降低腫瘤患者的耐藥性還有藥物治療造成的不良反應(yīng)。除此之外，EGFR表達(dá)、Her-2表達(dá)以及Hsp90α表達(dá)在食管腺癌組織當(dāng)中存在著表達(dá)差異，并且同病理特征之間的關(guān)系以及對患者手術(shù)治療之后的生存期也有著各自的影響，需要引起醫(yī)務(wù)人員的重視。

綜上所述，食管腺癌患者當(dāng)中EGFR、Her-2及Hsp90α表達(dá)陽性率顯著高于健康人群，并且同TNM分期以及細(xì)胞分化的因素存在密切聯(lián)系。研究分析腫瘤當(dāng)中蛋白過度表達(dá)同腫瘤之間的關(guān)系，對指導(dǎo)臨床治療以及評估患者預(yù)后都有重要價值。