臭牡丹總黃酮對(duì)A549細(xì)胞增殖遷移侵襲力及Wnt通路相關(guān)蛋白的影響

余娜 朱克儉 馬思靜 譚小寧 唐皓

摘要 目的：觀察臭牡丹總黃酮對(duì)β-catenin過表達(dá)A549細(xì)胞增殖、遷移、侵襲力以及Wnt通路相關(guān)蛋白的影響。方法：選取構(gòu)建β-catenin真核過表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，將其分為6組，分別為未轉(zhuǎn)染細(xì)胞、未轉(zhuǎn)染細(xì)胞+臭牡丹總黃酮、空載組、空載+臭牡丹總黃酮、β-catenin過表達(dá)組、β-catenin過表達(dá)+臭牡丹總黃酮。MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的相對(duì)存活率，劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞遷移能力，Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的侵襲力。Western Blot檢測(cè)各組Wnt通路相關(guān)蛋白β-catenin、GSK-3β、P-GSK-3β、c-myc、CyclinD1的表達(dá)。結(jié)果：轉(zhuǎn)染β-catenin過表達(dá)的A549細(xì)胞增殖能力、遷移能力、侵襲力均明顯增強(qiáng)（P<0.05），并顯著上調(diào)wnt通路相關(guān)因子β-catenin、C-Myc，CyclinD的蛋白表達(dá)，下調(diào)P-GSK-3β的蛋白表達(dá)（P<0.05）。采用臭牡丹總黃酮干預(yù)后，能明顯降低各組細(xì)胞的存活率，降低細(xì)胞向劃痕區(qū)域遷移的能力，減少侵襲小室穿過基膜的細(xì)胞數(shù)（P<0.05）。并下調(diào)β-catenin、C-Myc、CyclinD1表達(dá)（P<0.05），上調(diào)P-GSK-3β表達(dá)（P<0.05）。臭牡丹總黃酮的干預(yù)作用對(duì)轉(zhuǎn)染β-catenin過表達(dá)細(xì)胞尤為明顯。結(jié)論：轉(zhuǎn)染β-catenin過表達(dá)的A549細(xì)胞其增殖、遷移、侵襲力均明顯增強(qiáng)，能激活Wnt/β-catenin通路。臭牡丹總黃酮可抑制A549細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲力，其機(jī)制可能是通過抑制細(xì)胞中β-catenin的高表達(dá)從而調(diào)控下游的一系列因子而起到抑制Wnt/β-catenin通路的作用。

關(guān)鍵詞 臭牡丹總黃酮；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；Wnt信號(hào)通路；β-catenin過表達(dá)載體

Abstract Objective：To observe the effect of total flavonoids isolated from clerodendrum bungei on proliferation，migration，invasion of human lung adenocarcinoma A549 cell and its effect on the proteins related to Wnt signal pathway.Methods：β-catenin over-expression plasmid was established and A549 cell was transfected.A549 cells were divided into 6 groups：normal A549 cells，normal A549 cells + total flavonoids isolated from clerodendrum bungei group，empty vector group，empty vector + total flavonoids isolated from clerodendrum bungei group，β-catenin over-expression group，β-catenin + total flavonoids isolated from clerodendrum bungei group.MTT assay detected relative survival rate of the cell，and scratch test observed cell migration.Transwell experiment detected the cell invasion.Western Blot was used to detect proteins of the factors that were related to Wnt pathway：β-catenin，GSK-3β，P-GSK-3β，c-myc，Cyclin D1.Results：The proliferation，migration and invasion of A549 cell was enhanced significantly after transfected with β-catenin over-expression plasmid （P<0.05 or 0.01），along with the growth in number of β-catenin，C-Myc and CyclinD which were related to Wnt signal pathway and the decrease of P-GSK-3β.After interfered with total flavonoids isolated from clerodendrum bungei，survival rate of A549 cell in each group declined significantly and the ability of migration and proliferation was decreased （P<0.05）.It down-regulated the expression of β-catenin，C-Myc and CyclinD1 （P<0.05） and up-regulated the expression of P-GSK-3β （P<0.05）.The effect on groups transfected with β-catenin over-expression plasmid were especially obvious.Conclusion：Overexpression of β-catenin could promote the invasion，migration and proliferation in the A549 cell line and activate Wnt/β-catenin pathway，while total flavonoids isolated from clerodendrum bungei could inhibit the invasion，migration and proliferation in the A549 cell line，The pharmacological mechanism is probably inhibiting Wnt/β-catenin pathway through prohibiting the overexpression of β-catenin by regulating its downstream factors.

Key Words Total flavonoids isolated from clerodendrum bungei； Epithelial-Mesenchymal Transition； Wnt signal pathway； β-catenin over-expression plasmid

中圖分類號(hào)：R284文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.04.046

原發(fā)性支氣管肺癌（簡(jiǎn)稱肺癌）是一種發(fā)生于支氣管黏膜及腺體的惡性腫瘤，屬于中醫(yī)“肺積、肺巖、息賁、虛勞”等范疇。2014年全球癌癥報(bào)告顯示，全球引起死亡的最常見癌癥，肺癌居于首位。在我國肺癌的發(fā)病率與死亡率均占腫瘤疾病的首位。腫瘤局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是腫瘤病程發(fā)生發(fā)展的主要原因，80%以上的肺癌患者確診時(shí)癌細(xì)胞已發(fā)生全身侵犯和轉(zhuǎn)移，進(jìn)入疾病晚期。臭牡丹是從湖南民間治療惡性腫瘤的單方發(fā)掘，并經(jīng)過反復(fù)臨床與科研實(shí)踐篩選出來的一味中藥。臭牡丹性平，味辛、苦，歷代本草記載其有“祛風(fēng)除濕、解毒散瘀、消腫止痛”之功，對(duì)多種腫瘤具有臨床治療作用，尤以肺癌為佳。研究表明臭牡丹對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，并有一定預(yù)防肺癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移的作用[1-2]。Wnt/β-catenin通路作為一條高度保守的信號(hào)通路在發(fā)育成熟動(dòng)物個(gè)體中的異常激活，參與腫瘤發(fā)生的機(jī)制涉及信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、凋亡以及細(xì)胞黏附等多方面[3]，并與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)采用β-catenin過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，并予以臭牡丹總黃酮進(jìn)行干預(yù)，觀察β-catenin過表達(dá)載體以及臭牡丹總黃酮對(duì)A549細(xì)胞增殖、侵襲、侵襲力以及Wnt/β-catenin通路的影響。

1 材料與方法

1.1.1 細(xì)胞 人肺腺癌A549購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫。

1.1.2 試劑與儀器

β-catenin質(zhì)粒（pCDNA3.1+載體，AMP抗性），空載體（pCDNA3.1+，AMP抗性），由上海交通大學(xué)金衛(wèi)林教授饋贈(zèng)。臭牡丹總黃酮由湖南中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院中藥房提供臭牡丹生藥，經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所提取，總黃酮含量65%，1 g相當(dāng)于生藥30 g。批號(hào)：20130720。MTT購自Sigma公司。Transwell小室購自Corning公司。二甲基亞砜（DMSO）購自VETEC公司。RIPA裂解液購自中國北京普利萊。β-Catenin、GSK-3β、P-GSK-3β（Ser9）兔單克隆抗體均購自Cell Signaling Technology公司；C-Myc、Cyclin D1兔單克隆抗體均購自北京博奧森；β-Actin鼠單克隆抗體購自sigma aldrich公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG購自Proteintech公司。Endo-free Plasmid Mini KitI試劑盒購自廣州飛揚(yáng)生物工程有限公司。Lip2000助轉(zhuǎn)染試劑購自美國LIFE公司。胎牛血清購自Gibco公司。DMEM培養(yǎng)液，胰酶均購自Hyclone公司。金屬浴Grant-bi公司生產(chǎn)，垂直凝膠電泳系統(tǒng)、轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)、化學(xué)發(fā)光儀XRS+由BIO-RAD公司生產(chǎn)超凈工作臺(tái)，細(xì)胞培養(yǎng)箱均由Thermo Scientific公司生產(chǎn)；離心機(jī)由eppendorf公司生產(chǎn)；倒置生物顯微鏡由北京中顯恒業(yè)儀器公司生產(chǎn)；酶標(biāo)儀由匯松公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

將細(xì)胞分為6組：A組（未轉(zhuǎn)染細(xì)胞），B組（未轉(zhuǎn)染細(xì)胞+臭牡丹總黃酮），C組（轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒），D組（轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒+臭牡丹總黃酮），E組（轉(zhuǎn)染β-Catenin過表達(dá)質(zhì)粒），F(xiàn)組（轉(zhuǎn)染β-catenin過表達(dá)質(zhì)粒+臭牡丹總黃酮組）。

1.2.2 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1）細(xì)胞培養(yǎng)與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染：細(xì)胞培養(yǎng)：人肺腺癌細(xì)胞A549培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃，5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中。每2～3天換液1次，待細(xì)胞長滿約80%時(shí)，0.25%含EDTA的胰酶消化后直接分瓶傳代。A549細(xì)胞呈梭形貼壁生長。

β-catenin過表達(dá)和空載質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增與抽提：常規(guī)制備DH5α大腸桿菌感受態(tài)，制備感受態(tài)細(xì)胞，克隆母的基因片段。將紙片質(zhì)粒β-catenin過表達(dá)、空載質(zhì)粒分別剪下，放到1.5 mL離心管中，加入20～50 μL滅菌水浸潤備用。將制備好的感受態(tài)細(xì)胞加入準(zhǔn)備好的β-catenin過表達(dá)和空載質(zhì)粒溶液50 μL，搖勻后置于冰上30 min。42 ℃水中熱擊90 s，迅速冰浴冷卻3～5 min。另準(zhǔn)備EP管1只，加入液體LB培養(yǎng)基1 mL（不含Amp），混勻，37 ℃下恒溫振蕩1 h。取200 μL菌液涂抹在有Amp的培養(yǎng)板上篩選，正面朝上30 min，待菌液被培養(yǎng)基吸收后，將培養(yǎng)皿倒置，置于37 ℃細(xì)菌培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h。質(zhì)粒的抽提按E.Z.N.A.Endo-free Plasmid Mini Kit I試劑盒操作，得到的質(zhì)粒采用nanodrop2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)濃度。

真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染肺腺癌A549細(xì)胞：將A549細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞生長至80%～90%時(shí)，棄原培養(yǎng)液，每孔加入800 μL不含抗生素的含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，待轉(zhuǎn)染。取空載質(zhì)粒4 μg，β-catenin過表達(dá)質(zhì)粒4 μg，按Lip2000試劑盒步驟轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞置于CO2恒溫培養(yǎng)箱中5 h后，去除原培養(yǎng)基，更換含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。

2）MTT法檢測(cè)臭牡丹總黃酮對(duì)A549細(xì)胞增殖活性的影響：MTT法檢測(cè)不同濃度臭牡丹總黃酮對(duì)A549細(xì)胞增殖活性的影響：對(duì)數(shù)生長期的未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的A549細(xì)胞株，按5 000個(gè)/孔細(xì)胞鋪于96孔板。培養(yǎng)6～8 h待細(xì)胞充分貼壁后待用。將臭牡丹總黃酮浸膏溶于無菌水中，母液濃度為10 mg/mL。用含4%FBS的DMEM液稀釋母液，配成不同濃度的藥液。臭牡丹總黃酮濃度分別為0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mg/mL，共12個(gè)濃度。用不同濃度的藥液置換原培養(yǎng)液，每孔終體積200 μL，每組6個(gè)復(fù)孔，另設(shè)無細(xì)胞的培養(yǎng)基為空白對(duì)照孔。MTT法測(cè)活細(xì)胞數(shù)，測(cè)定各孔各孔的吸光度（A值），計(jì)算存活率。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。將IC50對(duì)應(yīng)的臭牡丹總黃酮濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的給藥濃度。存活率=實(shí)驗(yàn)組平均A值/對(duì)照組平均A值×100%。

MTT法檢測(cè)臭牡丹總黃酮對(duì)各組細(xì)胞增殖活性的影響：取對(duì)數(shù)生長期正常A549細(xì)胞、轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒細(xì)胞、轉(zhuǎn)染β-catenin過表達(dá)質(zhì)粒細(xì)胞，按1.3分組，5 000個(gè)/孔細(xì)胞鋪于96孔板。用無菌蒸餾水將臭牡丹總黃酮浸膏配成濃度為10 mg/mL的母液，再用含10%胎牛血清的完全DMEM培養(yǎng)基配成2 mg/mL的含藥溶液。待A549細(xì)胞生長密度達(dá)70%～80%時(shí)，B、D、F組分別加入含藥的完全培養(yǎng)基，A、C、E組加入不含藥物的完全培養(yǎng)基，每組每孔終體積200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用MTT法測(cè)活細(xì)胞數(shù)。

3）劃痕試驗(yàn)檢測(cè)臭牡丹總黃酮對(duì)A549細(xì)胞遷移能力的影響：用無菌蒸餾水將臭牡丹總黃酮浸膏配成濃度為10 mg/mL的母液，再用含10%胎牛血清的完全DMEM培養(yǎng)基配成2 mg/mL的含藥溶液。細(xì)胞按1.3分組。待細(xì)胞生長密度達(dá)70%～80%時(shí)，B、D、F組分別加入含藥的完全培養(yǎng)基，A、C、E組加入不含藥物的完全培養(yǎng)基，每孔終體積1 mL，于37 ℃，5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)48 h。待細(xì)胞長滿后用100 μL Tip頭沿培養(yǎng)板中軸均勻畫一直線，用DPBS洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，加入1%低血清培養(yǎng)基，放入恒溫CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。分別于0、24、48 h時(shí)間點(diǎn)在倒置顯微鏡下觀察刮痕內(nèi)的細(xì)胞，取樣，拍照。結(jié)果以各組劃痕培養(yǎng)后的劃痕區(qū)域閉合寬度占初始（0 h）劃痕區(qū)域?qū)挾鹊陌俜直葋肀硎尽Ｖ貜?fù)3次實(shí)驗(yàn)，取平均值。

4）Transwell小室侵襲檢測(cè)臭牡丹總黃酮對(duì)A549細(xì)胞侵襲力的影響：制備Transwell小室，吸取Matrigel膠160 μL加入320 μL無血清培養(yǎng)基中，按1∶2稀釋，即得480 μL，每個(gè)小室鋪膠60 μL，共制作8個(gè)小室。置37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)60分鐘使膠凝固。吸出小室內(nèi)殘余液體，每個(gè)小室加入70 μL無血清DMEM培養(yǎng)基，37 ℃ 30 min水化基底膜。細(xì)胞按1.3分組，將各組細(xì)胞常規(guī)消化，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105/mL。吸取200 μL到小室上室內(nèi)，下室加入含10%胎牛血清（FBS）的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)6 h。用無菌蒸餾水將臭牡丹總黃酮浸膏配成濃度為10 mg/mL的母液，再用含無血清培養(yǎng)基配成2 mg/mL的含藥溶液。B、D、F組分別加入含藥的完全培養(yǎng)基，A、C、E組加入不含藥物的無血清培養(yǎng)基，每孔終體積200 μL，于CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。棄去小室內(nèi)培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2遍。用濕棉簽擦盡上室面的Matrigel膠和細(xì)胞，丙酮：甲醇=1∶1，固定20 min，PBS洗2遍，用0.5%結(jié)晶紫染色5 min，用清水洗3遍上。倒置顯微鏡下觀察，隨機(jī)取個(gè)5視野計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，計(jì)算均值。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

5）Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞Wnt通路相關(guān)蛋白的表達(dá)：將細(xì)胞分為4組：pcDNA3.1組（轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒），pcDNA3.1+CMD組（轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒+臭牡丹總黃酮），β-Catenin組（轉(zhuǎn)染β-Catenin過表達(dá)質(zhì)粒），β-Catenin+CMD組（轉(zhuǎn)染β-catenin過表達(dá)質(zhì)粒+臭牡丹總黃酮）。待A549細(xì)胞生長密度達(dá)70%～80%時(shí)，加入2 mg/mL的臭牡丹含藥溶液，置于37 ℃，5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)48 h后進(jìn)行Western blot檢測(cè)。

用預(yù)冷的PBS洗滌1次，加入100 μLRIPA裂解液，反復(fù)吹打混勻，置于冰上，裂解30 min；將裂解完畢的細(xì)胞于4 ℃，12 000 r/min離心15 min，將上清分裝轉(zhuǎn)移至0.5 mL的離心管中。按照BCA蛋白定量試劑盒繪制蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，算出蛋白濃度。灌膠、上樣，根據(jù)蛋白定量的結(jié)果，每孔上樣5 μL已變性蛋白，電泳后轉(zhuǎn)膜。按β-catenin（92KD），GSK-3β（46KD），P-GSK-β（46KD），C-Myc（49KD），Cyclin D1（32KD），β-actin（42KD）所在位置進(jìn)行切膠。轉(zhuǎn)移至PVDF膜，β-catenin約110 min，GSK-3β約60 min，p-GSK-β約60 min，β-actin約60 min，c-myc約60 min，cyclin D1約40 min。載有蛋白質(zhì)條帶的膜在含有5%脫脂奶粉的TBST溶液中室溫封閉1 h，然后加入含有稀釋一抗（β-catenin 1∶1 000、GSK-3β 1∶1 000、P-GSK-3β 1∶1 000、C-Myc 1∶500、Cyclin D1 1∶500、β-actin 1∶4 000），4 ℃下振蕩孵育過夜。用1×TBST稀釋HRP標(biāo)記的二抗（Proteintech），稀釋比例1∶3 000，將PVDF膜放入雜交袋中與稀釋完畢二抗共同孵育45～60 min。洗滌后，采用ECL化學(xué)發(fā)光顯示液曝光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測(cè)臭牡丹總黃酮對(duì)A549細(xì)胞增殖活性的影響

2.1.1 MTT法檢測(cè)不同濃度臭牡丹總黃酮對(duì)A549細(xì)胞增殖活性的影響 臭牡丹總黃酮處理A549細(xì)胞48 h后，MTT檢測(cè)細(xì)胞活力顯示，A549細(xì)胞活力受到明顯抑制，隨著給藥濃度增加，細(xì)胞成活率下降，對(duì)細(xì)胞抑制作用增強(qiáng)，用SPSS 17.0計(jì)算其半數(shù)抑制率IC50約2.0 mg/mL，將該濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的給藥濃度。

2.1.2 MTT法檢測(cè)臭牡丹總黃酮對(duì)各組細(xì)胞增殖活性的影響 轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的細(xì)胞與正常細(xì)胞比較，增殖活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但β-Catenin過表達(dá)組細(xì)胞增殖活性明顯提高（P<0.05）；臭牡丹總黃酮可使各組細(xì)胞的增殖活性均明顯降低（P<0.05），對(duì)β-Catenin過表達(dá)組活性抑制尤為明顯（P<0.05）。見圖1、表1。

2.2 劃痕試驗(yàn)檢測(cè)臭牡丹總黃酮對(duì)A549細(xì)胞遷移能力的影響

給藥48 h后，與正常A549細(xì)胞比較，空載組的遷移率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但β-Catenin過表達(dá)組較空載組遷移率上升（P<0.05）。采用臭牡丹總黃酮干預(yù)后，正常A549細(xì)胞、空載細(xì)胞、β-catenin過表達(dá)細(xì)胞的遷移能力均明顯降低（P<0.05）。見圖2、表2。

2.3 Transwell檢測(cè)臭牡丹總黃酮對(duì)各組A549細(xì)胞侵襲力的影響

轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的細(xì)胞與正常細(xì)胞比較，侵襲活性無明顯差異，而轉(zhuǎn)染β-catenin過表達(dá)載體的細(xì)胞穿透人工基底膜的侵襲力明顯增強(qiáng)（P<0.05）。臭牡丹總黃酮可使空白組，空轉(zhuǎn)載體組，β-catenin過表達(dá)組細(xì)胞的侵襲力均明顯降低（P<0.05）。見圖3、表3。

2.4 Western blot檢測(cè)Wnt通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

Western blot分析結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染β-catenin過表達(dá)的A549細(xì)胞β-catenin、C-Myc、CyclinD1蛋白表達(dá)上調(diào)（P<0.05），P-GSK-3β蛋白表達(dá)下調(diào)（P<0.05）。采用臭丹總黃酮進(jìn)行干預(yù)后，空載組的β-catenin、C-Myc蛋白表達(dá)下調(diào)（P<0.05），過表達(dá)組β-catenin、C-Myc、CyclinD1蛋白表達(dá)下調(diào)（P<0.05），P-GSK-3β的蛋白表達(dá)上調(diào)（P<0.05）。見圖4。

3 討論

臭牡丹，性寒，具有“祛風(fēng)除濕、解毒散瘀、消腫止痛之功”，正符合肺癌“化瘀解毒”的中醫(yī)治療原則；另一方面臭牡丹具有一定的補(bǔ)益之力，重在補(bǔ)脾肺腎三臟，可治虛勞久咳，這與中醫(yī)所認(rèn)為的肺癌所致肺氣虛不斂而致虛咳，腎氣虛不納氣致虛喘，皆以補(bǔ)肺腎之氣以定咳喘，并且補(bǔ)土生金補(bǔ)益脾氣的治療大法不謀而合，是符合中醫(yī)藥治療肺癌用藥原則的中藥之一。臭牡丹現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)具有鎮(zhèn)靜催眠、局麻、鎮(zhèn)痛、抗炎、抑菌、抗腫瘤等作用。本課題組曾采用淋巴瘤Raji細(xì)胞與人肺腺癌A549細(xì)胞對(duì)臭牡丹提取物的黃酮部分、生物堿部分、水提液去黃酮部分、水提醇溶部分4個(gè)不同樣品進(jìn)行抗腫瘤實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)4個(gè)樣品均有不同程度的體外細(xì)胞毒作用，在綜合考慮4個(gè)組分的抗腫瘤強(qiáng)度、提取工藝等情況后，最終確定臭牡丹總黃酮為抗腫瘤有效組分之一，并對(duì)其抗腫瘤作用機(jī)制進(jìn)行研究。

Wnt/β-catenin通路參與腫瘤發(fā)生的機(jī)制涉及信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、凋亡以及細(xì)胞黏附等多方面。Wnt信號(hào)通路通過調(diào)控β-catenin而發(fā)揮作用，當(dāng)無Wnt/β-catenin信號(hào)時(shí)，胞質(zhì)中的Axin復(fù)合體處于穩(wěn)定狀態(tài)，β-catenin維持在較低水平。當(dāng)細(xì)胞中存在Wnt信號(hào)時(shí)，β-catenin即從axin/APC/GSK-3β組成的降解復(fù)合物分離，在細(xì)胞內(nèi)積聚并向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，與TCF/LEF結(jié)合，激活下游重要靶基因C-myc、CyclinD1、slug等的轉(zhuǎn)錄。經(jīng)典的Wnt通路激活與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4]。如Kras轉(zhuǎn)基因小鼠肺組織中的Wnt通路基因上調(diào)，可明顯增加腫瘤發(fā)生的概率[5]。在肺癌瘤組織中，Wnt通路的相關(guān)因子Wnt-1存在過表達(dá)[6]。相反，如果下調(diào)Wnt信號(hào)通路，可促進(jìn)肺癌細(xì)胞的凋亡、抑制腫瘤擴(kuò)散和異種移植瘤生長，減少細(xì)胞活性和侵襲性，誘導(dǎo)表型分化，胞質(zhì)β-catenin和存活素表達(dá)下降，TCF依賴的轉(zhuǎn)錄活性降低[7-8]。

β-catenin為胞質(zhì)中一個(gè)多功能蛋白，是wnt/β-catenin信號(hào)通路途徑中具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的關(guān)鍵成員，研究證實(shí)β-catenin蛋白的過表達(dá)、細(xì)胞定位變化及基因突變等是肺癌發(fā)生的重要原因。如曾凡軍等[9]認(rèn)為阻止β-catenin蛋白異常表達(dá)以防止肺癌的發(fā)生、發(fā)展可能是治療肺癌的新策略，為肺癌表觀遺傳干預(yù)治療開辟一條新途徑。Han等[10]研究表明，舒林酸抑制肺癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其凋亡的作用是通過抑制β-catenin的轉(zhuǎn)錄而實(shí)現(xiàn)的。

GSK-3β是哺乳類動(dòng)物胞質(zhì)內(nèi)的一個(gè)Ser/Thr激酶，GSK3β對(duì)腫瘤細(xì)胞具有抑癌與促癌的雙重調(diào)節(jié)作用[11]。GSK-3β的抑癌作用主要表現(xiàn)在其作為Wnt信號(hào)通路的一個(gè)重要的負(fù)調(diào)控因子。GSK-3β的失活將在核內(nèi)外啟動(dòng)Wnt信號(hào)途徑，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。相反，上調(diào)GSK-3β的活性可以抑制Wnt信號(hào)從而減少腫瘤的發(fā)生[12]。GSK-3β對(duì)肺癌主要表現(xiàn)為抑癌作用，表現(xiàn)為GSK3β失活，而GSK-3βpSer9過表達(dá)的情況。王革平和陳莉[13]研究發(fā)現(xiàn)磷酸化PGSK-3β可促進(jìn)肺癌的演進(jìn)過程，與肺癌的分化、分期相關(guān)。曾靜等[14]采用免疫組化方法檢測(cè)pGSK-3β在111例非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者肺癌組織中的表達(dá)，陽性表達(dá)pGSK-3β的部分患者平均中位生存時(shí)間明顯縮短，認(rèn)為pGSK-3β陽性表達(dá)可作為NSCLC獨(dú)立預(yù)后的危險(xiǎn)因素經(jīng)證實(shí)GSK3β在口腔癌、食管癌、鼻咽癌等多種腫瘤中均起到抑癌作用[15]。C-myc與CyclinD 1 C-myc是決定細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期的開關(guān)，是較早出現(xiàn)的細(xì)胞惡化的分子標(biāo)志，與肺癌啟動(dòng)、惡性增生密切相關(guān)[16]。正常情況下，c-myc基因不顯示轉(zhuǎn)錄活性或低水平表達(dá)，只有受某些因子激活時(shí)，c-myc基因才大量表達(dá)，使細(xì)胞由靜止期進(jìn)入增殖期，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、浸潤與轉(zhuǎn)移[17-18]。Cyclin D1為原癌基因，其過表達(dá)和失調(diào)控均可導(dǎo)致細(xì)胞，周期調(diào)控異常，從而發(fā)生腫瘤。β-catenin/Tcf的復(fù)合物可直接刺激CDKs的活性，通過cyclinD 1上調(diào)促進(jìn)細(xì)胞異常增生。本實(shí)驗(yàn)顯示，β-catenin可以成功轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞增殖、遷移、侵襲力均增強(qiáng)，并可通過調(diào)控Wnt通路相關(guān)因子β-catenin、P-GSK-3β、c-myc、cyclinD1的表達(dá)而激活Wnt/β-catenin通路，可證實(shí)β-catenin在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定過表達(dá)是激活Wnt通路的起始因子。臭牡丹總黃酮可抑制A549細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲力，并通過調(diào)節(jié)上述因子的表達(dá)，具有抑制Wnt/β-catenin通路的傾向，其作用在β-catenin過表達(dá)組尤為明顯。由此可推測(cè)臭牡丹總黃酮抗腫瘤的可能機(jī)制是通過抑制細(xì)胞內(nèi)β-catenin的過表達(dá)從而調(diào)節(jié)下游多種因子，抑制Wnt通路而起作用。另外，由于GSK-3β在具有促癌與抑癌的雙向調(diào)節(jié)作用，在本實(shí)驗(yàn)中GSK-3β的蛋白表達(dá)在各組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而P-GSK-3β則在β-catenin過表達(dá)組表現(xiàn)為下調(diào)，在臭牡丹總黃酮組表現(xiàn)為表達(dá)上調(diào)，其內(nèi)在機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

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