蘇氨酸鐵對缺鐵性貧血大鼠 鐵營養(yǎng)狀況的改善

李 虎,謝明勇,王光然,虞俊翔,易成意,胡曉波

(南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330047)

鐵是人和動物體內(nèi)不可或缺的微量元素之一,鐵缺乏或利用障礙均會導(dǎo)致貧血發(fā)生,若患者僅為輕度貧血,通過日常飲食及藥物幫助可恢復(fù)正常[1]。缺鐵性貧血(IDA)是貧血的一種,是當(dāng)前世界范圍內(nèi)患病率較高的營養(yǎng)性疾病,特別是在發(fā)展中國家[2-3]。一般情況下,較低的膳食鐵含量和生物利用率易造成鐵缺乏,使紅細(xì)胞中血紅蛋白(Hb)含量大幅減少,進(jìn)而降低紅細(xì)胞數(shù)目,造成細(xì)胞及組織供氧不足,最終出現(xiàn)缺鐵性貧血[4-5]。

通過對膳食中鐵含量進(jìn)行強(qiáng)化來預(yù)防和治療鐵缺乏被廣泛地認(rèn)為是最為有效的方法[6]。傳統(tǒng)鐵強(qiáng)化劑或多或少地存在鐵腥味,對胃腸道的刺激性較大,生物利用率也不理想[7],因此有必要開發(fā)新型補(bǔ)鐵制劑。氨基酸鐵螯合物具有溶解性好、穩(wěn)定性強(qiáng)、吸收快、無毒害作用、無刺激性等特點(diǎn),具有較高的生物利用率和生物學(xué)效價[8-10]。在治療和改善IDA時,氨基酸螯合鐵具有優(yōu)于無機(jī)鐵和有機(jī)酸鐵的應(yīng)用性能[11]。Cristina lost等[12]針對IDA兒童研究發(fā)現(xiàn),食用氨基酸螯合鐵強(qiáng)化的液體奶可以緩解IDA兒童Hb水平較低的癥狀。江素梅[13]在預(yù)防仔豬貧血的研究中對仔豬或母豬飼喂氨基酸鐵,能直接或間接預(yù)防仔豬貧血,提高免疫力。

實(shí)驗(yàn)以初斷乳斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?SD)大鼠建立IDA模型,通過對IDA大鼠補(bǔ)充蘇氨酸鐵(Thr-Fe),并以硫酸亞鐵為陽性對照,對低鐵膳食補(bǔ)充Thr-Fe改善IDA大鼠鐵營養(yǎng)狀況及其對血液理化指標(biāo)水平的改善效果展開研究,從而為Thr-Fe在改善和糾正IDA的應(yīng)用中提供理論和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級初斷乳SD大鼠 雄性,36 只,3 周齡,體重(69.30±5.28) g,健康狀況良好,符合實(shí)驗(yàn)所需的質(zhì)量要求,許可證號:SCXK(湘)2013-0004,湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司;蘇氨酸鐵 淺綠色粉末,亞鐵含量為12.07%,南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研制;七水合硫酸亞鐵 分析純,亞鐵含量為19.88%,西隴化工股份有限公司;普通飼料 鐵含量為260 mg/kg,成分:玉米粉58.5%,麥麩7.5%,豆粕23.5%,進(jìn)口蒸汽紅魚粉3.0%,蔗糖3.0%,大豆油2.0%,乳脂粉2.0%,預(yù)混料3.5%,湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司;低鐵飼料 鐵含量<10 mg/kg,成分:EDTA處理酪蛋白15%,大米粉70%,玉米油5%,AIN-76M混合礦物鹽3.5%,AIN-76M混合維生素1%,氯化膽堿0.2%,明膠5%,DL-蛋氨酸0.3%,北京博泰宏達(dá)生物技術(shù)有限公司;原卟啉標(biāo)準(zhǔn)品 純度≥ 95%,上海麥克林生化科技有限公司;大鼠血紅蛋白酶聯(lián)免疫分析試劑盒 上海撫生實(shí)業(yè)有限公司;大鼠總鐵結(jié)合力ELISA試劑盒、大鼠轉(zhuǎn)鐵蛋白ELISA試劑盒、大鼠鐵蛋白ELISA試劑盒 南京翼飛雪生物科技有限公司。

超低溫冰箱 日本Sanyo公司;普通臺式離心機(jī) 德國Eppendorf公司;臺式低溫高速離心機(jī) 德國Heraeus公司;OLYMPUS AU640全自動生化分析儀 日本奧林巴斯電氣化學(xué)公司;渦旋振蕩器 常州萬合儀器制造有限公司;E-330多功能酶標(biāo)儀 美國Thermo公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SD大鼠IDA模型建立 實(shí)驗(yàn)采用不銹鋼籠及塑料水罐避免鐵元素的污染,大鼠自主飲水采食,控制室溫22 ℃左右,每日給予12 h光照,室內(nèi)換氣次數(shù)約12 次/h。適應(yīng)環(huán)境3 d后,選用健康初斷乳SD大鼠30只,飼予低鐵飼料及去離子水建立缺鐵性貧血模型。自第3周開始,每隔5 d隨機(jī)選取部分大鼠(20只),眼眶后靜脈叢采血,測定Hb。若Hb<100 g/L,則認(rèn)為該實(shí)驗(yàn)動物已發(fā)生缺鐵性貧血。當(dāng)隨機(jī)選取的大鼠全部達(dá)到恢復(fù)實(shí)驗(yàn)要求(即Hb<100 g/L)時,認(rèn)為建模成功,此時測定全部大鼠Hb并稱重,記錄體重。

1.2.2 SD大鼠IDA恢復(fù)實(shí)驗(yàn) 選取Hb<100 g/L的大鼠30只,根據(jù)Hb水平及體重將其隨機(jī)分為Thr-Fe低、中、高劑量組、陽性對照組和低鐵對照組,每組6只,均繼續(xù)給予低鐵飼料;另設(shè)空白對照組,6只,給予普通飼料。Thr-Fe低、中、高劑量組分別給8、16、32 mg/kg·bw 的Thr-Fe,陽性對照組給予32 mg/kg·bw硫酸亞鐵,低鐵對照組和空白對照組給予相應(yīng)溶劑(新沸冷卻超純水,現(xiàn)用現(xiàn)配),容積為1.0 mL/100 g·bw,采用灌胃給藥的方式,每天1次。受試樣品給予時間為21 d,每周測定兩次體重及Hb,并根據(jù)體重調(diào)整灌胃的容積。采集血液樣品之前,實(shí)驗(yàn)動物需禁食12 h。日常采血選擇眼眶后靜脈叢采血,實(shí)驗(yàn)動物處死前選擇摘眼球采血,采集到的血液樣品置于EDTA抗凝管中,部分血液離心制備血清,4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 測定指標(biāo)

1.2.3.1 實(shí)驗(yàn)動物一般情況 觀察實(shí)驗(yàn)過程中SD大鼠的精神狀態(tài)、活動能力、被毛等情況,稱量各組大鼠體重。

1.2.3.2 血液學(xué)指標(biāo) 使用大鼠血紅蛋白酶聯(lián)免疫分析試劑盒,采用雙抗體夾心法測定IDA大鼠血液的Hb水平。利用全自動生化分析儀測定血紅細(xì)胞(RBC)計(jì)數(shù)、白細(xì)胞(WBC)計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞比容(HCT)、平均紅細(xì)胞體積(MCV)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量(MCH)、紅細(xì)胞分布寬度(RDW)。

1.2.3.3 紅細(xì)胞內(nèi)游離原卟啉含量(FEP) 參照楊煥民等[14-15]關(guān)于仔豬紅細(xì)胞內(nèi)游離原卟啉微量測定法及正常值探討的相關(guān)報(bào)道,采用熒光分光光度法測定FEP。

1.2.3.4 血清鐵蛋白(SF)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(TRF)、總鐵結(jié)合力(TIBC) 使用大鼠鐵蛋白ELISA試劑盒、大鼠轉(zhuǎn)鐵蛋白ELISA試劑盒、大鼠總鐵結(jié)合力ELISA試劑盒,采用雙抗體夾心法測定IDA大鼠血清樣品中SF、TRF及TIBC水平。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)動物一般情況分析

IDA模型建立期間,模型組與空白對照組相比采食量下降,體重增加緩慢,活動能力降低,易脫毛,且模型組部分大鼠出現(xiàn)毛發(fā)成片脫落現(xiàn)象?；謴?fù)實(shí)驗(yàn)期間,Thr-Fe劑量組以及陽性對照組實(shí)驗(yàn)動物與空白對照組比較精神狀態(tài)均出現(xiàn)一定程度的萎靡,毛發(fā)粗糙凌亂、無光澤,可能由于恢復(fù)實(shí)驗(yàn)期短,而實(shí)驗(yàn)動物皮毛狀況的改善需要較長時間。

2.2 Thr-Fe對IDA大鼠體重的影響

IDA模型建立初始時間記為第0 d,恢復(fù)實(shí)驗(yàn)初試時間記為第1 d。實(shí)驗(yàn)期間動物體重變化見表1。

表1 IDA大鼠體重Table 1 Body weight of IDA

恢復(fù)實(shí)驗(yàn)過程中,各模型組間體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)?；謴?fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時,低鐵對照組大鼠體重較空白對照組差異極顯著(p<0.01),Thr-Fe高劑量組較低鐵對照組,差異顯著(p<0.05),各模型組中Thr-Fe高劑量組增量最高,且與陽性對照組和低鐵對照組相比,體重增量的差異極顯著(p<0.01)。其他模型組間大鼠的體重增量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明IDA對實(shí)驗(yàn)動物體重有重要影響;較硫酸亞鐵,高劑量Thr-Fe鐵能明顯改善IDA大鼠體重增長緩慢的癥狀,與劉衛(wèi)東等[16]在斷奶仔豬實(shí)驗(yàn)組飼糧中添加0.05%甘氨酸亞鐵,實(shí)驗(yàn)組較對照組(無機(jī)鐵)日增重提高9.1%的研究結(jié)果一致。由此推斷,高劑量Thr-Fe作為補(bǔ)鐵劑改善和糾正IDA時,可以促進(jìn)患者體重增長且效果優(yōu)于硫酸亞鐵。

2.3 Thr-Fe對IDA大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響

2.3.1 恢復(fù)實(shí)驗(yàn)期間Thr-Fe對IDA大鼠Hb水平的影響 實(shí)驗(yàn)動物在恢復(fù)實(shí)驗(yàn)期間Hb含量變化見表2。

表2 恢復(fù)實(shí)驗(yàn)期間IDA大鼠血紅蛋白含量Table 2 Hb content in IDA rats during recovery

鐵制劑干預(yù)的IDA大鼠血液Hb隨恢復(fù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行呈上升趨勢,且隨劑量的增加,Thr-Fe劑量組間相比,Hb含量也增高?；謴?fù)實(shí)驗(yàn)第15 d,Thr-Fe低、中、高劑量組和陽性對照組的Hb水平較低鐵對照組分別增高了12.83%、29.15%、40.06%和27.73%(p<0.01),第21 d,則分別增高了22.30%、37.68%、56.88%和39.79%(p<0.01)。Thr-Fe高劑量組的Hb含量于恢復(fù)實(shí)驗(yàn)第21 d較空白對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05),較陽性對照組增高了13.16%(第15 d,p<0.05)和12.23%(第21 d,p<0.05)。結(jié)果表明,連續(xù)補(bǔ)充一定劑量Thr-Fe可提高大鼠血液Hb水平,改善血液狀況,與丁科等[17]關(guān)于甘氨酸亞鐵可明顯增加IDA大鼠血液Hb含量且效果優(yōu)于硫酸亞鐵的研究結(jié)論一致。Thr-Fe對IDA大鼠血液Hb的改善作用與劑量呈正相關(guān),此外Thr-Fe的應(yīng)用性能優(yōu)于硫酸亞鐵。

2.3.2 Thr-Fe對IDA大鼠血常規(guī)檢查指標(biāo)的影響 血常規(guī)指標(biāo)是大鼠喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的一項(xiàng)重要內(nèi)容[18],也是判斷外源性受試物是否對動物血液組織造成影響的重要依據(jù)[19]。通過全自動生化分析儀測定各組大鼠血液中RBC、WBC、HCT、MCV、MCH、RDW指標(biāo),測定結(jié)果見表3。

表3 大鼠血常規(guī)測定結(jié)果Table 3 Results of the blood routine examination of the

各Thr-Fe劑量組IDA大鼠間以及與陽性對照組比較,血常規(guī)指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。低鐵對照組大鼠各指標(biāo)較空白對照組差異極顯著(p<0.01)。鐵制劑干預(yù)各組的RBC、WBC、HCT、MCV、MCH較低鐵對照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義:Thr-Fe各劑量組和陽性對照組RBC、MCV、MCH升高極顯著(p<0.01),Thr-Fe高劑量組和陽性對照組WBC升高極顯著(p<0.01),Thr-Fe低、中劑量組升高顯著(p<0.05)。鐵制劑干預(yù)各組的RDW值較低鐵對照組明顯改善,分布寬度變窄。鐵制劑干預(yù)的各組大鼠血常規(guī)指標(biāo)較低鐵對照組有明顯糾正,RBC、WBC增加,MCV、HCT等值變大,RDW明顯降低,接近于空白對照組,紅細(xì)胞形態(tài)差異減小,缺鐵癥狀得到改善。這與袁明貴等[20]關(guān)于甘氨酸鐵絡(luò)合物對杜長大仔豬血常規(guī)指標(biāo)具有改善作用的研究結(jié)論一致。

2.4 Thr-Fe對IDA大鼠血液FEP水平的影響

恢復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,各組大鼠FEP含量測定結(jié)果見表4。

表4 IDA大鼠紅細(xì)胞內(nèi)游離原卟啉 含量測定結(jié)果Table 4 Results of FEP of IDA

低鐵對照組大鼠FEP含量顯著高于空白對照組(p<0.01),鐵制劑干預(yù)各組FEP含量較低鐵對照組差異極顯著(p<0.01),Thr-Fe高劑量組和陽性對照組大鼠FEP含量分別降低了28.59%和28.03%,接近空白對照組。Thr-Fe各劑量組大鼠FEP水平與陽性對照組相比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。隨劑量增加,Thr-Fe劑量組大鼠FEP含量降低,與劑量呈負(fù)相關(guān)。FEP含量是表征鐵缺乏的可靠指標(biāo)之一,從補(bǔ)充Thr-Fe和硫酸亞鐵使細(xì)胞內(nèi)游離FEP含量顯著下降,可以推斷IDA大鼠體內(nèi)耗竭的功能鐵得到部分恢復(fù),促進(jìn)了機(jī)體血紅素的合成,改善了鐵營養(yǎng)狀況,缺鐵性貧血造成的機(jī)體鐵依賴性生理功能損傷得到緩解。

2.5 Thr-Fe對IDA大鼠SF、TRF、TIBC的影響

恢復(fù)實(shí)驗(yàn)后,各組大鼠血清SF、TRF、TIBC測定結(jié)果見表5。

表5 Thr-Fe對IDA 大鼠SF、TRF、TIBC的影響(n=6,x±s) Tab 5 Effects of Thr-Fe on the SF、TRF、TIBC levels IDA rats(n=6,x±s)

低鐵對照組大鼠SF、TRF、TIBC較空白對照組差異顯著(p<0.05)。較低鐵對照組,Thr-Fe高劑量組和陽性對照組大鼠SF含量分別顯著性升高26.94%(p<0.01)和22.85%(p<0.05)。Thr-Fe高劑量組TRF含量較低鐵對照組降低了26.74%(p<0.01),接近空白對照組(p>0.05),各Thr-Fe處理組大鼠的血清TRF含量隨劑量的增加呈降低趨勢。較低鐵對照組,各劑量組血清TIBC均有不同程度的降低,且隨Thr-Fe劑量的增加呈降低趨勢,其中Thr-Fe高劑量組TIBC較低鐵對照組下降了21.63%(p<0.05),接近空白對照組。血清鐵蛋白中鐵主要以Fe3+的形式存在,通過Fe2+攝取或Fe3+釋放來調(diào)節(jié)機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)[21],同時轉(zhuǎn)鐵蛋白參與鐵在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝,機(jī)體健康變化會導(dǎo)致轉(zhuǎn)鐵蛋白含量的變化[22]。通過鐵元素的補(bǔ)充,SF合成增加,TRF合成減少,TIBC降低,較低鐵劑量組均有較為顯著的改善,特別是高劑量的Thr-Fe使IDA大鼠在短期內(nèi)SF、TRF和TIBC水平達(dá)到正常范圍,有效地促進(jìn)了機(jī)體內(nèi)鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)和貯存。

3 討論

鐵缺乏致使與鐵有關(guān)的多種酶活降低,影響機(jī)體氧化還原等生理過程[23-24],對免疫、消化及內(nèi)分泌等系統(tǒng)均產(chǎn)生較大負(fù)面影響[25],患者易出現(xiàn)焦慮、沮喪等情緒。模型建立及恢復(fù)實(shí)驗(yàn)過程中,受鐵缺乏的影響,模型組大鼠較空白對照組表現(xiàn)出采食減少,體重增加緩慢,活動能力低,易脫毛,精神萎靡等現(xiàn)象,表明IDA對實(shí)驗(yàn)動物有一定影響。通過對各模型組分別飼喂Thr-Fe和硫酸亞鐵,大鼠體重增加狀況較低鐵劑量組均有明顯改善,這與王明鎮(zhèn)等發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充氨基酸螯合鐵可有效增加斷奶仔豬體重的結(jié)論一致[26]。這可能與隨著鐵元素的補(bǔ)充,大鼠體內(nèi)鐵營養(yǎng)狀況改善,與鐵有關(guān)的酶活逐漸恢復(fù)并發(fā)揮正常生化作用,從而大鼠紊亂的生理代謝活動得到糾正有關(guān)。

實(shí)驗(yàn)期間針對模型組大鼠飼喂低鐵飼料,造成早期的營養(yǎng)性鐵缺乏,進(jìn)而影響血紅素生成不足,未能與鐵結(jié)合的FEP含量增高[27],Hb合成量減少,大鼠紅細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白含量不足,紅細(xì)胞間差異變大,RDW值升高[28],MCH、MCV等值降低,此外,中性粒細(xì)胞殺菌能力下降,淋巴細(xì)胞功能受損[29],WBC一定程度降低。缺鐵對細(xì)胞分裂增殖影響較小,故RBC減少程度不如Hb明顯?；謴?fù)實(shí)驗(yàn)中,鐵元素經(jīng)小腸上皮細(xì)胞吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)后,與紅細(xì)胞內(nèi)游離的原卟啉結(jié)合,FEP值降低,血紅素合成量增加,以血紅素為合成原料的Hb含量升高,大鼠血常規(guī)指標(biāo)恢復(fù)到與王蕊[30]等報(bào)道的10～12 周齡SD大鼠血常規(guī)指標(biāo)參考水平趨近一致。

血清鐵蛋白復(fù)合物在一定程度上維持血紅蛋白的穩(wěn)態(tài),當(dāng)鐵儲備不足時,合成的鐵蛋白降低,TIBC升高,轉(zhuǎn)鐵飽和度降低[31]。鐵制劑的補(bǔ)充促進(jìn)了大鼠體內(nèi)血清鐵蛋白復(fù)合物生成,儲備鐵含量增加,轉(zhuǎn)鐵蛋白含量和總鐵結(jié)合力下降,結(jié)果與張文飛研究報(bào)道的甘氨酸亞鐵能顯著提高血清中鐵飽和度和血液中鐵含量一致[32]。

4 結(jié)論

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論可知,不同劑量Thr-Fe對IDA大鼠各項(xiàng)指標(biāo)的影響有一定差異,高劑量Th-Fe較中、低劑量對大鼠鐵營養(yǎng)狀況的改善作用更明顯,實(shí)驗(yàn)結(jié)束時的各項(xiàng)指標(biāo)更接近空白對照組;高劑量Thr-Fe組大鼠較陽性對照組鐵營養(yǎng)狀況改善較好,這可能與Thr-Fe較硫酸亞鐵穩(wěn)定性更強(qiáng)、吸收利用率更高有關(guān)。

綜上所述,低鐵膳食補(bǔ)充Thr-Fe可以改善IDA大鼠的鐵營養(yǎng)狀況,提高功能鐵、貯存鐵水平,促進(jìn)機(jī)體內(nèi)鐵運(yùn)轉(zhuǎn),另外對體重、血液品質(zhì)具有一定改善作用,改善效果與補(bǔ)充劑量呈相關(guān)性,并且高劑量Thr-Fe作用效果優(yōu)于硫酸亞鐵。因此,Thr-Fe作為鐵營養(yǎng)強(qiáng)化劑應(yīng)用于改善和糾正IDA具有廣泛的前景。