杏仁蛋白的兩級泡沫分離工藝優(yōu)化

路 帥,孫培冬,季曉彤,孫菡崢

(1.江南大學(xué)食品膠體與生物技術(shù)教育部重點實驗室,江蘇無錫 214122; 2.江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院,江蘇無錫 214122)

杏仁是薔薇科杏(AmygdalusCommunisVas)的種子,營養(yǎng)價值豐富,每100 g杏仁中含有蛋白質(zhì)25～27 g、油脂47～56 g、碳水化合物及粗纖維12～19 g,另外還富含多種礦質(zhì)元素和維生素[1-2],經(jīng)脫苦去毒等初步加工后,即可用于食品。另外,杏仁亦具有藥用價值,如祛風(fēng)寒、止咳、治療哮喘、消腫通氣、降血脂等[2],但這些作用目前遠未得到充分應(yīng)用。近年來,蛋白質(zhì)水解所得的多肽由于具有特殊的營養(yǎng)及多種生物活性[3-5],已成為當(dāng)今生命科學(xué)研究的熱點之一。有研究發(fā)現(xiàn),杏仁蛋白酶解得到的多肽具有抗疲勞、調(diào)節(jié)激素分泌、調(diào)節(jié)生理代謝、促進礦質(zhì)吸收、增進免疫調(diào)節(jié)、降血壓、抗氧化等特性[3-5]。因此,有效地提取、純化杏仁蛋白,有利于進一步制備生物活性多肽,提高杏仁產(chǎn)品的附加值,擴大杏仁的工業(yè)應(yīng)用范圍。

目前提取杏仁蛋白傳統(tǒng)方法主要是堿溶酸沉法[6],但較長時間的熱堿液浸提不僅會造成蛋白質(zhì)的變性和有害物質(zhì)的生成,另外在調(diào)節(jié)pH的過程中還會引入較多的無機鹽,對蛋白后續(xù)加工利用造成不良影響[7]。因為杏仁蛋白由于具有良好的起泡性和泡沫穩(wěn)定性[7],可以采用泡沫分離法進行提取純化。泡沫分離法[8]是根據(jù)表面吸附原理,通過向溶液中鼓泡,使具有表面活性的溶質(zhì)或顆粒吸附到氣-液界面上,以氣泡為載體與液相主體進行分離的方法,由于蛋白質(zhì)分子具有表面活性,所以可采用泡沫分離法實現(xiàn)分離純化[9]。與其它蛋白分離方法相比,泡沫分離法污染小、操作條件溫和、不破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和生物活性。目前,泡沫分離法已應(yīng)用于提取免疫球蛋白[10]、大豆蛋白[11]、桑葉蛋白[12]、亞麻蛋白[13]等。

本文采用兩級泡沫分離法提取杏仁蛋白,對提取條件進行優(yōu)化,并應(yīng)用田口實驗設(shè)計法確定提高杏仁蛋白質(zhì)量分數(shù)和回收率的最優(yōu)條件,旨在為杏仁蛋白的大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杏仁 河北承德市農(nóng)貿(mào)市場;石油醚、鹽酸、對硝基苯酚、硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、氫氧化鈉、乙酸鈉、乙酸、甲醛、乙酰丙酮 分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

TU-1900型紫外-可見光分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;LZB型玻璃轉(zhuǎn)子流量計 南京順來達測控設(shè)備有限公司;PHS-25型pH計 上海精密儀器制造有限公司;ME203E型電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;LDZ4-2型自動平衡離心機 江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠;LyoQuest-85型冷凍干燥機 西班牙Telstar公司;泡沫分離裝置 自制,包括氮氣瓶、玻璃轉(zhuǎn)子流量計、氣體分布器、泡沫分離柱、泡沫收集器,泡沫分離柱為有機玻璃制成,內(nèi)徑35 mm,柱高600 mm,分離柱底部安裝氣體分布器。

1.2 實驗方法

1.2.1 杏仁原料脫脂預(yù)處理 參考文獻[14],取一定量的杏仁干燥、粉碎后過80目篩,以石油醚(料液比1∶10)浸提6 h脫脂,重復(fù)浸提3次后干燥得到脫脂后的杏仁粕,置于-4 ℃冰箱中冷藏備用。

1.2.2 杏仁原料成分的測定 水分含量的測定:直接干燥法(GB 5009.3-2016)[15];脂肪含量的測定:索氏抽提法(GB 5009.6-2016)[16];蛋白質(zhì)含量的測定:凱氏定氮法(GB 5009.5-2016)[17];灰分含量的測定:灼燒法(GB 5009.4-2016)[18];多糖含量的測定:苯酚-硫酸法(SN/T 4260-2015)[19]。

1.2.3 杏仁蛋白的泡沫分離工藝 將按照1.2.1中方法制得的杏仁粕用去離子水配制成不同進料濃度的料液500 mL,以稀鹽酸調(diào)節(jié)進料的pH,料液倒入泡沫分離柱中后通入氮氣,以轉(zhuǎn)子流量計測量氣速。泡沫收集器中的泡沫采用攪拌法消泡,消泡后調(diào)節(jié)pH7,置于冰箱-25 ℃冷凍2 h,然后將冷凍樣品放入冷凍干燥機中,-50 ℃冷凍干燥48 h后取出并研磨成杏仁蛋白粉。

1.2.4 杏仁蛋白等電點測定 參照文獻[20],用去離子水將杏仁蛋白配制成料液比1∶5的懸濁液,攪拌2 h后離心20 min取上清液。用NaOH溶液或 HCl溶液將上清液的pH從1間隔1依次調(diào)至12,在320 nm波長處用分光光度計測量吸光度,吸光度最大時的pH即為杏仁蛋白等電點。

1.2.5 杏仁蛋白質(zhì)回收率的計算

式中:Pf-杏仁蛋白粉的蛋白質(zhì)量分數(shù),%;Pi-杏仁粕的蛋白質(zhì)量分數(shù),%;Mf-杏仁蛋白粉質(zhì)量,g;Mi-杏仁粕的質(zhì)量,g。

1.2.6 單因素實驗 采用1.2.3的工藝提取杏仁蛋白,固定提取條件為進料濃度6 g·L-1、鼓泡氣速400 mL·min-1、鼓泡時間20 min,考察不同進料pH(3、4、5、6、7)對蛋白質(zhì)量分數(shù)和回收率的影響;固定條件為進料pH4、鼓泡氣速400 mL·min-1、鼓泡時間20 min,考察不同進料濃度(2、4、6、8、10 g·L-1)對蛋白質(zhì)量分數(shù)和回收率的影響;固定提取條件為進料pH4、進料濃度為6 g·L-1、鼓泡時間為20 min,考察不同鼓泡氣速(200、300、400、500、600 mL·min-1)對蛋白質(zhì)量分數(shù)和回收率的影響;固定提取條件為進料pH4、進料濃度為6 g·L-1、鼓泡氣速為400 mL·min-1,考察不同鼓泡時間(10、15、20、25、30 min)對蛋白質(zhì)量分數(shù)和回收率的影響。

1.2.7 田口方法優(yōu)化泡沫分離工藝 在單因素實驗的基礎(chǔ)上,采用田口方法進一步優(yōu)化泡沫分離工藝,設(shè)計條件不同的9個實驗,每個實驗重復(fù)3次。

田口方法將各品質(zhì)特性轉(zhuǎn)化為信噪比(S/N),質(zhì)量特性越好的設(shè)計方案其信噪比也越大,利用信噪比找出品質(zhì)特性最佳且變異最小的設(shè)計方案[21]。信噪比代表的質(zhì)量特性分為望小特性、望大特性和望目特性。當(dāng)研究目的是減少圍繞目標(biāo)值的變異時,采用望目特性;如果質(zhì)量特性為越大越好,采用望大特性;如果質(zhì)量特性為越小越好,采用望小特性[22]。泡沫分離杏仁蛋白的回收率和質(zhì)量分數(shù)都是越大越好,故采用望大特性進行研究,其信噪比計算公式為:

式中:S/N為信噪比,yi為第i次實驗結(jié)果,n為實驗重復(fù)次數(shù)。

田口方法首先采用正交表安排實驗,以信噪比(S/N)作為衡量產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性的指標(biāo),找出抗干擾能力強、性能穩(wěn)定的最佳參數(shù)水平組合。本文所選因素及水平采用L9(34)正交表安排實驗,見表1。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Independent variables and their levels used in the orthogonal test

1.2.8 兩級泡沫分離工藝 采用田口方法優(yōu)化后的實驗方案對杏仁粕進行兩級泡沫分離,由于實驗?zāi)康氖亲畲笙薅鹊丶兓尤实鞍?故選擇使蛋白質(zhì)量分數(shù)最高的實驗方案。將杏仁粕按照優(yōu)化后的實驗方案進行泡沫分離后冷凍干燥得到一級泡沫分離杏仁粉。一級泡沫分離杏仁粉按照相同的實驗條件再進行泡沫分離后冷凍干燥得到二級泡沫分離杏仁粉。分別測量杏仁粕、一級泡沫分離杏仁粉和二級泡沫分離杏仁粉的質(zhì)量及蛋白質(zhì)量分數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Minitab 17.0軟件進行田口實驗設(shè)計及數(shù)據(jù)處理,Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫脂后杏仁粕的主要成分

由表2可見,杏仁脫脂后脂肪含量僅為6.96%,脫脂效果較為明顯。由于油脂與蛋白質(zhì)結(jié)合會使杏仁極易氧化酸敗,且脂質(zhì)次級氧化產(chǎn)物會損壞氨基酸序列,因此,脫脂可防止蛋白發(fā)生腐壞變性[23]。

表2 杏仁粕主要成分Table 2 The main composition of almond cake

2.2 杏仁蛋白等電點的測定

蛋白質(zhì)等電點的測定,有利于研究pH對泡沫分離杏仁蛋白的影響。由圖1可知,杏仁蛋白提取液經(jīng)離心分離后,pH的變化使得上清液的吸光度之變化,隨著pH的增加,吸光度先增加后降低,在pH為4時達到峰值,故杏仁蛋白等電點為4。

圖1 杏仁蛋白等電點的測定Fig.1 Determination of isoelectric point of almond protein

2.3 杏仁蛋白泡沫分離的單因素實驗

2.3.1 進料 pH對杏仁蛋白泡沫分離效果的影響 形成穩(wěn)定的泡沫是進行泡沫分離的先決條件。而泡沫穩(wěn)定性主要取決于泡沫液膜的表面粘度、彈性和表面張力。降低表面張力可以提高泡沫的穩(wěn)定性,穩(wěn)定的泡沫可以使分離過程持續(xù)至殘留液相濃度很低的狀態(tài)[24]。由圖2可知,在杏仁蛋白等電點處即pH4處進行的泡沫分離得到的產(chǎn)物回收率和蛋白質(zhì)量分數(shù)均最大,而當(dāng)pH偏離等電點時,蛋白質(zhì)的回收率和質(zhì)量分數(shù)均下降,這是由于在蛋白等電點處體系處于表面張力較低的狀態(tài)。為了純化杏仁蛋白,故選擇進料pH為4為宜。

圖2 進料pH對蛋白泡沫分離的影響Fig.2 Effect of pH on foam separation

2.3.2 進料濃度對杏仁蛋白泡沫分離效果的影響 由圖3可以看出,隨著進料濃度增大時,蛋白質(zhì)量分數(shù)下降,蛋白回收率增大。原因可能是,當(dāng)進料濃度較大時,泡沫層泡沫豐富且泡沫在上升過程中穩(wěn)定性較好,不易發(fā)生泡沫隔膜破裂和泡沫合并,間隙排液量少,故泡沫分離裝置流出的泡沫持液量大,泡沫層間隙液體夾帶的多糖、脂肪等雜質(zhì)含量較多,導(dǎo)致蛋白質(zhì)量分數(shù)下降,但殘液中蛋白殘留相對較少,蛋白回收率增大。當(dāng)進料濃度較小時,泡沫層在上升過程中不斷發(fā)生泡沫隔膜破裂及泡沫合并,間隙排液量大,泡沫層間隙液體夾帶的多糖、脂肪等雜質(zhì)含量減少,蛋白質(zhì)量分數(shù)上升,但蛋白在殘液中有較多殘留,蛋白回收率減少。為了純化杏仁蛋白,故選擇進料濃度6 g/L為宜。

圖3 進料濃度對泡沫分離的影響Fig.3 Effect of feed concentration on foam separation

2.3.3 鼓泡氣速對杏仁蛋白泡沫分離效果的影響 鼓泡氣速主要影響泡沫層中的排液行為,氣泡沿著泡沫分離裝置的軸向由下向上流動,泡沫層間隙夾帶的液體由上向下發(fā)生排液現(xiàn)象[25]。由圖4可以看出,隨著鼓泡氣速增大,蛋白回收率先迅速增大,在400 mL/min后,趨于平緩,而蛋白質(zhì)量分數(shù)一直較緩下降。原因可能是,當(dāng)鼓泡氣速較大時,氣泡的流動速率大,泡沫上升過程鼓泡時間較短,導(dǎo)致泡沫層間隙排液量減少,故泡沫分離裝置流出的泡沫持液量大,液體夾帶的雜質(zhì)含量增多,蛋白質(zhì)量分數(shù)下降,但蛋白回收率增大。當(dāng)鼓泡氣速較低時,泡沫上升過程鼓泡時間較長,泡沫間隙排液量增多,隨著鼓泡時間推移,泡沫分離柱內(nèi)料液蛋白含量逐漸減少,料液起泡性及泡沫穩(wěn)定性減弱,鼓泡氣速過小不易將泡沫層從泡沫分離柱上方鼓出,蛋白回收率減小。為了純化杏仁蛋白,故選擇鼓泡氣速400 mL/min為宜。

圖4 鼓泡氣速對蛋白泡沫分離的影響Fig.4 Effect of gas velocity on foam separation

2.3.4 鼓泡時間對杏仁蛋白泡沫分離效果的影響 由圖5可以看出,當(dāng)鼓泡時間較短時,杏仁蛋白質(zhì)量分數(shù)較大,但由于鼓泡不充分,蛋白在泡沫分離裝置殘液中也有較多殘留,蛋白回收率較小。隨著鼓泡時間延長,泡沫層的間隙夾帶的雜質(zhì)也越來越多地從泡沫分離裝置中鼓出,造成蛋白質(zhì)量分數(shù)下降,但蛋白在泡沫分離裝置內(nèi)殘液中殘留較少,蛋白回收率相應(yīng)增大。為了純化杏仁蛋白,回收率僅作為輔助指標(biāo),故選擇鼓泡時間10 min為宜。

圖5 鼓泡時間對蛋白泡沫分離的影響Fig.5 Effect of bubble time on foam separation

2.4 田口方法優(yōu)化泡沫分離工藝

由表3可知,在進料pH4,進料濃度6 g/L,鼓泡氣速 400 mL/min,鼓泡時間10 min條件下,杏仁蛋白質(zhì)量分數(shù)最高達到75.23±0.17%。在進料pH4,進料濃度10 g/L,鼓泡氣速 600 mL/min,鼓泡時間30 min條件下,杏仁蛋白回收率最高達到81.08%±0.13%。

表3 田口方法優(yōu)化泡沫分離工藝結(jié)果Table 3 Optimization of foam separation process by Taguchi method

2.5 信噪比分析

將各因素在各自不同水平下的信噪比值計算均值,從而分析出各因素對杏仁蛋白質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)和回收率的影響大小,并繪制出各因素信噪比均值隨不同水平的變化趨勢圖,見圖6和圖7。

圖6 蛋白質(zhì)量分數(shù)信噪比趨勢圖Fig.6 Noise-signal ratio trend of protein mass fraction

由圖6可知,進料pH(A)的1號水平,進料濃度(B)的1號水平,鼓泡氣速(C)的1號水平和鼓泡時間(D)的1號水平可分別提高杏仁蛋白質(zhì)量分數(shù)的信噪比,根據(jù)田口方法的望大特性,信噪比越大的方案抗外界干擾能力越強,其質(zhì)量特性也最好,故A1B1C1D1是提高杏仁蛋白質(zhì)量分數(shù)的最佳方案。

由圖7可知,進料pH(A)的1號水平,進料濃度(B)的2號水平,鼓泡氣速(C)的3號水平和鼓泡時間(D)的3號水平可分別提高杏仁蛋白回收率的信噪比,根據(jù)田口方法的望大特性,信噪比越大的方案抗外界干擾能力越強,其質(zhì)量特性也最好,故A1B2C3D3是提高杏仁蛋白回收率的最佳方案。

圖7 蛋白回收率信噪比趨勢圖Fig.7 Noise-signal ratio trend of protein recovery rate

2.6 兩級泡沫純化杏仁蛋白結(jié)果

為了之后進一步研究杏仁蛋白、多肽的生物活性,所以要最大限度地提純杏仁蛋白,回收率作為輔助指標(biāo)是為工業(yè)應(yīng)用中的成本控制作考慮的,所以選擇最有利于提高蛋白質(zhì)量分數(shù)的A1B1C1D1條件組合對杏仁粕進行兩級泡沫分離。

如表4所示,經(jīng)過第一級泡沫分離后,杏仁蛋白的質(zhì)量分數(shù)由杏仁粕中的51.17%增加到75.23%,蛋白質(zhì)回收率為79.48%;取一級泡沫分離得到的杏仁蛋白粉按照相同的實驗條件進行二級泡沫分離,最終所得的杏仁蛋白的質(zhì)量分數(shù)為84.71%,蛋白質(zhì)回收率為71.19%,實現(xiàn)了杏仁蛋白的精制純化。

表4 兩級泡沫分離杏仁蛋白結(jié)果Table 4 Results of two stage foam separation of almond protein

3 結(jié)論

考察了泡沫分離法中進料pH、進料濃度、鼓泡氣速和鼓泡時間對杏仁蛋白質(zhì)量分數(shù)及回收率的影響并應(yīng)用田口實驗設(shè)計法優(yōu)化了實驗方案,選取蛋白質(zhì)量分數(shù)和回收率的信噪比(S/N)值作為評價指標(biāo)來衡量實驗效果。通過統(tǒng)計分析確定了提高杏仁蛋白質(zhì)量分數(shù)與回收率最優(yōu)的實驗條件。確定了最優(yōu)的兩級泡沫分離法純化杏仁蛋白的工藝。在裝液體積為500 mL,進料pH為4,進料濃度6 g/L,鼓泡氣速為400 mL/min,鼓泡時間為10 min的條件下,一級泡沫分離杏仁蛋白粉的蛋白質(zhì)量分數(shù)為75.23%,蛋白回收率為79.48%。將一級泡沫分離產(chǎn)物冷凍干燥后作為二級泡沫分離的原料,在相同的操作條件下,二級泡沫分離杏仁蛋白粉的蛋白質(zhì)量分數(shù)為84.71%,蛋白回收率為71.19%。實驗表明兩級泡沫分離法可有效提取純化杏仁蛋白,可作為一種高效、節(jié)能、環(huán)保且低成本的植物蛋白分離精制技術(shù),為之后研究杏仁多肽的生物活性打下基礎(chǔ)。