六價鉻對大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響

黃國興，高琳，趙丹婷，楊文強，柳曉琳，楊菁

（錦州醫(yī)科大學(xué) 1.公共衛(wèi)生學(xué)院，2.遼寧省心腦血管藥物基礎(chǔ)研究重點實驗室，遼寧 錦州 121001）

鉻是一種重金屬元素，主要以三價和六價的形式存在[1]，其毒性與價態(tài)有關(guān)。在所有鉻化合物中，六價鉻[hexavalent chromium, Cr（VI）]具有較大毒性（免疫毒性、神經(jīng)毒性、生殖毒性、遺傳毒性及致癌性[2]）。環(huán)境鉻污染和職業(yè)性接觸鉻化物中毒等事件使鉻的危害受到人們廣泛關(guān)注。流行病學(xué)和臨床研究表明，長期接觸鉻化合物的工人會出現(xiàn)頭暈、頭痛、失眠及記憶力減退等癥狀[3-5]。重金屬污染地區(qū)高鉻暴露會對兒童的神經(jīng)行為發(fā)育產(chǎn)生不良影響[6]，鉻中毒使嬰兒出現(xiàn)驚厥、昏迷及瞳孔散大等中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀[7]，說明鉻具有神經(jīng)毒性。

對Cr（VI）所誘導(dǎo)神經(jīng)毒性研究中發(fā)現(xiàn)，Cr（VI）可引起活性氧（reactive oxygen species, ROS）升高和線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential, MMP）發(fā)生改變等一系列現(xiàn)象，揭示Cr（VI）神經(jīng)毒性可能與其氧化應(yīng)激有關(guān)[8]。鉻所致神經(jīng)系統(tǒng)損傷的研究較為少見，機制尚不清楚。本研究通過灌服重鉻酸鉀對新生雄性大鼠進行染毒，用水迷宮觀察染毒對大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的影響。通過觀察大鼠海馬神經(jīng)細胞、膠質(zhì)細胞的形態(tài)學(xué)變化及谷胱甘肽（glutathione, GSH）含量的變化，探討鉻對大鼠學(xué)習(xí)記憶損傷機制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

AAnalyst 800原子吸收光譜儀（北京普立泰科儀器有限公司），ST-600全自動消解儀（北京普立泰科儀器有限公司），AY120電子分析天平（日本島津公司），ZH Morris水迷宮程序自動控制儀（中國科學(xué)院藥物研究所研制），LC10Atvp高效液相色譜儀（日本島津公司），重鉻酸鉀（K2Cr2O7，優(yōu)級純，上海亭新化工試劑廠），硝酸（HNO3，優(yōu)級純，北京現(xiàn)代東方精細化學(xué)品有限公司），高氯酸（HClO4，優(yōu)級純，上海金鹿化工有限公司），GFAP（GA-5）：SC-58766（美國盛克魯斯生物技術(shù)有限公司），SP-9000檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），ZLI-9018二氨基聯(lián)苯胺法（diaminobenzidine, DAB）顯色試劑盒（×20）（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）等。

1.2 動物分組與給藥

實驗動物選擇體重、健康狀況相近無特定病原體級同一批次的SD懷孕大鼠[錦州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，合格證號SCXK（遼）2014-0004]12只進行實驗。將12只孕鼠隨機分為4組，每組3只，分別為對照組（雙蒸水）、重鉻酸鉀低（0.8 mg/kg）、中（4.0 mg/kg）、高（20 mg/kg）劑量組。待仔鼠出生后第1天起，開始對孕鼠進行灌胃給藥。灌胃劑量相同的孕鼠所生仔鼠為同一組，哺乳期：自出生第1天起通過母乳染毒；斷乳（出生后21 d）后，給予其與母鼠相同劑量的重鉻酸鉀灌胃給藥，1次/d，合計6個月。各組仔鼠中選擇雄性大鼠進行實驗，對照組11只，低、中、高劑量重鉻酸鉀組分別為10、10、9只。

1.3 實驗方法

1.3.1 Morris水迷宮行為學(xué)測試 K2Cr2O7染毒結(jié)束前1周，參照文獻[9]用Morris水迷宮實驗來測試大鼠學(xué)習(xí)記憶能力：①定位航行實驗：測試大鼠的學(xué)習(xí)能力，每天將大鼠分別從4個入水點放入水中，歷時6 d，記錄逃避潛伏期（s）；②空間探索實驗：測定大鼠對原象限平臺位置的記憶能力，第7天撤去水下平臺，將大鼠從4個入水點面向池壁放入水中，記錄120 s內(nèi)穿越原平臺位置的次數(shù)以及在原平臺象限停留時間和第1次穿越原平臺位置的潛伏期。

1.3.2 腦組織鉻含量測定 采用全自動濕法消解：用電子天平稱取大鼠腦組織0.5 g置于消解管內(nèi)，放置在消解架上。加入混酸12 ml（硝酸∶高氯酸為5∶1），震蕩加熱，待消解程序結(jié)束用超純水定容至50 ml，同時做試劑空白。用石墨爐原子吸收光譜儀進行測定[10]。

1.3.3 尼氏染色 水迷宮實驗結(jié)束后，麻醉處死動物，迅速取出大鼠海馬組織放入10%中性甲醛溶液中固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，進口石蠟包埋，切片，烤片，脫蠟至水，1%甲苯胺藍染色56℃，30 min，分色脫水，二甲苯浸泡，中性樹膠封片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察其形態(tài)學(xué)變化。

1.3.4 GFAP免疫組織化學(xué)染色 切片常規(guī)脫蠟至水，A液（檸檬酸）18 ml+B液（檸檬酸鈉）82 ml+雙蒸水900 ml于高壓鍋內(nèi)進行抗原高壓修復(fù)2 min，3%過氧化氫孵育15 min，滴加一抗，4℃過夜，生物素化二抗工作液（IgG/Bio），置于恒溫水浴箱中37℃，30 min，辣根酶標記鏈霉卵白素工作液（S-A/HRP）37℃，30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，酒精脫水，二甲苯透明，封片。陽性表達為棕黃色。

1.3.5 海馬組織中GSH測定 稱取海馬組織，加入0.3 ml衍生試劑5,5'-二硫硝基苯甲酸[5,5'-Dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）, DTNB]冰浴下超聲粉碎，1 200 r/min，4℃，離心10 min，取上清液，加入2倍體積乙醇，靜置過濾后上樣，吸取加入DTNB衍生試劑后的標準液和樣品上清液，混勻靜置后進樣。色譜條件：C18色譜柱（150 mm×50 mm×5 μm），流動相A：1%甲酸，流動相B：10%四氫呋喃的乙腈溶液；B相梯度洗脫條件為0 min，0%～10%，12 min，10%～14%，22 min，14%～28%，35 min，28%～80%，40 min，10%，平衡5 min，25 min，結(jié)束洗脫，流速0.8 ml/min，熒光檢測波長，激發(fā)波長λex=254 nm，發(fā)射波長λem=327 nm，柱溫38℃，進樣量50 μl。通過峰面積，采用外標法定量[11]，含量以每克海馬組織中GSH的含量mg/g表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用完全隨機設(shè)計的方差分析或重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腦鉻含量比較

各組大鼠腦組織鉻含量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且隨鉻染毒劑量增加而升高。見表1。

2.2 大鼠學(xué)習(xí)記憶行為比較

2.2.1 定位航行實驗結(jié)果 各組大鼠在第1、2、3、4、5及6天的平均逃避潛伏期比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間的平均逃避潛伏期有差異（F=1546.992，P=0.000）；②各組間的平均逃避潛伏期有差異（F=20.834，P=0.000），且隨染毒劑量的增加而延長；③各組的平均逃避潛伏期與時間的變化趨勢有差異（F=6.318，P=0.000）。見表2。

表1 大鼠腦鉻含量比較 （mg/g，±s）

表1 大鼠腦鉻含量比較 （mg/g，±s）

注：?與前一組比較，P＜0.05

組別 腦鉻含量對照組（n=11） 5.5±0.6低劑量重鉻酸鉀組（n=10） 7.4±0.6?中劑量重鉻酸鉀組（n=10） 8.5±0.6?高劑量重鉻酸鉀組（n=9） 9.4±0.7?F值 73.387P值 0.000

2.2.2 空間搜索實驗結(jié)果 各組大鼠第1次尋找原平臺潛伏期、穿越原平臺次數(shù)及在原平臺所在象限的停留時間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=93.510、28.513和32.397，均P=0.000）。各組第1次尋找原平臺潛伏期比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且隨染毒劑量的增加有所延長；各組大鼠穿越原平臺的次數(shù)以及在原平臺所在象限的停留時間差異經(jīng)兩兩比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且隨著給藥劑量的增加而減少。見表3。

2.3 鉻暴露對大鼠海馬神經(jīng)元的影響

對照組海馬組織神經(jīng)元排列有序、細胞數(shù)量豐富、細胞周圍間隙不明顯及神經(jīng)細胞形態(tài)規(guī)則（大多數(shù)呈錐形和球形，結(jié)構(gòu)清楚、胞漿透明、細胞核明顯、呈圓形或橢圓形、核漿比值大及核仁清晰），淡染呈淺藍紫色、深染呈藍紫色。重鉻酸鉀組神經(jīng)元排列出現(xiàn)不同程度紊亂（細胞數(shù)量減少、細胞間隙增寬、細胞形態(tài)不規(guī)則、部分細胞著色淺、胞體縮小、胞漿濃染、細胞核深染、固縮及形態(tài)不一）。見圖1。

2.4 鉻暴露對大鼠海馬組織GFAP蛋白表達的影響

在光鏡下觀察，對照組大鼠海馬區(qū)可見少量淡染的星形膠質(zhì)細胞，胞體較小且突起較短。重鉻酸鉀組大鼠海馬區(qū)可見大量棕黃色星形膠質(zhì)細胞，且星形膠質(zhì)細胞密度和染色深度均較對照組偏高，胞體較大且突起較粗，陽性表達細胞較多。見圖2。

表2 大鼠Morris水迷宮平均逃避潛伏期比較 （s，±s）

表2 大鼠Morris水迷宮平均逃避潛伏期比較 （s，±s）

組別 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 第6天對照組（n=11） 35.3±5.3 21.2±2.5 18.0±3.6 12.6±2.7 11.4±2.9 9.2±1.9低劑量重鉻酸鉀組（n=10） 41.4±6.1 26.3±4.8 23.4±3.9 17.3±3.6 14.8±3.5 12.2±2.3中劑量重鉻酸鉀組（n=10） 47.1±6.4 31.7±4.7 28.5±5.3 22.1±4.4 18.0±3.2 15.1±3.5高劑量重鉻酸鉀組（n=9） 53.0±6.8 36.5±6.0 33.5±5.5 26.6±5.1 22.9±4.3 17.9±3.9

2.5 大鼠海馬組織GSH含量比較

各組大鼠海馬組織GSH含量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。隨著染毒劑量增高，GSH含量降低。見表4。

圖1 不同劑量的鉻暴露對大鼠海馬神經(jīng)元的影響 （尼氏染色×400）

圖2 不同劑量的鉻暴露對大鼠海馬組織GFAP蛋白表達影響 （免疫組織化學(xué)×400）

表3 大鼠Morris水迷宮空間搜索實驗結(jié)果比較 （±s）

表3 大鼠Morris水迷宮空間搜索實驗結(jié)果比較 （±s）

在原平臺象限停留時間/s對照組（n=11） 5.6±0.8 11.1±2.1 46.0±7.9組別 第1次尋找原平臺潛伏期/s穿越原平臺次數(shù)/次低劑量重鉻酸鉀組（n=10） 8.5±1.3 8.3±1.9 33.7±7.2中劑量重鉻酸鉀組（n=10） 12.1±1.6 6.3±1.7 24.5±6.5高劑量重鉻酸鉀組（n=9） 16.0±1.9 4.2±1.1 17.8±5.3F值 93.510 28.513 32.397P值 0.000 0.000 0.000

表4 大鼠海馬組織GSH含量比較 （μmol/mg，x±s）

3 討論

鉻存在多種價態(tài)，其中Cr（VI）具有生物氧化毒性。在自然界主要以鉻酸鹽或重鉻酸鹽的形式存在，毒性最強[12]。神經(jīng)系統(tǒng)由于其特殊性，是重金屬毒性的靶點，更容易受到重金屬離子的影響而引起損傷。目前關(guān)于鉻的研究大多都集中對肝臟、腎臟及肺臟等多種器官的毒性作用，對Cr（VI）神經(jīng)毒性的認識甚少。本研究經(jīng)K2Cr2O7的6個月染毒，發(fā)現(xiàn)大鼠有活動量和食量逐漸減少、躁動不安及反應(yīng)遲鈍等一系列改變，提示鉻對大鼠神經(jīng)系統(tǒng)有一定的毒性作用，與文獻報道基本一致[13]。

Morris水迷宮由英國心理學(xué)家MORRIS于20世紀80年代初設(shè)計，其應(yīng)用與海馬功能直接相關(guān)的空間學(xué)習(xí)記憶腦機制研究，能準確地反映動物空間學(xué)習(xí)和記憶能力，廣泛應(yīng)用于學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)生物學(xué)和神經(jīng)藥理研究。Morris水迷宮實驗結(jié)果表明，隨著鉻劑量增加，重鉻酸鉀組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力也逐漸降低，表明鉻對大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力影響存在一定劑量的效應(yīng)關(guān)系，提示鉻染毒影響大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。原子吸收腦鉻含量的測定進一步表明，隨著重鉻酸鉀劑量增加，腦鉻含量也隨之升高。

尼氏染色結(jié)果顯示，重鉻酸鉀給藥組神經(jīng)元排列出現(xiàn)不同程度的紊亂，說明Cr（VI）暴露對大鼠的海馬神經(jīng)細胞造成損害。免疫組織化學(xué)法實驗選擇星形膠質(zhì)細胞標志性蛋白GFAP[14-15]，探討Cr（VI）所致SD大鼠神經(jīng)系統(tǒng)影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組大鼠的海馬區(qū)僅可觀察到少量淡染的星形膠質(zhì)細胞，胞體較小并且突起較短；重鉻酸鉀組則可見大量棕黃色的星形膠質(zhì)細胞，胞體較大且突起較粗，陽性細胞數(shù)比正常組多，且劑量越大，陽性表達現(xiàn)象越明顯，提示Cr（VI）暴露會對大鼠海馬星形膠質(zhì)細胞有活化作用，劑量越大，活化越明顯。

GSH是人體內(nèi)一種主要生物活性成分，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸殘基組成。在體內(nèi)起活化代謝還原系統(tǒng)、激活SH酶及解毒等作用[14]，并參與體內(nèi)的多種代謝反應(yīng)。Cr（VI）進入細胞后，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生自由基，中間產(chǎn)物和自由基均可對DNA、蛋白及脂質(zhì)等產(chǎn)生損傷，主要在細胞內(nèi)GSH和抗壞血酸等還原劑的作用下被清除[16-17]。隨著重鉻酸鉀劑量增大，大鼠海馬組織中GSH含量有不同程度的降低，提示Cr（VI）會對海馬組織造成損傷，其原因可能是隨著Cr（VI）染毒劑量增加產(chǎn)生的ROS也隨之增加[18]，從而導(dǎo)致細胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)GSH消耗增加[19-20]，而使GSH含量降低。

綜上所述，長期Cr（VI）暴露，將對大鼠海馬組織造成損傷，導(dǎo)致其學(xué)習(xí)記憶能力的改變，最后引起大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力下降。筆者將對Cr（VI）的神經(jīng)毒性進行更深入研究。