全豆豆腐中腐敗菌分離、鑒定及貨架期研究

王宸之，杜沁嶺，周思懿，黃　靜，蘭秋雨，秦　文，楊文鈺，劉　江，張　清,＊

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川　雅安　625014；2.四川省作物帶狀復(fù)合種植工程技術(shù)研究中心，成都　611130）

豆腐是優(yōu)質(zhì)植物蛋白來源[1]，經(jīng)浸泡、研磨、煮沸、過濾、點(diǎn)漿等步驟制成傳統(tǒng)填充豆腐[2]。研究表明，在豆?jié){過濾環(huán)節(jié)，47%大豆原料過濾后留在豆渣中，豆渣具有較高水分活度，極易腐敗變質(zhì)，過濾豆渣被制成動物飼料或遺棄，浪費(fèi)原料[3]。為解決傳統(tǒng)豆腐原料利用率低問題，全豆填充豆腐研制成為熱點(diǎn)。全豆填充豆腐（Packed whole-soybean curd）無豆?jié){過濾步驟，將大豆原料全部或大部分保留蛋白凝膠。學(xué)者針對全豆豆腐凝膠性能，制備工藝、加工條件等開展研究[4-6]。

全豆填充豆腐提高原料利用率，但存在食品安全隱患，大豆生長和種植過程中，表面攜帶大量微生物，煮沸可殺滅大部分微生物，但仍有部分耐熱芽孢殘存在豆腐成品中。此外，全豆豆腐含有大量豆渣，初始菌數(shù)高于傳統(tǒng)去渣豆腐，影響貨架期。預(yù)測微生物學(xué)通過數(shù)學(xué)模型描述特定環(huán)境因素對食物中微生物生長影響[7]，反映微生物生長及衰退趨勢，預(yù)測產(chǎn)品貨架期，在果蔬[8]、海產(chǎn)品[9]生產(chǎn)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。目前預(yù)測微生物學(xué)研究主要集中于食品腐敗菌及食源性致病菌，Juneja等采用Baranyi模型、Huang模型、modified Gomp?ertz模型及三參數(shù)線性一級模型，建模預(yù)測煮熟大豆中蠟樣芽孢桿菌生長動力學(xué)特性[10]，利用準(zhǔn)確因子（Af）、偏差因子（Bf）、相關(guān)系數(shù)（R2）、均方根誤差（RMSE）評估模型精密度。結(jié)果表明，Baranyi模型可精確描述蠟樣芽孢桿菌熱休克孢子狀態(tài)萌發(fā)、生長、繁殖動力學(xué)曲線，Modified Ratkowsky二級模型擬合結(jié)果發(fā)現(xiàn)貯藏溫度與微生物生長速率呈較高相關(guān)性（R2=0.98），因此Baranyi一級模型與Modified Ratkowsky二級模型可以用于豆類食品中孢子萌發(fā)、繁殖動力學(xué)特性研究。預(yù)測微生物學(xué)模型可用于生長曲線擬合，與理化指標(biāo)結(jié)合分析食品腐敗變質(zhì)原因并預(yù)測食品貨架期。Matara?gas等分析水果酸奶中菌群及理化指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，乳酸菌是主要菌群，此外，在限定貯藏溫度條件下（5～20℃），酵母數(shù)量隨時間推移不斷上升，但在酵母生長初始階段出現(xiàn)延滯生長[11]。理化檢測結(jié)果顯示，在冷藏溫度下（5℃，10℃），酸奶中可滴定酸和pH均保持恒定，當(dāng)溫度上升時，可滴定酸含量上升，pH下降。預(yù)測微生物學(xué)模型驗證試驗表明，17℃溫度下，酸奶貨架期預(yù)測需結(jié)合數(shù)學(xué)模型、感官試驗及理化檢驗。針對豆腐中腐敗菌預(yù)測微生物學(xué)研究較少，Lee等分離和鑒定韓國商業(yè)化豆腐中腐敗菌，結(jié)果表明引發(fā)豆腐腐敗變質(zhì)主要微生物是蠟樣芽孢桿菌[12]，與Juneja等研究結(jié)果一致。在豆腐制作過程中，大豆原料微生物污染狀況對豆腐品質(zhì)有重要影響，后續(xù)預(yù)測微生物學(xué)模型驗證試驗表明，溫度是影響豆腐貨架期關(guān)鍵因素。但Rossi等發(fā)現(xiàn)豆腐中特異性腐敗菌是乳酸菌，即使同一種類食品，腐敗菌種類及生長特性不同[13]。預(yù)測微生物學(xué)現(xiàn)有研究內(nèi)容包含：①模型在食品中應(yīng)用、驗證、評估。②不同模型精確度對比及常見食物中適用性研究。③預(yù)測微生物學(xué)模型應(yīng)結(jié)合理化、感官檢驗技術(shù)對食品貨架期綜合評判。

目前，全豆豆腐腐敗菌和貨架期研究尚未見報道。因此，本文以全豆填充豆腐為研究對象，分離和鑒定全豆豆腐中腐敗菌。在預(yù)測微生物學(xué)技術(shù)基礎(chǔ)上，建立腐敗菌生長一級模型和二級模型，繪制腐敗菌生長動力學(xué)曲線，預(yù)測和驗證不同貯藏溫度下全豆豆腐貨架期。

1　材料與方法

1.1　材料試劑與儀器

大豆（南豆12，蛋白含量為46%，水分含量11%，粗脂肪含量14%），由四川省南充市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供；葡萄糖內(nèi)酯（Glucono-δ-lactone，GDL），食品級，購自安徽省興省醫(yī)藥食品有限公司；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA），分析純，購自杭州微生物試劑有限公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒，DP302，購自天根生化科技（北京）有限公司；高純度低電滲瓊脂糖，Tsingke；DNA凝膠回收試劑盒，Tsingke； DNA Marker， 型 號 DL2000， TaKaRa。測序儀，3730XL，Applied Biosystems；離心機(jī)，Micro17，Thermo Legend；PCR 儀，2720 thermal cycler，Applied Biosystems；凝膠成像儀，JY04S-3C，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；高速粉碎機(jī)，XM-800Y，浙江省永康市鉑歐五金制品廠。

1.2　全豆填充豆腐制備

大豆原料經(jīng)篩選、清洗后于60℃烘干備用。烘干后大豆以高速中藥粉碎機(jī)粉碎1 min（轉(zhuǎn)速12 000 r·min-1）后制成豆粉，豆粉與飲用水按照1∶7.5質(zhì)量體積比混合均勻后制成懸浮液，懸浮液升至95℃保溫5 min后立即冰浴降溫至55℃制成熟豆?jié){，量取80 mL熟豆?jié){于100 mL小燒杯內(nèi)，加入豆?jié){體積0.4%（m/v）GDL，GDL與豆?jié){混合均勻后于55℃水浴保溫1 h形成全豆填充豆腐。

1.3　全豆填充豆腐中腐敗菌分離、純化與鑒定

豆腐腐敗菌分離與鑒定采用Lee等方法[12]，將制備全豆填充豆腐置于37℃條件下放置24 h，取5 g豆腐樣品，以無菌生理鹽水梯度稀釋，選取2～3個適宜稀釋度稀釋液1 mL傾注TSA培養(yǎng)基，37℃條件下培養(yǎng)24 h，挑取不同形態(tài)菌落TSA平板劃線純化形成單菌落。

腐敗菌鑒定采用16S rDNA測序法，腐敗菌基因組DNA提取參照天根DP302（細(xì)菌）試劑盒方法，提取后DNA PCR擴(kuò)增，PCR長度：1 500 bp；引物設(shè)置：27F（AGTTTGATCMTGGCTCAG），1492R（GGTTACCTTGTTACGACTT）；PCR反應(yīng)體系：T5 Mix，25 μL；PF（10P），1 μL；PR（10P），1 μL；gDNA，1μL；ddH2O，22μL；PCR擴(kuò)增條件：94℃，5 min；98℃，10 s；55℃，15 s；72℃，15 s；72℃，5 min；4℃，保持。其中，98℃，10 s至72℃，15 s間共循環(huán)30次。擴(kuò)增后產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳：1%瓊脂糖，150 V、100 mA，20 min。切割所需DNA目的條帶，純化PCR產(chǎn)物，用引物直接測序，F(xiàn)ASTS序列在Reverse complement系統(tǒng)中反向序列互補(bǔ)，互補(bǔ)序列在EZbiocloud系統(tǒng)（https://www.ezbiocloud.net）中序列對比分析，確定腐敗菌種類。

1.4　全豆豆腐腐敗菌生長一級模型構(gòu)建

微生物生長一級模型反映恒定環(huán)境條件下微生物數(shù)量與時間關(guān)系，即微生物生長曲線。常見一級模型有Logistic模型、Gompertz模型以及Modified Gompertz模型等。本試驗將全豆豆腐分別置于15、20、25和30℃條件下，每間隔一段時間取樣，將5 g樣品梯度稀釋后傾注TSA平板，37℃條件下培養(yǎng)24～48 h，測定豆腐中菌落數(shù)，建立微生物數(shù)量與時間對應(yīng)關(guān)系。選用Logistic（式1）和Modified Gompertz（式2）兩種模型擬合腐敗菌生長情況，比較兩模型適用性。

式中，Nt—貯藏時間為t h時菌數(shù)，log（cfu·g-1）；μmax—微生物生長最大比生長速率（h-1）；λ—微生物生長延滯時間（h）。A—相對最大菌濃度,即logNmax/N0，log（cfu·g-1）；N0—樣品初始菌數(shù)，log（cfu·g-1）；Nmax—樣品最大菌數(shù)，log（cfu·g-1）；

式（2）中，Nt—貯藏時間為t h時菌數(shù)，log（cfu·g-1）；N0—樣品初始菌數(shù)，log（cfu·g-1）；C—微生物最大菌數(shù)（Nmax）與初始菌數(shù)（N0）差值，即C=Nmax-N0，log（cfu·g-1）；μmax—微生物生長最大比生長速率（h-1）；λ—微生物生長延滯時間（h）。

1.5　全豆豆腐腐敗菌生長二級模型構(gòu)建

微生物生長一級模型反映恒定環(huán)境條件下微生物生長情況，二級模型可反映環(huán)境因素變化對微生物生長特性影響，即環(huán)境因子影響模型。由于溫度對豆腐中微生物生長有顯著影響，選用延滯期模型（Lag Time,LT模型，式3）和平方根模型（式4）擬合一級模型所得數(shù)據(jù)。

式（3）中，LT—延滯期（h）；T—貯藏溫度（℃）；aLT，bLT回歸常數(shù)。

式（4）中，μmax—微生物生長最大比生長速率（h-1）；T—貯藏溫度（℃）；Tmin—微生物生長最低溫度（℃）；b，回歸常數(shù)。

1.6　全豆豆腐貨架期預(yù)測模型構(gòu)建

全豆豆腐貨架期預(yù)測基于一級模型，當(dāng)樣品菌數(shù)達(dá)6 log（cfu·g-1）時，認(rèn)為豆腐到達(dá)貨架期終點(diǎn)，采用迭代法求出對應(yīng)時間，即為全豆豆腐貨架期。

1.7　統(tǒng)計與分析

采用Origin 9.0軟件對數(shù)據(jù)非線性回歸擬合及誤差分析，采用Microsoft Excel 2014對數(shù)據(jù)單變量求解。

2　結(jié)果與分析

2.1　全豆豆腐中腐敗菌分離與鑒定結(jié)果

將制備全豆豆腐于37℃條件下貯藏24 h后，取樣5 g，以無菌生理鹽水梯度后傾注TSA培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，因樣品存在芽孢桿菌，若培養(yǎng)24 h后仍無菌落生成，則延長培養(yǎng)時間至48 h。經(jīng)觀察，TSA平板中共生成2種形態(tài)不同菌落，以無菌接種環(huán)挑取菌落劃線于TSA平板上，純化后獲得單菌落T-1及T-2。全豆豆腐中腐敗菌在TSA平板上純化單菌落形態(tài)如圖1所示。菌落形態(tài)學(xué)分析如下：T-1經(jīng)接種環(huán)挑起后有粘性，單菌落呈圓形，無光澤，較干燥，邊緣不整齊且有明顯褶皺。T-2呈灰白色、不透明，表面粗糙，菌落有明顯光澤，呈毛玻璃或熔融蠟狀，邊緣呈擴(kuò)展?fàn)睿?jīng)接種環(huán)挑起后有粘性。菌株分析參考文獻(xiàn)[14]，結(jié)果表明T-1及T-2含芽孢桿菌，其中T-2為蠟樣芽孢桿菌。

為更精確分析腐敗菌類別，本試驗采用16S rDNA測序法分析T-1及T-2，首先采用DP302（細(xì)菌）試劑盒提取細(xì)菌基因組，特異性引物擴(kuò)增16S rDNA序列后，采用瓊脂糖凝膠電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物純化鑒定。瓊脂糖凝膠電泳圖譜顯示（見圖2），T-1及T-2擴(kuò)增后DNA序列約1 500 bp，與16S rDNA序列長度一致，擴(kuò)增成功。

圖1　全豆豆腐中腐敗菌在TSA平板上菌落形態(tài)Fig.1　Colony morphology of spoilage bacterium isolated from whole-soybean curd on TSA medium

圖2　全豆豆腐腐敗菌16S rDNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.2　Agarose gel electrophoresis of spoilage bacterium 16S rDNA isolated from whole-soybean curd

切割1 500 bpDNA目的條帶，將純化后PCR產(chǎn)物用引物直接測序，測序結(jié)果與EZbiocloud數(shù)據(jù)庫對比。如圖3所示，菌株T-1 16S rDNA反向互補(bǔ)序列長度1 381 bp，覆蓋范圍為47～1 427 bp，覆蓋率93.8%。菌株T-2 16S rDNA反向互補(bǔ)序列長度為1 377 bp，覆蓋范圍50～1 426 bp，覆蓋率93.4%。

EZbiocloud系統(tǒng)將覆蓋序列與數(shù)據(jù)庫中標(biāo)準(zhǔn)菌株序列對比，排除無效菌株后根據(jù)16S rDNA序列覆蓋度及序列相似度排序（只列出排序前3菌株），如表1所示，腐敗菌菌株T-1序列相似度由高到低依次為：Bacillus subtilis subsp.Inaquosorum（KCTC 13429（T），序列相似度99.93%）、Bacillus tequilen?sis（KCTC 13622（T），序列相似度99.93%）、Bacillus subtilis subsp.Subtilis（NCIB 3610（T），序列相似度2/1381）。腐敗菌菌株T-2序列相似度由高到低依次為：Bacillus cereus（ATCC 14579（T），序列相似度100.00%）、Bacillus wiedmannii（FSL W8-0169（T），序列相似度99.93%）、Bacillus albus（N35-10-2（T），序列相似度99.93%）。由上述數(shù)據(jù)可得：菌株T-1為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）或特基拉芽孢桿菌（Bacillus tequilensis），T-2為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）。

圖3　EZbiocloud系統(tǒng)中腐敗菌16S rDNA反向序列信息Fig.3　Reverse sequence details of 16S rDNA isolated from spoilage bacterium in EZbiocloud system

表1　全豆豆腐腐敗菌16S rDNA測序鑒定結(jié)果Table 1　Taxonomic details of spoilage bacterium in whole-soybean curd as identified on the basis of 16 S rDNA gene partial sequence

大豆原料大部分來源于田間，大豆表面附泥土，攜帶大量土壤微生物，豆?jié){加熱過程使大豆蛋白發(fā)生熱變性，殺滅主要細(xì)菌營養(yǎng)體細(xì)胞，但部分芽孢桿菌在逆環(huán)境中能生成耐熱芽孢殘留，環(huán)境適宜芽孢重新萌發(fā)，產(chǎn)生毒素，危害食品安全?？莶菅挎邨U菌可產(chǎn)生淀粉酶及枯草桿菌素，引起食品腐敗變質(zhì)，蠟樣芽孢桿菌可引起食物中毒[15]。

Lee等研究報道，成品豆腐額外熱處理利于豆腐保存[12]，全豆豆腐因芽孢對逆環(huán)境耐受力極強(qiáng)，普通熱處理難以殺滅豆?jié){中芽孢，因此二次殺菌應(yīng)集中輻照處理，抑制芽孢數(shù)量，延長全豆豆腐貨架期。

2.2　全豆豆腐中腐敗菌生長動力學(xué)模型構(gòu)建

如圖4所示，采用Logistic（A）和Modified Gom?pertz（B）模型對15、20、25和30 ℃溫度下腐敗菌生長趨勢非線性回歸擬合，其中Modified Gompertz（B）模型所擬合曲線呈典型延滯期、對數(shù)期和穩(wěn)定期，而Logistic（A）模型20、25、30℃溫度下呈典型對數(shù)期和穩(wěn)定期，15℃下Logistic（A）模型僅呈對數(shù)期，與模型擬合精度有關(guān)，擬合精度越高，腐敗菌實(shí)際生長趨勢還原度越高。

圖4　不同溫度下全豆豆腐中腐敗菌生長動力學(xué)Fig.4　Kinetic curves of spoilage bacterium on whole-soybean curd stored at different temperatures

表2為擬合曲線精度統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果，15～30℃溫度下，Logistic（A）模型擬合精度（R2）依次為0.93、0.92、0.93、0.97，對應(yīng) Modified Gompertz（B）模型擬合精度（R2）依次為 0.99、0.98、0.98、0.99。各溫度下Modified Gompertz擬合精度均高于Logistic（A）模型，可見Modified Gompertz（B）模型更適用于全豆豆腐中腐敗菌生長趨勢擬合。此外，Logistic（A）或Gompertz（B）模型擬合結(jié)果均顯示，隨豆腐貯藏溫度由30℃降至15℃，腐敗菌最大比生長速率（μmax）降低，延滯期（Lag time）增大，溫度與腐敗菌生長呈負(fù)相關(guān)趨勢。Logistic（A）模型相對最大菌濃度（A值）恒定在8 log（cfu·g-1），但15 ℃下相對最大菌濃度為（9.18±0.87）log（cfu·g-1），因15℃下曲線擬合未收斂所致。Gompertz（B）模型最大菌數(shù)（Nmax）與初始菌數(shù)（N0）差值較為恒定，在5 log（cfu·g-1）。全豆豆腐初始菌數(shù)較為恒定，在3 log（cfu·g-1），因此在15～30 ℃條件下腐敗菌最大生長量（Nmax）較為恒定，15～30℃時，溫度僅改變腐敗菌達(dá)到最大生長量時間，不改變最大生長量。

表2　不同溫度下全豆豆腐腐敗菌生長曲線擬合參數(shù)Table 2　Fitting parameters of spoilage bacterium growth on whole-soybean curd stored at different temperatures

2.3　溫度對全豆豆腐中腐敗菌生長特性影響

微生物生長一級模型雖可擬合腐敗菌生長趨勢，但無法描述溫度對腐敗菌生長參數(shù)影響[16]。因此，采用延滯期模型和平方根模型兩個二級模型探究溫度對腐敗菌生長延滯期（Lag time,LT）和最大比生長速率（μmax）影響。

如圖5所示，分別采用延滯期模型和平方根模型對一級模型所得延滯期（Lag time）和最大比生長速率（μmax）非線性回歸擬合。將曲線擬合范圍范圍延長至5～40℃，計算10和35℃對應(yīng)延滯期和最大比生長速率預(yù)測值，構(gòu)建10和35℃一級模型。

圖5A為Logistic方程對應(yīng)二級模型（平方根模型），平方根模型顯示當(dāng)溫度在10℃時，模型出現(xiàn)收斂趨勢，經(jīng)計算得出10℃對應(yīng)μmax值為0.0005。此外，當(dāng)溫度為5～10℃時，平方根模型函數(shù)曲線回升，不符合微生物生長規(guī)律，該范圍內(nèi)μmax值不可信，延滯期和最大比生長速率預(yù)測值和實(shí)際值線性相關(guān)系數(shù)R2分別為0.98573和0.95249。圖5B為Modified Gompertz方程對應(yīng)二級模型（平方根模型），平方根模型顯示當(dāng)溫度在10℃時，模型未出現(xiàn)收斂趨勢，延滯期和最大比生長速率預(yù)測值和實(shí)際值線性相關(guān)系數(shù)R2分別為0.98491和0.99032，Modified Gompertz最大比生長速率實(shí)際值與預(yù)測值相關(guān)性高于Logistic方程，延滯期實(shí)際值與預(yù)測值相關(guān)性與Logistic方程相近。

表3顯示二級模型擬合度、微生物生長參數(shù)實(shí)際值、預(yù)測值，其中Logistic方程對應(yīng)延滯期模型和平方根模型擬合度（R2）依次為0.98和0.95，Mod?ified Gompertz方程對應(yīng)延滯期模型和平方根模型擬合度（R2）依次為0.98和0.99，Modified Gompertz方程二級模型擬合精度高于Logistic方程。腐敗菌生長參數(shù)預(yù)測值指對應(yīng)自變量（本試驗中為溫度）帶入二級模型方程后計算出因變量值，而預(yù)測值和實(shí)際值之間相對誤差反映預(yù)測值與實(shí)際值之間差距，如表3所示，除去15℃下延滯期預(yù)測，其余情況下Logistic方程對應(yīng)延滯期和最大比生長速率相對誤差均大于Modified Gompertz方程，因此Modi?fied Gompertz方程預(yù)測精度更高，更適用于全豆豆腐腐敗菌生長趨勢預(yù)測。

圖5　不同溫度下腐敗菌延滯期及最大比生長速率回歸曲線與相關(guān)性曲線Fig.5　Regression and correlation curves of lag time（LT）and maximum growth rate（μmax）of spoilage bacterium at different temperature

表3　全豆豆腐腐敗菌延滯期及最大比生長速率預(yù)測值與實(shí)際值Table 3　Observed and predicted lag time(LT)and maximum growth rate(μmax)of spoilage bacteria in whole-soybean curd

2.4　全豆豆腐貨架期預(yù)測

全豆豆腐初始菌數(shù)較高，貨架期計算尤為重要。當(dāng)豆腐中菌數(shù)達(dá)6 log（cfu·g-1）時，豆腐貨架期達(dá)到終點(diǎn)[13]，利用Microsoft Excel 2014對一級模型單變量求解，目標(biāo)值設(shè)置為6，迭代后計算自變量即為豆腐貨架期。此外，本試驗將2.3中計算10及35℃下腐敗菌生長參數(shù)（延滯期，最大比生長速率）帶入一級模型，給出該溫度下全豆豆腐貨架期預(yù)測值。

如表4所示，隨溫度降低全豆豆腐實(shí)際貨架期均延長，15℃條件下Logistic方程和Modified Gomp?ertz方程對應(yīng)實(shí)際貨架期依次為41.38 h（1.72 d）和40.73（1.70 d），預(yù)測貨架期依次為164.60 h（6.86 d）和40.25 h（1.68 d），由此可見Logistic方程預(yù)測值相對誤差明顯大于Modified Gompertz方程，預(yù)測值可信度較低，此外，10℃時Logistic方程預(yù)測貨架期達(dá)12 374.03 h（515.58 d），與實(shí)際情況偏差極大，原因為Logistic方程二級模型計算μmax值不準(zhǔn)確，35℃下預(yù)測貨架期為5.22 h。

由圖6可知，10℃下全豆豆腐預(yù)測貨架期為143.96 h（5.99 d），35℃下預(yù)測貨架期為3.36 h，即10℃下，全豆豆腐貨架期可接受。

表4　不同溫度下全豆豆腐貨架期預(yù)測值和實(shí)測值Table 4　Predicted and observed shelf life of whole-soybean curd stored at different temperature

圖6　10及35℃下全豆豆腐貨架期預(yù)測模型Fig.6　Shelf life prediction of whole-soybean curd at 10 and 35℃

3　討論與結(jié)論

國內(nèi)關(guān)于豆制品風(fēng)險評估質(zhì)量控制體系尚未建立，大豆生長和收獲過程中，主要微生物風(fēng)險因素包括大豆原料與土壤接觸（如土壤中常見B.ce?reus對原料污染）和灌溉水質(zhì)量。與豆腐生產(chǎn)相關(guān)危險因素包括受污染原材料（大豆），生產(chǎn)過程中水質(zhì)，生產(chǎn)線污染等。豆腐生產(chǎn)加熱過程可殺死存在蠟樣芽胞桿菌營養(yǎng)細(xì)胞，但蠟樣芽孢桿菌孢子和催吐劑毒素耐熱，條件合適（環(huán)境溫暖且潮濕）孢子可萌發(fā)，營養(yǎng)細(xì)胞在食物中再次生長（可發(fā)生在豆腐制造加熱過程后）。B.cereus可能是引發(fā)豆腐腐敗變質(zhì)特異性腐敗菌，且B.cereus可能來源大豆原料本身。為延長豆腐貨架期，針對大豆原料殺菌和質(zhì)量控制尤為關(guān)鍵。

豆腐二次殺菌工藝和冷鏈運(yùn)輸、貯藏處理可最大限度抑制孢子萌發(fā)和萌發(fā)后營養(yǎng)細(xì)胞生長。Agata等研究表明，毒素產(chǎn)生以蠟樣芽孢桿菌大量繁殖為前提，其中嘔吐毒素產(chǎn)生需要106～108cfu·g-1B.cereus[17-18]。因此，如蠟樣芽孢桿菌被認(rèn)定為豆腐變質(zhì)特異性腐敗菌（Specific spoilage organism），其在食物中含量可作為評價食品品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)之一。

預(yù)測微生物學(xué)模型在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛，但食品成分復(fù)雜，基于培養(yǎng)基計數(shù)機(jī)械性模型已不適用。此外，雖然不同恒定溫度下微生物生長曲線擬合情況較好，但食物實(shí)際儲藏環(huán)境多變，恒定溫度下設(shè)計模型難以反映變動環(huán)境實(shí)際情況，當(dāng)冷鏈斷裂或貯藏溫度變化時，微生物初始生理學(xué)狀態(tài)參數(shù)發(fā)生改變。綜上所述，預(yù)測微生物學(xué)模型在豆腐中應(yīng)用應(yīng)關(guān)注波動溫度條件下腐敗微生物生長特性改變，可結(jié)合感官、理化檢驗，為豆腐貨架期和食用品質(zhì)提供準(zhǔn)確判斷。

綜上所述，本試驗結(jié)果表明，全豆豆腐中腐敗菌經(jīng)16S rDNA測序后鑒定為T-1:Bacillus tequi?lensis或 Bacillus subtilis subsp.Inaquosorum，T-2:Bacillus tequilensis。15～30℃溫度下 Modified Gomp?ertz模型擬合精度（R2）依次為 0.99、0.98、0.98、0.99，均高于Logistic模型。隨豆腐貯藏溫度由30℃降至15℃，腐敗菌最大比生長速率（μmax）降低，延滯期（Lag time）增大。Modified Gompertz方程對應(yīng)延滯期模型和平方根模型擬合度（R2）依次為0.98和0.99，擬合精度高于Logistic方程，除去15℃下延滯期預(yù)測，Logistic方程對應(yīng)延滯期和最大比生長速率相對誤差均大于Modified Gompertz方程。15℃條件下Logistic方程和Modified Gompertz方程對應(yīng)實(shí)際貨架期依次為41.38 h（1.72 d）和40.73（1.70 d），在10℃時，Logistic方程貨架期預(yù)測值無效，Modified Gompertz方程預(yù)測出全豆豆腐貨架期為143.96 h（5.99 d）。