灰葡萄孢犬尿氨酸單加氧酶基因BcKMO 與病菌cAMP信號(hào)途徑的關(guān)系

袁雪梅，王敏，藏金萍，曹宏哲，張康，張靖，邢繼紅，董金皋

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灰葡萄孢犬尿氨酸單加氧酶基因與病菌cAMP信號(hào)途徑的關(guān)系

袁雪梅，王敏，藏金萍，曹宏哲，張康，張靖，邢繼紅，董金皋

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/河北省植物生理與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河北農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌毒素與植物分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，河北保定 071000）

【目的】明確灰葡萄孢（）犬尿氨酸單加氧酶基因與病菌cAMP信號(hào)途徑之間的關(guān)系，為進(jìn)一步闡明調(diào)控灰葡萄孢生長(zhǎng)、發(fā)育和致病力的分子機(jī)制打下基礎(chǔ)。【方法】利用cAMP信號(hào)途徑特異性抑制劑SQ22536，檢測(cè)灰葡萄孢野生型BC22、的T-DNA插入突變體BCG183和回復(fù)菌株BCG183/對(duì)cAMP信號(hào)途徑特異性抑制劑的敏感性；分別提取灰葡萄孢野生型BC22、突變體BCG183和回復(fù)菌株BCG183/中的cAMP，利用HPLC檢測(cè)各菌株中cAMP的含量；利用real-time PCR技術(shù)檢測(cè)與cAMP信號(hào)途徑中cAMP依賴的蛋白激酶（PKA）的催化亞基基因和、調(diào)節(jié)亞基基因、編碼異源三聚體G-蛋白G亞基基因和在病菌不同發(fā)育階段、組織部位以及培養(yǎng)條件下的表達(dá)規(guī)律；利用real-time PCR技術(shù)檢測(cè)突變體中cAMP信號(hào)途徑關(guān)鍵基因、、、、的表達(dá)水平；利用real-time PCR技術(shù)檢測(cè)cAMP信號(hào)途徑關(guān)鍵基因、、、、的RNAi突變中的表達(dá)水平?！窘Y(jié)果】灰葡萄孢的T-DNA插入突變體BCG183對(duì)cAMP信號(hào)途徑特異性抑制劑SQ22536不敏感，受抑制的程度明顯低于野生型BC22和回復(fù)菌株BCG183/。的T-DNA插入突變體BCG183中cAMP含量明顯低于野生型菌株BC22和回復(fù)菌株BCG183/。與cAMP信號(hào)途徑中cAMP依賴的蛋白激酶（PKA）的催化亞基基因、編碼異源三聚體G-蛋白G亞基基因和的表達(dá)規(guī)律基本一致，均為在7 d的菌絲和菌核中表達(dá)水平較高；此外，和cAMP信號(hào)途徑關(guān)鍵基因、、、、均為在含果糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)的病菌中表達(dá)水平較高。的T-DNA插入突變體BCG183中cAMP信號(hào)途徑關(guān)鍵基因、、、、的表達(dá)水平均明顯高于野生型BC22和回復(fù)菌株BCG183/。、的RNAi突變體中表達(dá)水平明顯高于野生型，而、、的RNAi突變體中表達(dá)水平明顯低于野生型?！窘Y(jié)論】負(fù)調(diào)控cAMP信號(hào)途徑關(guān)鍵基因、、、、的表達(dá)；cAMP信號(hào)途徑關(guān)鍵基因、負(fù)調(diào)控的表達(dá)，而cAMP信號(hào)途徑關(guān)鍵基因、、正調(diào)控的表達(dá)。

灰葡萄孢；；cAMP信號(hào)途徑

0 引言

【研究意義】灰葡萄孢（）是一種重要的植物病原真菌，在全球230多種植物上造成灰霉病[1-2]。由于灰葡萄孢的寄主范圍廣泛，遺傳變異速度快，產(chǎn)生的菌核抵抗逆境能力強(qiáng)，使得灰霉病很難防控[3-6]。隨著灰葡萄孢菌株B05.10和T4基因組序列的發(fā)布，灰葡萄孢已經(jīng)成為研究病原物與植物互作的模式真菌[7]。探究灰葡萄孢生長(zhǎng)、發(fā)育與致病的分子機(jī)制，不僅可為制定持久控制灰霉病的策略提供理論依據(jù)和實(shí)踐基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)研究其他真菌的遺傳、發(fā)育和致病性具有重要參考價(jià)值。【前人研究進(jìn)展】灰葡萄孢的cAMP信號(hào)途徑在病菌生長(zhǎng)、發(fā)育和致病過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[8]，該途徑中包括3個(gè)編碼異源三聚體G-蛋白G亞基（Gsubunits）的基因[9-10]、[11]和[12]，腺苷酸環(huán)化酶編碼基因（adenylate cyclase）[13]，cAMP依賴的蛋白激酶（the cAMP-dependent protein kinase，PKA）催化亞基基因（PKA catalytic subunit）、（PKA catalytic subunit）和調(diào)節(jié)亞基基因（PKA regulatory subunit）[14]，這些基因突變均會(huì)影響病菌的生長(zhǎng)、發(fā)育和致病力。的缺失突變體?能夠產(chǎn)生分生孢子，穿透植物組織，但不能產(chǎn)生軟腐癥狀[9-10]。和的缺失突變體Δ和Δ雖可以侵染寄主，但是侵染速度較野生型緩慢[11-12]。的缺失突變體Δ在寄主體內(nèi)不能產(chǎn)生分生孢子，但在培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢能力不受影響，侵染速度較野生型慢[13]。的缺失突變體Δ生長(zhǎng)緩慢，不能在寄主葉片上產(chǎn)生病斑，但在寄主葉片上的產(chǎn)孢能力不受影響[14]。的缺失突變體Δ在生長(zhǎng)速度、分生孢子萌發(fā)、侵染寄主等方面與野生型沒(méi)有明顯差別[14]。缺失會(huì)導(dǎo)致突變體組成型激活PKA，使突變體?的表型與突變體?基本一致[14]。【本研究切入點(diǎn)】實(shí)驗(yàn)室前期獲得了灰葡萄孢致病相關(guān)基因（kynurenine 3-monooxygenase），明確了正調(diào)控病菌的生長(zhǎng)、發(fā)育，負(fù)調(diào)控病菌的致病力，確定了通過(guò)調(diào)控病菌的胞壁降解酶活性、毒素活性、產(chǎn)酸能力、致病相關(guān)基因及信號(hào)途徑基因的表達(dá)而影響病菌的致病力[15-17]。但是該基因與病菌cAMP信號(hào)途徑之間的關(guān)系尚未明確?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)檢測(cè)灰葡萄孢突變體對(duì)cAMP信號(hào)途徑抑制劑的敏感性、突變體中cAMP含量以及與cAMP信號(hào)途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)規(guī)律、突變對(duì)cAMP信號(hào)途徑關(guān)鍵基因表達(dá)的影響，以及cAMP信號(hào)途徑關(guān)鍵基因突變對(duì)表達(dá)的影響，確定與cAMP信號(hào)途徑關(guān)鍵基因之間的關(guān)系，為闡明調(diào)控病菌生長(zhǎng)、發(fā)育和致病力的分子機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2017年在河北省植物生理與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河北農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌毒素與植物分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 試驗(yàn)材料

灰葡萄孢野生型菌株BC22、的T-DNA插入突變體BCG183、回復(fù)菌株BCG183/、cAMP信號(hào)途徑關(guān)鍵基因、、、、的RNAi突變體菌株，均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌毒素與植物分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存并提供。

1.2 突變體對(duì)cAMP信號(hào)途徑抑制劑的敏感性檢測(cè)

在滅菌后的PDA培養(yǎng)基中加入cAMP信號(hào)途徑特異性的抑制劑SQ22536母液，使SQ22536終濃度為10 μmol·L-1，然后接種培養(yǎng)7 d的灰葡萄孢野生型菌株BC22、的T-DNA插入突變體BCG183和的回復(fù)菌株BCG183/的菌盤（直徑為5 mm），20℃條件下培養(yǎng)，觀測(cè)病菌菌落的生長(zhǎng)速率。同時(shí)，以在PDA培養(yǎng)基中加入與SQ22536母液等量的DMSO為空白對(duì)照。

1.3 突變體中cAMP的含量檢測(cè)

分別提取灰葡萄孢野生型BC22、突變體BCG183和回復(fù)菌株BCG183/中的cAMP，利用HPLC檢測(cè)各菌株中cAMP的含量。cAMP的提取方法：稱取約0.1 g樣本，加入液氮研磨后，加入1 mL水，并將其轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，50℃水浴1 h并且振蕩3—4次，8 000×離心10 min，取上清液，氮?dú)獯蹈珊蠖ㄈ葜?.5 mL，渦旋振蕩溶解，過(guò)濾后待測(cè)。HPLC液相條件：Agilent 1100高效液相色譜儀，Kromasil C18反相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相A：一定濃度的KH2PO4水溶液。流動(dòng)相B：色譜級(jí)甲醇1 L，A﹕B=80﹕20。樣品進(jìn)樣量10 μL，流速0.8 mL·min-1，柱溫30℃，走樣時(shí)間為20 min，紫外波長(zhǎng)254 nm。

1.4 BcKMO與cAMP信號(hào)途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)規(guī)律分析

1.4.1 病菌不同發(fā)育階段、不同部位的基因表達(dá)規(guī)律分析 分別收集野生型菌株BC22的菌絲生長(zhǎng)時(shí)期、附著胞發(fā)育時(shí)期、分生孢子時(shí)期和菌核發(fā)育時(shí)期的菌絲、分生孢子和菌核，提取其RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用real-time PCR技術(shù)，以作為內(nèi)參，分析和cAMP途徑關(guān)鍵基因、、、、的表達(dá)規(guī)律。反應(yīng)體系（10 μL）：模板cDNA 1.0 μL、Mix（5 U·μL-1）5 μL、引物（10 μmol·L-1）0.2 μL。反應(yīng)程序：95℃ 10 min；94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 30 s，循環(huán)數(shù)為35次，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.4.2 不同培養(yǎng)條件對(duì)和cAMP信號(hào)途徑關(guān)鍵基因表達(dá)的影響 將灰葡萄孢野生型菌株BC22分別接種在含蔗糖、葡萄糖、果糖、甘油的YEB培養(yǎng)基中，在20℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d，提取其RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以作為內(nèi)參，利用real-time PCR技術(shù)，分析、、、、的表達(dá)情況。具體反應(yīng)體系同上。

1.5 BcKMO基因突變對(duì)cAMP信號(hào)途徑關(guān)鍵基因表達(dá)的影響

利用real-time PCR技術(shù)，檢測(cè)野生型菌株BC22、突變體BCG183、回復(fù)菌株BCG183/中cAMP信號(hào)途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)水平。以BC22、BCG183、BCG183/的cDNA為模板，以為內(nèi)參，用cAMP信號(hào)途徑關(guān)鍵基因的特異性引物（表1）進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。

1.6 cAMP信號(hào)途徑關(guān)鍵基因突變對(duì)BcKMO表達(dá)的影響

利用real-time PCR技術(shù)，檢測(cè)cAMP信號(hào)途徑關(guān)鍵基因RNAi突變體中的表達(dá)水平。以cAMP信號(hào)途徑關(guān)鍵基因RNAi突變體的cDNA為模板，為內(nèi)參，用特異性引物（表1）進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 突變體對(duì)cAMP信號(hào)途徑抑制劑的敏感性

檢測(cè)灰葡萄孢野生型菌株BC22、的T-DNA插入突變體BCG183和回復(fù)菌株BCG183/對(duì)cAMP信號(hào)途徑特異性抑制劑SQ22536的敏感性，發(fā)現(xiàn)突變體BCG183對(duì)抑制劑SQ22536的敏感性明顯低于野生型和回復(fù)菌株，抑制率測(cè)定結(jié)果也表現(xiàn)出突變體BCG183受抑制的程度明顯降低（圖1）。

2.2 突變體中cAMP含量檢測(cè)

利用HPLC方法，檢測(cè)灰葡萄孢野生型BC22、突變體BCG183和回復(fù)菌株BCG183/中的cAMP含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變體BCG183中cAMP含量明顯低于野生型和回復(fù)菌株BCG183/（圖2）。

A：敏感性測(cè)定Sensitivity detection；B：抑制率檢測(cè)Detection of inhibition rate

圖2 突變體中cAMP含量的測(cè)定

2.3 BcKMO與cAMP信號(hào)途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)規(guī)律分析

2.3.1 病菌不同發(fā)育階段、不同組織部位的基因表達(dá)分析 利用real-time PCR技術(shù)，以作為內(nèi)參基因，檢測(cè)在病菌不同發(fā)育階段、不同部位和cAMP信號(hào)途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，和cAMP信號(hào)途徑關(guān)鍵基因在菌絲、分生孢子和菌核中均有所表達(dá)，在6—8 d的菌絲和菌核中表達(dá)水平高；cAMP途徑關(guān)鍵基因、、的表達(dá)規(guī)律與基本一致，均是在6、7 d的菌絲和菌核中表達(dá)水平高；cAMP途徑關(guān)鍵基因、在6、7 d的菌絲中表達(dá)水平較高，但在菌核和分生孢子中的表達(dá)水平相對(duì)較低（圖3）。

表1 Real-time PCR引物設(shè)計(jì)

1—6：菌絲生長(zhǎng)第3—8天 The 3rd to 8th day of mycelia growth；7：菌絲生長(zhǎng)第15天 The 15th day of mycelia growth；8：菌核 Scleroia；9：分生孢子Conidia

2.3.2 不同培養(yǎng)條件對(duì)和cAMP信號(hào)途徑關(guān)鍵基因表達(dá)的影響 提取不同培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的野生型菌株BC22的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用real-time PCR技術(shù)，以作為內(nèi)參基因，檢測(cè)和cAMP信號(hào)途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，和cAMP信號(hào)途徑關(guān)鍵基因均在含果糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)的病菌中表達(dá)水平最高（圖4）。

2.4 BcKMO基因突變對(duì)cAMP信號(hào)途徑關(guān)鍵基因表達(dá)的影響

利用real-time PCR技術(shù)，檢測(cè)野生型菌株BC22、突變體BCG183和回復(fù)菌株BCG183/中cAMP信號(hào)途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，野生型和回復(fù)菌株中cAMP信號(hào)途徑關(guān)鍵基因表達(dá)水平基本一致，而在突變體BCG183中cAMP途徑關(guān)鍵基因、、、、的表達(dá)水平均明顯高于野生型和回復(fù)菌株（圖5）。

2.5 cAMP信號(hào)途徑關(guān)鍵基因突變對(duì)BcKMO表達(dá)的影響

利用real-time PCR技術(shù)，檢測(cè)cAMP信號(hào)途徑關(guān)鍵基因RNAi突變體中的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，、的RNAi突變體中表達(dá)水平明顯高于野生型，而、、的RNAi突變體中表達(dá)水平明顯低于野生型（圖6）。

3 討論

真菌的cAMP信號(hào)途徑可以參與不同的生物進(jìn)程，包括病菌的生長(zhǎng)[18]、分生孢子形成[19]、分生孢子萌發(fā)[20-23]、次生代謝[24-25]、營(yíng)養(yǎng)感知[26-27]、應(yīng)激反應(yīng)[18,23]、菌核發(fā)育[28]、致病性或毒力[29]?；移咸焰遚AMP信號(hào)途徑相關(guān)基因突變影響病菌的生長(zhǎng)、發(fā)育和致病力，如[9-10]、[11]、[12]、[13]、、和[14]等基因突變均會(huì)影響病菌的生長(zhǎng)、發(fā)育和致病力。

圖4 不同培養(yǎng)條件對(duì)BcKMO和cAMP信號(hào)途徑關(guān)鍵基因表達(dá)的影響

圖5 突變體BCG183和BCG183/BcKMO中cAMP信號(hào)途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)分析

筆者實(shí)驗(yàn)室前期明確了正調(diào)控病菌的生長(zhǎng)、發(fā)育，負(fù)調(diào)控病菌的致病力[15-16]，但是該基因是否通過(guò)病菌的cAMP信號(hào)途徑起作用，以及該基因與病菌cAMP信號(hào)途徑關(guān)鍵基因之間的關(guān)系尚未明確。本研究發(fā)現(xiàn)的T-DNA插入突變體BCG183對(duì)cAMP信號(hào)途徑特異性抑制劑SQ22536不敏感，其抑制率明顯低于野生型和回復(fù)菌株；而回復(fù)菌株的抑制率明顯高于野生型，這與回復(fù)菌株中的高水平表達(dá)相一致[16]，表明的表達(dá)水平與菌株對(duì)抑制劑的敏感性呈正相關(guān)。突變體BCG183和回復(fù)菌株中的cAMP含量明顯低于野生型，且突變體BCG183中的cAMP含量最低，表明菌株中的高水平表達(dá)和低水平表達(dá)均對(duì)體內(nèi)cAMP含量造成影響。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與cAMP信號(hào)途徑關(guān)鍵基因在表達(dá)規(guī)律上存在一定的相關(guān)性，由此確定與病菌的cAMP信號(hào)途徑密切相關(guān)，該基因通過(guò)病菌cAMP信號(hào)途徑對(duì)病菌生長(zhǎng)、發(fā)育和致病力的起調(diào)控作用。

圖6 cAMP途徑關(guān)鍵基因的RNAi突變體中BcKMO表達(dá)分析

利用real-time PCR技術(shù)，檢測(cè)突變體BCG183中cAMP信號(hào)途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)突變體BCG183中cAMP途徑關(guān)鍵基因、、、、的表達(dá)水平均明顯高于野生型和回復(fù)菌株，這說(shuō)明基因突變上調(diào)、、、、的表達(dá)，表明負(fù)調(diào)控病菌cAMP信號(hào)途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)。利用real-time PCR技術(shù)，檢測(cè)cAMP信號(hào)途徑關(guān)鍵基因、、、、的RNAi突變體中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在、的RNAi突變體中上調(diào)表達(dá)，在、、的RNAi突變體中均下調(diào)表達(dá)，表明、負(fù)調(diào)控的表達(dá)，、、正調(diào)控的表達(dá)。

研究結(jié)果確定了與病菌cAMP信號(hào)途徑密切相關(guān)，明確了與cAMP信號(hào)途徑關(guān)鍵基因、、、、之間的調(diào)控關(guān)系，但是通過(guò)cAMP信號(hào)途徑調(diào)控病菌生長(zhǎng)、發(fā)育和致病力的分子機(jī)制尚未明確，需要進(jìn)一步的深入研究。

4 結(jié)論

灰葡萄孢負(fù)調(diào)控cAMP途徑關(guān)鍵基因、、、、的表達(dá)。cAMP途徑關(guān)鍵基因、負(fù)調(diào)控的表達(dá)，而cAMP途徑關(guān)鍵基因、、正調(diào)控的表達(dá)。

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（責(zé)任編輯 岳梅）

Relationship between kynurenine 3-monooxygenase geneand cAMP signaling pathway in

YUAN Xuemei, WANG Min, ZANG Jinping, CAO Hongzhe, ZHANG Kang, ZHANG Jing, XING Jihong, DONG Jingao

(College of Life Sciences, Hebei Agricultural University/Key Laboratory of Hebei Province for Plant Physiology and Molecular Pathology/Mycotoxin and Molecular Plant Pathology Laboratory of Hebei Agricultural University, Baoding 071000, Hebei)

【Objective】The objective of this study is to analyze the relationship betweenand cAMP signaling pathway in, and to lay a foundation for clarifying the molecular mechanism of thein growth, development and pathogenicityin. 【Method】A specific inhibitor SQ22536 of cAMP signaling pathway was used to detect the sensitivity of the wild-type strain BC22, theT-DNA insertion mutant BCG183, and thecomplementing mutant BCG183/. The cAMP was extracted from the wild-type strain BC22, theT-DNA insertion mutant BCG183, and thecomplementing mutant BCG183/and detected by using HPLC assay, respectively. Real-time PCR technology was used to detectexpression pattern of the,the PKA catalytic subunit geneand, the PKA regulatory subunit gene, G-protein Gsubunits geneandBC22. The expression level of cAMP signaling pathway key genes,,,, andmutants BCG183 and BCG183/was detected by using real-time PCR technology. The expression levelofin RNAi mutantsof cAMP signaling pathway key genes,,,, andwas detected by using real-time PCR technology.【Result】TheT-DNA insertion mutant BCG183 was insensitive to the cAMP signaling pathway specific inhibitor SQ22536. The inhibition rate of the cAMP signaling pathway specific inhibitor SQ22536 to mutant BCG183 was significantly lower than the wild-type strain BC22and thecomplementing mutant BCG183. The cAMP content of the mutant BCG183 was significantly lower than that of the wild-type strain BC22 and the mutant BCG183/. The expression pattern of, the PKA catalytic subunit gene, G-protein Gsubunits geneandwas basically the same, and the expression level of,,, andwas higher in 7th day of mycelia and sclerotia of BC22. In addition,the expression level ofand the cAMP signaling pathway key genes,,,, andwas higher in BC22 cultured on medium with fructose. The expression level of cAMP signaling pathway key genes,,,,strains BC22 and BCG183/. Theexpression level in the RNAi mutants ofandwas obviously higher than that of BC22, theexpression level in the RNAi mutants of,, andwas obviously lower than that of BC22.【Conclusion】Thenegatively regulated the expression of,,,, and. Theandnegatively regulated theexpression, and the,, andpositively regulated theexpression.

;; cAMP signaling pathway

2018-01-23；

2018-03-02

河北省自然科學(xué)基金（C2018204045）、河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（ZD2016001）、河北省留學(xué)人員科技活動(dòng)擇優(yōu)資助項(xiàng)目（0316012）

袁雪梅，E-mail：2420788532@qq.com。王敏，E-mail：1546994436@qq.com。袁雪梅和王敏為同等貢獻(xiàn)作者。

邢繼紅，E-mail：xingjihong2000@126.com。通信作者董金皋，E-mail：dongjingao@126.com

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.13.006