抗體藥物純化方法研究進(jìn)展

翟東改，陳凌，錢平

（江蘇蘇青生物技術(shù)有限公司，江蘇無錫 214000）

抗體是由抗原刺激而產(chǎn)生，并能與刺激其產(chǎn)生的抗原發(fā)生特異性結(jié)合的具有免疫功能的糖蛋白[1]。通常把血清或血漿中的抗體成分稱為免疫球蛋白（Ig），不同的重鏈和輕鏈組成完整的Ig分子，分別為IgM、IgG、IgA、IgD和IgE等?？贵w藥物的生產(chǎn)由于其生物料液的復(fù)雜性以及對抗體產(chǎn)品要求的嚴(yán)格性使抗體純化過程成為了抗體生產(chǎn)的關(guān)鍵，該純化過程約占抗體藥物生產(chǎn)成本的50%～80%?？贵w的分離純化一般分為樣品的粗提、粗提物精制、抗體精純?nèi)齻€(gè)步驟[2]，抗體生產(chǎn)的基本流程如圖1所示。

圖1 抗體生產(chǎn)基本流程步驟[3]

常規(guī)的抗體分離純化方法有鹽析法、超濾法、色譜層析分離法等，其中色譜層析方法在抗體純化過程中應(yīng)用比較廣泛，主要包括離子交換層析、疏水層析、親和層析、凝膠過濾等。親和層析由于其高選擇性、特異性，成為抗體純化非常有效的方法之一，同時(shí)可以減少純化步驟，縮短純化時(shí)間。

1 常規(guī)分離方法

1.1 鹽析法

根據(jù)不同的蛋白質(zhì)的疏水性特點(diǎn)，提高鹽濃度、增加其疏水性，從而使蛋白沉淀。影響鹽析的主要因素為溫度、pH、樣品濃度。通常鹽析法作為抗體的粗提技術(shù)，要想獲得高純度的抗體需要與其他的色譜方法結(jié)合。

1.2 超濾法

超濾技術(shù)是20世紀(jì)70年代興起的一種新的分離技術(shù)，該技術(shù)成本及能耗低，操作條件溫和，特別適用于活性分子的提取。但隨超濾的不斷進(jìn)行，膜容易出現(xiàn)污染，需要定期的進(jìn)行膜清洗，另外在超濾過程中蛋白容易發(fā)生聚集。

2 色譜層析方法

2.1 離子交換色譜

利用離子交換劑為固定相，根據(jù)荷電溶質(zhì)與離子交換劑之間的靜電相互作用力的差別進(jìn)行溶質(zhì)分離[4]。通過調(diào)節(jié)緩沖液及樣品的pH，使抗體帶上電荷，與帶相反電荷的介質(zhì)結(jié)合，結(jié)合在介質(zhì)上的抗體分子可通過改變洗脫緩沖液的pH或者鹽濃度而洗脫下來。離子交換色譜的吸附性能取決于樣品的鹽濃度，鹽濃度過高抗體無法吸附，因此需預(yù)先對原料液除鹽，降低鹽濃度后才可以上柱。另外，過高或者過低pH也容易引起抗體的活性喪失。

2.2 凝膠過濾

根據(jù)料液中溶質(zhì)相對分子量的差別進(jìn)行分離，但是其具有選擇性低，料液的處理量?。?%CV）等特點(diǎn)，因此常作為精制步驟。

2.3 疏水層析

根據(jù)蛋白質(zhì)與疏水性吸附劑之間疏水相互作用的差別進(jìn)行蛋白質(zhì)類生物大分子分離。一般是高鹽吸附、低鹽洗脫?？贵w由于其分子中有許多非極性氨基酸（色氨酸、酪氨酸、丙氨酸等），暴露于抗體分子表面的非極性氨基酸側(cè)鏈可以密集在一起形成疏水區(qū)[5]，疏水區(qū)與吸附劑結(jié)合，達(dá)到純化抗體的目的。

2.4 疏水電荷誘導(dǎo)色譜

疏水電荷誘導(dǎo)色譜（HCIC）的吸附機(jī)理是基于對偶模式的離子化配基的pH依賴的行為，配基同時(shí)包括疏水基團(tuán)和弱離子化基團(tuán)。流動(dòng)相的pH值在6～9的范圍內(nèi)，配基不帶電，配基和間隔臂作為疏水位點(diǎn)，并且通過疏水作用結(jié)合蛋白，因此不需要加入鹽即可實(shí)現(xiàn)對蛋白的吸附。當(dāng)降低流動(dòng)相的pH值，配基帶上正離子電荷，此時(shí)蛋白質(zhì)也帶上凈正電荷，由于蛋白質(zhì)和配基之間的靜電排斥作用而發(fā)生解吸。最早的吸附劑為Pall公司提供的MEP HyperCel（4-巰基乙基吡啶）。Guerrier等[6]通過MEP HyperCel一步層析分離操作，從腹水或含5%牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液中有效捕獲抗體，純度分別達(dá)到83%、69%，IgG的動(dòng)態(tài)載量達(dá)25～35mg/mL介質(zhì)[7]。

2.5 親和層析

親和層析利用功能分子特定的結(jié)構(gòu)與生物分子可逆的特異性相互識別并結(jié)合。常見的結(jié)合類型為酶與底物、抗原與抗體。由于其高度的特異性及同時(shí)具有濃縮的效果，已廣泛用于從大量的復(fù)雜溶液中分離少量的特定蛋白質(zhì)，如抗體。

2.5.1 親和層析基質(zhì)

親和層析是基于抗體分子和偶聯(lián)在固相基質(zhì)上的親和配基之間的特異性識別實(shí)現(xiàn)抗體純化，用于固定配體的固相基質(zhì)分為天然的固相基質(zhì)（如瓊脂糖、葡聚糖、纖維素）、化學(xué)合成的固相基質(zhì)（如丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯）、無機(jī)骨架固相基質(zhì)（如多孔硅膠、玻璃纖維）。親和基質(zhì)的種類及市售代表產(chǎn)品見表1。在過去的幾十年中，磁珠作為親和分離基質(zhì)備受關(guān)注，在1970年逐漸應(yīng)用到化學(xué)，制藥及生物技術(shù)領(lǐng)域。

2.5.2 配基

目前，抗體親和純化介質(zhì)常用的配基主要有生物活性配基、合成配基、親和仿生配基。

2.5.2.1 生物活性配基

主要有天然蛋白，如蛋白A、蛋白G、蛋白L、凝集素、抗原等。

（1）蛋白A于1940年第一次被Verwey從金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）細(xì)胞壁中分離，是一種能與人及多種哺乳動(dòng)物血清免疫球蛋白分子發(fā)生非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。野生型蛋白A基因編碼序列由1464個(gè)堿基組成（不包括編碼N端信號肽的108個(gè)堿基），共編碼488個(gè)氨基酸，分子量約為42 kD。蛋白A從N端至C端依次由S、E、D、A、B、C、X結(jié)構(gòu)域組成。單個(gè)結(jié)構(gòu)域均具備結(jié)合抗體Fc片段和VH3亞類抗體Fab片段的能力。

（2）蛋白G來源于化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的細(xì)胞壁蛋白[17]。蛋白G和免疫球蛋白IgG有較強(qiáng)的結(jié)合。與多數(shù)哺乳動(dòng)物的IgG的Fc段結(jié)合，與Fab段也有氫鍵的相互作用，但不結(jié)合人IgM、IgD和IgA，與蛋白A相比，具有更廣的IgG結(jié)合能力。

（3）蛋白L是從消化鏈球菌（Peptostreptococcusmagnus）中分離出來的蛋白[18]。對于抗體可變區(qū)域的Kappa輕鏈片段（Kappa light chain）有很強(qiáng)的親和力，能夠與免疫球蛋白的k1、k3和k4輕鏈結(jié)合，但不與k2和L輕鏈（Lambda lightchain）結(jié)合，適合于純化免疫球蛋白的片段，如scFv、Fab、F(ab')2等。目前沒有發(fā)現(xiàn)蛋白L可以與抗體的Fc段及重鏈結(jié)合。蛋白L結(jié)合抗體的種類范圍比較寬，包括IgG、IgM、IgA、IgE和IgD，可以識別50%的人及75%的鼠免疫球蛋白。天然配基及與抗體的結(jié)合位點(diǎn)見表2。

表1 親和基質(zhì)的分類

表2 天然蛋白配基與抗體的結(jié)合位點(diǎn)

（4）凝集素（lectin）是一種從植物或動(dòng)物中提純的糖蛋白或結(jié)合糖的蛋白，可以與抗體的糖基化位點(diǎn)特異可逆的結(jié)合，因此被用來純化抗體。常用的如伴刀豆球蛋白A（ConA）、小麥胚芽凝集素（WGA）、甘露聚糖-結(jié)合蛋白（MBPs）。凝集素一般用來純化IgD、IgA、IgM，通常中性pH條件下結(jié)合，中性條件0.1～0.5M鹽濃度下洗脫[22]。最常用的伴刀豆親和介質(zhì)在pH7.4條件下對抗體的動(dòng)態(tài)吸附載量最高，在2M鹽濃度下90%的抗體可以被完全洗脫，而且在使用10個(gè)循環(huán)以后，捕獲IgG的能力不變[23]。

（5）抗原或者抗體作為配基，整個(gè)抗原作為配基的親和介質(zhì)可純化抗體，特異性的肽段作為親和配基也可以純化抗體同時(shí)模擬抗原的結(jié)構(gòu)或序列的配基也可以實(shí)現(xiàn)抗體純化，但是需要篩選其親和性能，而且要進(jìn)一步優(yōu)化抗體的洗脫條件。單結(jié)構(gòu)域抗體（sdAb）由于其分子量小，高親和性及穩(wěn)定性通常用于抗體純化，但是sdAb其載量較低，因此在純化工藝中比較受限。

2.5.2.2 合成配基

TAC（Thiophilic adsorption chromatography）又稱親硫色譜、嗜硫色譜。嗜硫色譜介質(zhì)上配基砜-硫醚基團(tuán)在一定濃度鹽濃度條件下（通常為硫酸鹽和磷酸鹽），可與抗體表面適當(dāng)?shù)奈稽c(diǎn)相互作用，通過降低鹽濃度洗脫抗體，對抗體和巨球蛋白具有顯著的親和吸附性。Porath在1985年首次用嗜硫色譜從血清中分離出抗體。最早的TAC吸附劑為T-GEL，是瓊脂糖經(jīng)過二乙烯砜（DVS）活化再與2-巰基乙醇（2-ME）作用生成砜-硫醚基團(tuán)，對IgG的吸附容量為18～28g/L。嗜硫色譜已廣泛應(yīng)用于牛IgG抗體[24]、雞蛋IgY、F(ab’)2、Fab片段以及大腸桿菌scFvs[25]。另外，磁珠經(jīng)DVB和VAC處理后，偶聯(lián)雜環(huán)配基如2-羥基吡啶純化人血清中的抗體，抗體純度＞94%，生物活性＞99%[26]。

HAC羥基磷灰石層析（hydroxyapatite chromatography，HAC）是以羥基磷灰石為介質(zhì)的層析分離技術(shù)。羥基磷灰石的分子式為Ca10(PO4)6(OH)2，是一種含鈣礦物質(zhì)。羥基磷灰石上的2個(gè)作用位點(diǎn)，其中帶負(fù)電的PO4的位點(diǎn)可以與帶正電的蛋白質(zhì)以離子鍵結(jié)合，具有離子交換的特性，可采用鹽濃度梯度洗脫；而帶正電Ca2+位點(diǎn)可與帶負(fù)電蛋白質(zhì)的自由羧基以金屬螯合方式結(jié)合[27]。HAC與蛋白A、蛋白G一樣可一步純化IgG，也可以用于IgA、IgM的捕獲，載量10～20mg/mL，純度＞90%。通常在用鹽濃度梯度洗脫目標(biāo)時(shí)時(shí)加入PEG，可更好的去除聚集體、宿主蛋白、DNA、內(nèi)毒素以及病毒[28]。

IMAC固定化金屬螯合親和層析主要利用暴露的蛋白質(zhì)殘基（組氨酸、賴氨酸、色氨酸等）和介質(zhì)上的金屬離子（銅、鋅、鈷、鎳等）之間的相互作用不同而分離蛋白質(zhì)。IMAC可以用來純化不同物種的抗體以及不同抗體的亞種，主要用于分離一些通過基因工程手段獲得的帶有氨基酸殘基的抗體片段，如scFv。IMAC的配基通常為NTA、IDA，中性條件下結(jié)合，通過改變pH或者競爭吸附（咪唑）進(jìn)行洗脫。

硼酸親和層析主要是利用硼酸或其衍生物作為配基，與抗體Fc片段的多聚糖結(jié)合，完成抗體純化。硼酸親和具有低成本，高穩(wěn)定性以及通過改變pH條件快速將抗體洗脫解離的優(yōu)點(diǎn)。

2.5.2.3 親和仿生配基

隨著蛋白晶體解析技術(shù)的快速發(fā)展和計(jì)算機(jī)分子模擬技術(shù)的不斷進(jìn)步，親和仿生配基技術(shù)得到了強(qiáng)有力的支撐，通過分子模擬對蛋白結(jié)構(gòu)和潛在的配基結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行分析，采用分子對接和分子動(dòng)力學(xué)模擬等手段設(shè)計(jì)和篩選出潛在的配基[29]。目前，應(yīng)用比較廣泛的親和仿生配基為化學(xué)合成仿生配基和短肽仿生配基。

化學(xué)合成仿生配基是通過化學(xué)方法合成親和仿生配基，分子量相對較小，與目標(biāo)蛋白具有一定的親和性，而且能夠以共價(jià)鍵的形式偶聯(lián)到基質(zhì)上。目前，化學(xué)合成配基主要為基于三嗪結(jié)構(gòu)的配基[30-33]和多組分反應(yīng)合成的配基[34-35]。Li等[33]以蛋白A作為模板，設(shè)計(jì)了基于三嗪類的仿生配基。通過分析蛋白A與IgG-Fc片段復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，確定二者間的特異性識別位點(diǎn)，以關(guān)鍵殘基Phe132-Tyr133二肽作為模板設(shè)計(jì)仿生配基Ligand 22/8，將其偶聯(lián)到瓊脂糖基質(zhì)上用于分離血漿中的抗體，吸附容量可達(dá)到50 mg/g介質(zhì)以上，抗體收率大于60%，純度大于92%，且該介質(zhì)可以在1mol/LNaOH中保存7天[30]?；谠撆浠纳虡I(yè)化介質(zhì)MabSorbentA1P和A2P，已應(yīng)用于單克隆抗體和Fc融合蛋白的分離純化，可以達(dá)到蛋白 A 親和層析的效果。

短肽仿生配基是以氨基酸作為原料，通過設(shè)計(jì)、篩選和優(yōu)化保證與目標(biāo)蛋白的親和性的小肽。分為線性肽、環(huán)肽、多聚肽配基。Yang等[36]在IgG的Fc片段構(gòu)建了以N端開始依次為組氨酸-芳香族氨基酸-堿性氨基酸的六肽庫，利用組合化學(xué)進(jìn)行篩選，得到了特異性結(jié)合Fc片段的六肽配基HWRGWV，可純化人、牛、鼠、羊、兔的IgG。Fassina等[37]通過篩選多聚肽庫，得到特異性識別IgG的Fc片段多聚肽，命名為TG19318。TG19318親和柱能在中性低離子強(qiáng)度緩沖液中吸附抗體，與從細(xì)胞培養(yǎng)上清獲得的原始料液的物化性質(zhì)完全兼容，用pH3.0醋酸溶液或pH9.0碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)緩沖液pH值至酸性或弱堿性，就能洗脫吸附的抗體。TG19318比蛋白A具有更廣泛的特異性，不僅能純化IgG，還能純化IgY、IgM、IgA和IgE。

3 總結(jié)和展望

抗體藥物迅猛發(fā)展，抗體的純化問題日益突顯，高效、低成本、高純度地獲得抗體成為最關(guān)鍵的步驟?，F(xiàn)通用的蛋白A介質(zhì)成本高，且不耐受苛刻條件，因此需開發(fā)經(jīng)濟(jì)有效的純化方法。疏水電荷誘導(dǎo)層析由于其選擇性較好，洗脫條件相對溫和、價(jià)格低廉，而且初始樣品可不經(jīng)預(yù)處理直接上柱，操作簡便，若大規(guī)模應(yīng)用于抗體純化，會(huì)帶來很高的經(jīng)濟(jì)效益。另外，短肽類仿生親和配基與生物親和配基具有相似的親和力，然而構(gòu)象更加穩(wěn)定，并且已成功應(yīng)用于抗體純化。隨著計(jì)算機(jī)輔助技術(shù)及高通量篩選技術(shù)的進(jìn)以及技術(shù)的推廣，仿生親和技術(shù)應(yīng)用會(huì)越來越廣泛，抗體的低成本、高效率生產(chǎn)指日可待。

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