胡子鯰消化道黏膜ACP、ALP、ATPase、NSE、POX和SDH的組織化學(xué)定位

任秋楠，陳婷婷，陳嫻嫻，韋勤勤，李恩，張盛周

（安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽省重要生物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蕪湖 241000）

胡子鯰（Clarias fuscus）隸屬硬骨魚綱鯰形目胡子鯰科胡子鯰屬，是一種溫水性小型淡水魚。胡子鯰肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美、營養(yǎng)價(jià)值高，在中醫(yī)藥上還有滋陰養(yǎng)血、治療水腫的功效，深受消費(fèi)者喜愛。胡子鯰屬于以肉食為主的雜食性魚類，貪食，常生活在較溫暖的水體中，適合高產(chǎn)養(yǎng)殖[1]。在我國，胡子鯰主要分布于長江和長江以南各水系中，在廣東、廣西和福建等省已實(shí)現(xiàn)大規(guī)模人工養(yǎng)殖[2]，給當(dāng)?shù)貛砹撕艽蟮慕?jīng)濟(jì)效益。

研究胡子鯰消化道的組織結(jié)構(gòu)與生理生化特征可為改進(jìn)其養(yǎng)殖技術(shù)，提高養(yǎng)殖質(zhì)量奠定理論基礎(chǔ)。鄭文彪等[3]采用掃描電鏡技術(shù)對胡子鯰消化道黏膜的表面形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察，尹苗等[4]應(yīng)用細(xì)胞化學(xué)方法對胡子鯰消化道中粘液細(xì)胞的種類和分布進(jìn)行了研究，黃周英等[5]利用生物化學(xué)手段檢測了胡子鯰消化道內(nèi)蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的活力及其分布。但目前有關(guān)胡子鯰消化道黏膜中與消化吸收相關(guān)的重要酶的分布尚未見研究報(bào)道，本研究利用冰凍切片、酶組織化學(xué)技術(shù)和光密度分析方法對胡子鯰消化道酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（ALP）、腺苷三磷酸酶（ATPase）、非特異性酯酶（NSE）、過氧化物酶（POX）和琥珀酸脫氫酶（SDH）等6種重要酶的分布和組織定位進(jìn)行了研究，旨在增進(jìn)對胡子鯰消化吸收機(jī)能的認(rèn)識，為其人工養(yǎng)殖技術(shù)的發(fā)展提供基礎(chǔ)資料。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

人工養(yǎng)殖胡子鯰7條，購自蕪湖市黃山西路菜市場，質(zhì)量200～500g，確認(rèn)正常無傷害，置于清水中暫養(yǎng)24h。敲后腦致暈，解剖取出完整消化道，在食道、胃賁門、胃體、胃幽門、前腸、中腸和后腸等7個(gè)部位取樣，用磷酸緩沖液（PBS，pH7.4）快速洗凈，吸水紙輕輕吸干，OCT包埋，進(jìn)行冰凍切片，切片厚8μm，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2 酶組織化學(xué)染色法

6種酶的組織化學(xué)染色方法和主要底物見表1。實(shí)驗(yàn)試劑的全名、詳細(xì)配制方法及具體操作步驟參見文獻(xiàn)[6]。

表1 6種酶的組織化學(xué)染色方法和主要底物Tab.1 Histochemical staining techniques and main substrates of the six investigated enzymes

3 酶活力的光密度測定和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用Olympus BX61型顯微鏡，在40倍物鏡視野下，觀察裝片并進(jìn)行顯微拍照，得到清晰的組織圖片。使用Image-Pro Plus圖像分析軟件，對選取的7個(gè)部位6種酶的組織化學(xué)染色陽性部位進(jìn)行光密度分析，得到陽性部位的累積光密度(integratedoptical density, IOD)和面積(area)的準(zhǔn)確值，算出平均光密度(mean optical density, MOD)。使用SPSS 19.0數(shù)據(jù)分析軟件，用單因素方差分析(oneway ANOVA)對消化道不同部位酶的活力大小進(jìn)行差異顯著性比較，P＜0.05為差異顯著。

結(jié) 果

經(jīng)光密度分析和數(shù)據(jù)處理后，胡子鯰消化道各部位6種重要酶的活力分布情況見表2。

1 ACP的分布與定位

陽性部位呈棕黃色，ACP在胃賁門和前腸分布最多，食道、中腸和后腸次之，而在胃體和胃幽門酶活力明顯較微弱。食道中ACP主要分布于固有層，黏膜上皮中分布較少（圖1A1）；胃賁門、胃體和胃幽門中ACP主要位于胃腺中，黏膜上皮細(xì)胞中亦有少量分布（圖1A2）；前腸、中腸和后腸ACP主要分布于黏膜上皮細(xì)胞頂部（圖1A3）。

2 ALP的分布與定位

陽性部位呈藍(lán)紫色或藍(lán)黑色，ALP在腸道的分布明顯多于其他部位，在食道、胃體和胃幽門有少量分布，而胃賁門檢測到的酶活力最為微弱。在食道中，ALP主要分布于黏膜上皮細(xì)胞底部；在胃賁門、胃體和胃幽門中，ALP位于黏膜上皮和胃腺部，酶活力微弱。在腸道中，ALP主要位于紋狀緣，固有層中亦有較多分布（圖1B）。

3 ATPase的分布與定位

陽性部位呈黑色，ATPase在前腸活力最高，中腸、胃賁門和胃幽門次之，在胃體和后腸亦有較多分布，而在食道中酶活力微弱。在食道中，ATPase主要分布于黏膜上皮細(xì)胞的表層；在胃賁門、胃體和胃幽門中，ATPase主要分布于胃腺和黏膜上皮細(xì)胞的表層（圖1C1）；在腸道中，ATPase集中分布于紋狀緣，在固有層中亦有較多分布（圖1C2）。

4 NSE的分布與定位

陽性部位呈棕紅色，NSE在胃幽門和后腸分布最多，胃賁門和胃體次之，在食道、前腸和中腸中分布最少。在食道中，NSE主要分布于黏膜上皮細(xì)胞的表層；在胃賁門、胃體和胃幽門中，NSE在黏膜基部和固有層中活力最高，在胃腺中亦有較多分布（圖1D1）；前腸和中腸NSE僅在黏膜上皮有少量分布；后腸NSE主要分布于紋狀緣和黏膜上皮細(xì)胞頂部（圖1D2）。

表2 胡子鯰消化道黏膜6種重要酶的分布Tab.2 Relative abundancy and activity of six investigated enzymes in the digestive tract mucosa of Clarias fuscus

5 POX的分布與定位

陽性部位呈黃色或棕黃色，顆粒狀，POX在后腸分布最多，其次是胃體、胃幽門和食道，在中腸、賁門和前腸酶活力明顯較弱。在食道中，POX主要分布于固有層中，黏膜上皮中分布較少（圖1E1）；在胃賁門和胃體中，POX主要分布于胃腺中，其次是黏膜上皮；在胃幽門中，POX在黏膜上皮的分布明顯多于胃腺；在前腸和中腸中，POX主要分布于固有層中，黏膜上皮中分布較少；在后腸中，POX在固有層和黏膜上皮中均有分布，酶活力較強(qiáng)（圖1E2）。

6 SDH的分布與定位

陽性部位呈藍(lán)紫色，SDH在胃賁門，胃體、胃幽門和前腸酶活力較高，其次是中腸和后腸，食道中酶的活力微弱。在食道中，SDH主要分布于黏膜上皮細(xì)胞中，其他部位幾乎沒有分布；在胃賁門、胃體和胃幽門可明顯觀察到SDH集中分布于胃腺中，黏膜上皮細(xì)胞表層亦有少量分布（圖1F1）；在腸道中，SDH主要分布于黏膜上皮頂部（圖1F2）。

討 論

ACP是一種在機(jī)體中廣泛分布的磷酸酯酶，是細(xì)胞內(nèi)溶酶體的標(biāo)志酶，主要參與胞飲作用和細(xì)胞內(nèi)消化過程[7]。研究表明，硬骨魚類腸上皮細(xì)胞可通過胞飲作用吸收營養(yǎng)物質(zhì)，胞飲作用被看作是魚類消化吸收蛋白質(zhì)的另一種途徑[8]。在各種魚類消化道中均能檢測到較高的ACP活力，但其分布部位存在一定的物種特異性。歐洲無須鱈(Meluccius meluccius)消化道中ACP分布廣泛，食道、胃和腸道中都檢測到很強(qiáng)的ACP活力[9]；烏鱧(Ophiocephalus argus)消化道ACP主要分布于中腸和后腸，胃中酶活力較低[6]；鱖魚(Siniperca chautsi)消化道ACP主要分布于前腸，胃中亦有較高的酶活力[10]。本研究顯示胡子鯰消化道ACP主要分布于前腸和中腸，胃賁門酶活力亦較高，與鱖魚較為相似，表明胡子鯰前腸和中腸有較強(qiáng)的吸收蛋白質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)消化功能。由于ACP還在核酸和蛋白質(zhì)的代謝活動及細(xì)胞的能量轉(zhuǎn)換過程中發(fā)揮重要作用[11]，故在胃賁門腺體中有較高ACP活力可能與其參與胃腺的分泌活動有關(guān)。

圖1 6種重要酶在胡子鯰消化道黏膜中的組織化學(xué)定位。A，ACP在食道（A1）、胃賁門（A2）和前腸（A3）的分布；B，ALP在中腸（B）的分布；C，ATPase在胃賁門（C1）和前腸（C2）的分布；D，NSE在胃賁門（D1）和后腸（D2）的分布；E，POX在食道（E1）和后腸（E2）的分布；F，SDH在胃賁門（F1）和后腸（F2）的分布；LP，固有層；ME，黏膜上皮；SB，紋狀緣；FG，胃底腺；比例尺，50μmFig.1 Tissue distribution of six essential enzymes in the digestive tract mucosa of Clarias fuscus by histochemical staining.A, distribution of ACP in esophagus (A1), stomach cardia (A2) and foregut (A3)；B, distribution of ALP in midgut (B)；C, distribution of ATPase in stomach cardia (C1) and foregut (C2); D, distribution of NSE in stomach cardia (D1) and hindgut (D2); E, distribution of POX in esophagus (E1) and hindgut (E2); F, distribution of SDH in stomach cardia (F1) and hindgut (F2).LP, lamina propria; ME, mucosal epithelium; SB, striated border; FG, fundic glands; scale bar, 50μm

ALP是一種在動物體內(nèi)廣泛分布的非特異性磷酸水解酶，該酶主要參與細(xì)胞的主動運(yùn)輸過程，在消化道中與脂類、葡萄糖、鈣和無機(jī)磷酸鹽等重要營養(yǎng)物質(zhì)的吸收有關(guān)[12]，常被看作是消化道吸收營養(yǎng)物質(zhì)的標(biāo)志性酶[13]。本研究顯示胡子鯰消化道ALP主要分布于腸道，與烏鱧消化道ALP主要分布于前腸和中腸相似。不同的是，烏鱧胃中亦有較高的ALP酶活力[6]，胡子鯰胃中ALP酶活力微弱；歐洲無須鱈消化道ALP主要分布在腸道中，食道和胃中酶活力較低[9]；鱖魚消化道ALP亦主要分布于腸道，胃中活力很低[10]。胡子鯰胃和腸道ALP的分布與這兩種魚相一致。由ALP的功能和分布可推斷，胡子鯰前腸、中腸和后腸均有較強(qiáng)的吸收功能。ALP 主要定位于胡子鯰腸上皮細(xì)胞的紋狀緣，與其參與腸上皮細(xì)胞的吸收功能是相適應(yīng)的。

ATPase是水解酶的一種，普遍存在于細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜上，其主要作用是水解ATP釋放能量，參與物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[14,15]。本研究在胡子鯰胃和腸道各部位均檢測到較高的ATPase活力，尤其是前腸部分。烏鱧胃中ATPase活力顯著高于腸道[6]，和胡子鯰有一定差異；ATPase在鱖魚胃和腸道均有較多分布[10]，與胡子鯰相一致。胡子鯰胃中ATPase主要定位于胃腺，可水解ATP為胃酸和胃蛋白酶的分泌提供充足的能量，腸道ATPase主要位于腸上皮細(xì)胞頂部，與其參與營養(yǎng)物質(zhì)的吸收功能相適應(yīng)。

NSE是具有促進(jìn)脂質(zhì)消化和吸收功能的一種酶，魚類的主要能量來源是脂類而不是碳水化合物和蛋白質(zhì)[9]。歐洲無須鱈消化道NSE在食道和胃中活力較低，在腸道中活力較高[9]；烏鱧胃體有較強(qiáng)的NSE酶活力，而在胃賁門、胃幽門和腸道中酶活力較弱[6]；鱖魚中腸和后腸NSE活力較高，胃賁門、胃體和前腸酶活力較低[10]。本研究顯示胡子鯰消化道NSE在胃幽門活力最高，胃賁門、胃體和后腸中亦有較高的酶活力。由此可見，魚類消化道NSE的分布有明顯的物種特異性。本研究表明胃幽門是胡子鯰消化脂質(zhì)的主要部位。胡子鯰屬于以肉食為主的雜食性魚類，對脂類的消化和吸收能力要求比較高，在其消化道的前端部位就表現(xiàn)出較強(qiáng)的NSE活力，這可能是胡子鯰對脂質(zhì)消化的特異性適應(yīng)機(jī)制。

POX是一種對細(xì)胞起保護(hù)作用的酶，可減少或消除過氧化氫、酚類和胺類等細(xì)胞毒性物質(zhì)[16]，主要存在于細(xì)胞過氧化物酶體中。該酶還參與脂類代謝過程，亦被視作一種具有免疫功能的酶[17]。POX在胡子鯰胃體和后腸分布最多，在胃幽門和食道中亦有較多分布。烏鱧胃體亦有較高的POX酶活力[6]，但與胡子鯰不同的是，烏鱧腸道中POX活力較微弱；鱖魚胃幽門中POX活力最高，腸道中酶活力較弱[10]，和胡子鯰差異較大。POX在胡子鯰胃體和幽門活力較高，可能與這兩個(gè)部位代謝活動旺盛會產(chǎn)生較多代謝毒性物質(zhì)有關(guān)。POX發(fā)揮催化功能產(chǎn)生的活性氧對病原微生物有一定的殺傷作用[11]，因而POX在胡子鯰食道和后腸有較高的活力有利于防止病原微生物的入侵，表現(xiàn)為一種保護(hù)機(jī)制。POX分布與NSE有所重合，可能與其參與脂類代謝有關(guān)。

SDH是一種以黃素為輔基的氧化還原酶，是參與三羧酸循環(huán)(TCA循環(huán))的關(guān)鍵酶，其活力大小會直接影響TCA循環(huán)的反應(yīng)速率，一般可作為TCA循環(huán)運(yùn)行強(qiáng)度的檢測指標(biāo)[18]。本研究在胡子鯰胃中檢測到很強(qiáng)的SDH酶活力，與烏鱧SDH主要分布于胃賁門和胃幽門[6]，鱖魚SDH主要分布于胃賁門和胃體[10]相似。SDH主要定位于胃腺中，和ATPase的定位相一致，與胃酸和胃蛋白酶的合成與分泌需要消耗較多的ATP能量相適應(yīng)。胡子鯰前腸黏膜上皮細(xì)胞中亦有較多SDH分布，位于上皮細(xì)胞頂部，可為上皮細(xì)胞吸收營養(yǎng)物質(zhì)提供充足的能量。

總之，胡子鯰消化道6種酶的分布和其他魚類既有相似性也有其自身的特異性。胡子鯰消化道黏膜酶的分布與消化道各部位的生理功能相適應(yīng)，6種酶的分布表明，胡子鯰的前腸和中腸有較強(qiáng)的吸收蛋白質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)消化功能，胃幽門是脂質(zhì)的主要消化部位，前腸和中腸是營養(yǎng)物質(zhì)吸收的主要部位。

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