電針對退變椎間盤AQP 1、3表達的影響*

佟思琪，鄒 璟，黃國付,3**

(1.湖北中醫(yī)藥大學，湖北 武漢 430065；2.湖北省武漢市第一醫(yī)院，湖北 武漢 430022；3.湖北省武漢市武昌醫(yī)院，湖北 武漢 430063)

腰椎間盤退變性疾病是指以椎間盤退變?yōu)椴±砘A的一類疾病，發(fā)病率高，且易反復發(fā)作，其不僅對患者的生活質量產生明顯負面影響，嚴重者甚至可能導致患者喪失勞動能力，這給患者帶來了生理、心理、經濟等多方面的負擔[1]。針灸治療本病在臨床上得到了廣泛運用，臨床很多研究也證實了電針治療腰椎間盤退行性疾病的確有較好的療效，但其治療作用機制尚不清楚。最近研究發(fā)現(xiàn)，椎間盤退變與椎間盤軟骨終板途徑營養(yǎng)供應減少密切相關，其中水通道蛋白(Aquaporins,AQPs)介導的水轉運是椎間盤組織營養(yǎng)物質供應的始動途徑[2]，提示椎間盤退變與AQPs密切相關。本研究擬觀察電針對椎間盤退變模型兔軟骨終板中AQP 1、3表達的影響，進而探討電針防治本病的可能機制。

1 材 料

①實驗器材：椎間盤施壓器；電鉆；Signa HDx3.0T磁共振器；實驗兔固定器；HANS電針儀；CX 41倒置顯微鏡。②主要試劑：甲醛溶液、二甲苯、無水乙醇、3 %H2O2、抗熒光衰減封片劑、rabbit AQP 1抗體(abcam)、rabbit AQP 3抗體(abcam)等。③實驗動物：由武漢大學實驗動物中心(合格證編號NO：42000500005757等)提供的年齡約5個～6個月的健康的骨骼發(fā)育成熟的雄性新西蘭大白兔50只，體重3.0 kg～4.0 kg。在實驗室標準條件下適應性飼養(yǎng)3周后再開始實驗。

2 治療方法

①造模方法：參照Kroeber M[3]及黃國付等的造模方法，用10 %水合氯醛(1 mL/kg)在兔耳緣靜脈注射麻醉。備皮后，分別在相鄰椎體(L4、L5)一側的椎旁約1.5 cm處做約1 cm垂直切口，鈍性分離肌肉，暴露椎體后，用克氏針(直徑1.5 mm)垂直刺入兩椎體間，并用電鉆將克氏針橫穿透椎體及對側皮膚，縫合切口。最后將自制的彈簧裝置安裝于克氏針兩端，持續(xù)施壓200 N，并維持28 d。術后常規(guī)肌肉注射青霉素預防傷口感染，4×106 U，1次/d，持續(xù)5 d。在造模第28天拆除加壓裝置后予以磁共振檢測，以評估造模成功與否。②分組：將50只兔進行編號，查隨機數(shù)字表均分為5個小組。正常組：自然條件下飼養(yǎng)，不予干預。模型組：造模成功后，不予干預。假模型組：同模型組，但在造模過程中只是安裝了自制彈簧裝置，而不施壓。模型+電針組：在造模成功后第1天起每日行電針治療1次，1個療程為6 d，每個療程之間休息1 d，治療共4個療程。模型+電針+HgCl2組：于造模成功后第1天皮下注射AQPs抑制劑0.1 mMHgCl20.05 mL，治療同電針組。③電針治療：將兔固定在支架上，參考《實驗針灸學》[4]中“實驗動物穴位標準定位”，選取兔L4、L5兩側夾脊穴，用28號長1寸的毫針快速捻轉進針，直刺0.5 cm～0.8 cm，待針下有沉澀感后，在脊柱兩側分別接一組電極(HANS電針儀)，刺激參數(shù)調整為：調頻波(2/15 Hz)，1 mA～2 mA，20 min。

3 療效分析

3.1 評定標準

在造模后第1天和第28天兩個時間點，各組分別取5只行L4～L5椎間盤MRI矢狀位(T 2加權)平掃，以觀察椎間盤信號變化，進而來判斷造模是否成功。然后處死實驗兔，取椎間盤組織，供免疫熒光技術檢測兔腰椎間盤組織中AQP 1、3的表達情況。免疫熒光技術操作方法：切片脫蠟-抗原修復—孵育—加熒光一抗—加熒光二抗—封片—采集圖片。觀察每張切片在顯微鏡高倍鏡下放大400倍后不同時間點的視野成像，對陽性細胞數(shù)目進行記錄，并計算AQP 1、3陽性細胞相對光密度值。

3.2 統(tǒng)計學方法

3.3 治療結果

3.3.1 MRI檢查結果

圖1 五組椎間盤模型兔造模后第28天椎間盤MRI比較

正常組與假模型組實驗兔的各椎間盤表現(xiàn)為均勻明亮的正常高信號，而其余三組實驗兔造模后椎間盤信號較相鄰正常椎間盤信號均有不同程度的降低，有的甚至呈“黑間盤”表現(xiàn)。由此可見，造模成功；且模型組與造模+電針組相比，電針治療后的椎間盤信號較模型組增強，可見電針治療能促進兔退變椎間盤修復。見圖1。

3.3.2 免疫熒光技術檢測結果

造模成功后第1天，模型組、模型+電針組及模型+電針+HgCl2組三組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，且較正常組，三組AQP 1、3表達水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(與正常組第1天相比，P<0.05)；模型組第28天的AQP 1、3表達水平較第1天升高，差異無統(tǒng)計學意義(與模型組第1天相比，P>0.05)；模型+電針組第28天的AQP 1、3表達水平較第1天升高，差異有統(tǒng)計學意義(與模型+電針組第1天相比，P<0.05)；模型+電針+HgCl2組第28天的AQP 1、3表達水平較第1天之間的差異無統(tǒng)計學意義(與模型+電針+HgCl2組第1天相比，P>0.05)。見圖2，圖3。

圖2 各組第28天AQP 1免疫熒光圖結果

圖3 各組第28天AQP 3免疫熒光圖結果

4 討 論

椎間盤退變是指椎間盤自然老化、退化的生理病理過程，嚴重的腰椎退行性病變可以引起腰腿痛甚至神經損害，影響工作能力和生活質量。統(tǒng)計表明[5]，約2/3世界人口在其一生當中經歷不同程度的腰痛。目前，針對椎間盤退變引起腰痛臨床治療方法主要包括藥物、物理康復及手術治療[6]。藥物治療僅僅只能緩解疼痛癥狀，治標不治本，治愈率低，復發(fā)率高。手術治療創(chuàng)傷大，費用高，而且一方面內固定限制了脊柱的活動度，另一方面又可能會加速鄰近節(jié)段椎間盤的退變。物理康復治療是目前臨床上最主要的方法[7]，其中，針刺作為中醫(yī)傳統(tǒng)特色療法得到了臨床上的廣泛運用，其不僅操作簡單易行、醫(yī)療費用經濟、副作用少，且大量的基礎及臨床研究也證實了針刺對于防治本病療效顯著。

椎間盤細胞與機體其他組織一樣，為了維持細胞功能正常代謝需要充足的營養(yǎng)物質供應，而成熟的椎間盤需要從軟骨終板滲透中獲得營養(yǎng)供應[8]。研究發(fā)現(xiàn)[9]，椎間盤營養(yǎng)物質的滲透率與纖維環(huán)及軟骨終板的水化程度呈正相關。AQP 1、3在軟骨終板、纖維環(huán)及髓核細胞都有表達，且在軟骨終板的中心表達最強，此外其特殊的空間分布特點對椎間盤的水的進出有顯著的影響。因此，AQP 1、3的表達下降會改變軟骨終板和纖維環(huán)對水的通透性，導致椎間盤含水量減少，進而必然會影響營養(yǎng)物質的吸收。由此可見，如何調控終板軟骨細胞AQPs的表達，增加以水為主的營養(yǎng)供應，是治療椎間盤退變性疾病的重點。

Kroeber M等[3]通過對椎間盤的高度、組織形態(tài)學、細胞存活、生物力學等多方面的研究，認為軸位動力牽引可使退變的兔椎間盤組織再生。由此可見，退變的椎間盤在組織學上的變化是可逆的[10]。根據《內經》“治未病”的原則，延緩、阻止甚至逆轉椎間盤退變，應當是防治椎間盤退變性疾病的首要措施。在治未病方面，祖國傳統(tǒng)醫(yī)學有著獨特的優(yōu)勢，其中針灸療法在臨床上一直備受醫(yī)生及患者的廣泛青睞。因此，采用針灸療法延緩、阻止甚至逆轉腰椎間盤退變繼發(fā)各種病癥顯得格外有潛力。

本實驗參照國外研究者Kroeber等[3]的造模方法，在相鄰的椎體間進行短期動態(tài)加壓，通過刺激椎間盤基質降解與合成的失衡從而誘發(fā)椎間盤退變。實驗結果提示，退變的椎間盤軟骨終板細胞中AQP 1、3的表達明顯下降；電針可上調退變椎間盤終板軟骨細胞中AQP 1、3的表達水平；電針夾脊穴可延緩椎間盤退變，并促進退變椎間盤組織的修復。這一實驗結果揭示了電針夾脊穴可上調終板軟骨細胞AQP 1、3的表達水平，增加軟骨終板途徑以水為主的營養(yǎng)供應，進而達到控制椎間盤退變的始動因素，延緩椎間盤退變，并促進退變椎間盤組織的修復，為臨床應用電針防治腰椎間盤退行性疾病提供一定的科學的實驗依據。但是，電針具體是通過何種途徑調控AQP 1、3的表達，以達到治療椎間盤退變性疾病的目的，有待我們進一步探討研究，為臨床針灸提供更為堅實的科學理論依據。

參考文獻：

[1] Peng B，Hou S，Shi Q，et al. The relationship between cartilage end -plate calcification and disc degeneration: an experimental study[J]．Chin Med J (Engl)，2001，114(3):308-312.

[2] Conner M T,Conner A C,Brown J E,et al.Membrane trafficking of aquaporin 1 is mediated by protein kinase C via microtubules and regulated by tonicity[J].Biochemistry,2010,49(5):821-823.

[3] Kroeber M, Unglaub F, Guegring T, et al. Effects of controlled dynamic disc distraction on degenerated intervertebral discs: an in vivo study on the rabbit lumbar spine model[J]. Spine, 2005,30(2):181-187.

[4] 郭 義.實驗針灸學[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社,2008:402-417.

[5] Deyo R A, Weinstein J N. Low back pain [J]. N Engl J Med,2001, 344(5):363-370.

[6] MIRZA S K，DEYO R A.Systematic review of randomized trials comparing lumbar fusion surgery to nonoperative care for treatment of chronic back pain[J].Spine (Phila Pa 1976)，2007，32(7):816-823.

[7] 張延松，胡偵明，郝 杰.椎間盤退變基因治療進展[J].中國矯形外科雜志，2014,22(7)：617-619.

[8] Colombier P, Clouet J, Hamel O, et al. The lumbar intervertebral disc: from embryonic development to degeneration[J]. Joint Bone Spine, 2014,81(2):125-129.

[9] 曹國永，周 躍，滕海軍，等.水通道蛋白在正常大鼠椎間盤組織中的表達與分布[J].中國矯形外科雜志，2005，13：996-999.

[10] Guehring T,Omlor G W,Lorenz H,et al.Disc distraction shows evidence of regenerative potential in degenerated intervertebral discs as evaluated by protein expression, magnetic resonance imaging, and messenger ribonucleic acid expression analysis[J].Spine,2006,31(15):1658-1665.