基于TLR4/NF-κB通路探討滋陰潛陽方對兩腎一夾高血壓大鼠腎損傷保護作用的機制*

★ 濮燕屏 程斌

(安徽中醫(yī)藥大學研究生院 合肥 230011)

高血壓的臨床表現(xiàn)為體循環(huán)動脈壓升高，頭暈、頭痛等，并且可引起腎臟、心臟等多種靶器官損害[1]。在高血壓病發(fā)展的過程中，伴隨著機體內(nèi)的炎癥反應[2]，而TLR4/NF-κB信號通路是這些炎癥反應的共同通路[3]，其中以腎臟炎癥最為主要[4]。TLR4是Toll樣蛋白的一種參與炎癥反應的同源物，可激活TLR4/NF-κB信號通路，引起其下游效應因子NF-κB的表達[5]。有研究指出，當機體內(nèi)產(chǎn)生免疫炎癥反應時，TLR4和NF-κB被激活表達，誘導腎組織細胞成纖維化，促進炎癥因子的釋放，如白介素6(IL-6)、白介素8(IL-8)、腫瘤壞死因子(TNF-α)等，加重腎損傷[6]。本研究通過探尋在兩腎一夾(2K1C)高血壓大鼠中滋陰潛陽方對TLR4/NF-κB信號通路的影響，分析滋陰潛陽方對高血壓腎損傷保護作用的可能機制，證明其對高血壓腎損傷的影響，為臨床應用提供可靠的數(shù)據(jù)參考。

1 材料

1.1 動物 40只雄性清潔級同源同系SD大鼠，安徽中醫(yī)藥大學實驗動物中心，(160±20)g，8周齡，合格編號SCXK(皖)2011-002，正常飼養(yǎng)，自由飲水。

1.2 藥物 滋陰潛陽方煎劑：生地黃、熟地黃各15g，鉤藤、何首烏各20g，牡蠣、石決明各30g。購自安徽省中醫(yī)院，湯液濃縮至2g/mL。

鹽酸貝那普利(成都地奧制藥集團有限公司，國藥準字H20053390，10mg/片)，購自安徽省中醫(yī)院，藥片研末，以0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配成1mg/mL，灌胃時將藥液稀釋為0.1mg/mL。

1.3 試劑與設備 Trizol(Invitrogen公司，批號：90802)；DEPC、SDS(Sigma公司，批號：20140802554、CAS：151-21-3)；Quanti Fast SyBr Green PCR kit(Qiagen，批號：151025434)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Revert Aid TM first Strand cDNA Synthesis Kit)；PVDF膜、預染蛋白Marker(Thermo公司，批號：00221108、K5CA1685L)；Tris堿(Solarbio公司，批號：1128Q0722)；TLR4 (Bioss公司，貨號：bs-1021R，分子量90kDa)；NF-κBp65(abcam公司，貨號：ab16502，分子量64kDa)等。

無創(chuàng)血壓測量儀(上海奧爾科特生物科技有限公司)；電泳儀(Tanon，EPS 300型)；JW3021HR離心機(安徽嘉文儀器制造有限公司)；光學顯微鏡(日本Nikon 80i)；PCR儀(Thermo，PIKOREAL 96)；0.25mm U型銀夾，常規(guī)手術器械等。

2 方法

2.1 造模方法 大鼠進行斷食不斷水飼養(yǎng)12h，手術按照0.35mL/100g腹腔注射10%水合氯醛麻醉，背部向上，固定大鼠，于浮肋處(大約為背部第3腰椎棘突水平)，從后背正中右側(cè)1cm處開放約1.5cm的手術切口[7]。開口后找到右腎組織，剝離右腎動脈，利用0.25mmU型銀夾狹窄大鼠右腎動脈，左側(cè)不觸及。假手術組的手術過程同模型組，但不給予銀夾狹窄右腎動脈。創(chuàng)口消毒處理并去除血跡，術后注射慶大霉素2萬U/支，連續(xù)注射3～5天，常規(guī)飼養(yǎng)。2周后，評估造模情況，測量大鼠血壓較術前升高22.6mmHg(3kPa)，且高于135mmHg(18kPa)者為造模成功[8]。

2.2 分組方法 隨機(隨機數(shù)字表法)抽取8只大鼠為假手術組，剩余32只建造2K1C高血壓大鼠模型，造模后死亡4只，模型復制成功24只，將成功復制模型的大鼠進行編號，隨機(隨機數(shù)字表法)分為模型組、貝那普利組和滋陰潛陽組。

2.3 給藥方法 各組在造模2周后開始灌胃，兩治療組分別給予2g/mL滋陰潛陽方水煎劑(1mL/100g)、0.1mg/mL貝那普利混懸液(1mL/100g)灌胃，非治療組給予等體積生理鹽水灌胃，灌胃時間為每天上午9點，連續(xù)8周。

2.4 取材方法 大鼠灌胃8周后，禁食不禁水12h，測體重，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，打開大鼠腹腔，取左側(cè)腎臟，用生理鹽水沖洗，并用濾紙拭干，去除包膜，對半縱向分開腎臟，一半放入4%多聚甲醛溶液中固定待測。左腎另一半放入冷凝管中，置于液氮中，放于-80℃冰箱待測。

2.5 指標檢測

2.5.1 血壓測定 將鼠尾套入血壓儀尾套測尾動脈血壓(術后2周、用藥4 周及8 周)。安靜狀態(tài)下操作，反復3次，取均值。

2.5.2 實時PCR技術測定TLR4-mRNA含量 使用全自動紫外分光光度計對TLR4-mRNA的濃度、純度進行定量分析。按要求加樣后進行RT-PCR反應，擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果經(jīng)掃描后進行圖像分析，以TLR4與β-actin的比值反映TLR4的mRNA表達水平。

2.5.3 WesternBlot法測定TLR4、NF-κBp65核蛋白表達 將制備好的蛋白樣品以及Marker加入SDS-PAGE凝膠孔內(nèi)，進行電泳，至目標蛋白對應大小的Marker條帶在分離膠被分離為止。將所需凝膠經(jīng)過轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育、曝光后，運用ImageJ軟件分析結(jié)果，以Actin、GAPDH為內(nèi)參進行目的蛋白表達水平差異的比較。

2.5.4 炎癥因子測定 灌胃8周(造模10周)后，斷食不斷水12h，麻醉后手術取左側(cè)腎臟，生理鹽水沖洗，并用濾紙拭干，選部分腎臟，取組織勻漿上清，ELISA法檢測TNF-α、IL-6、IL-8的含量。

2.5.5 腎臟組織病理形態(tài)學分析 取部分去除包膜的大鼠左側(cè)腎臟，放入固定液中固定，石蠟切片(3μm)，鏡下觀察HE染色的腎組織變化。

3 結(jié)果

3.1 大鼠尾動脈壓的變化情況 見表1。手術2周后，模型組、貝那普利組、滋陰潛陽組血壓較假手術組相比均有所升高(P<0.05)，提示高血壓造模成功。灌胃4、8周后，滋陰潛陽組、貝那普利組血壓較模型組相比均有所下降(P<0.05)。

表1 各組大鼠血壓的比較 mmHg

注：造模2周，與假手術組相比，*P<0.05；灌胃4周、8周，與模型組相比，#&P<0.05。

3.2 大鼠腎臟組織TLR4-mRNA的含量表達 結(jié)果見表2。與假手術組相比，模型組大鼠TLR4-mRNA表達明顯增強(P<0.01)；與模型組大鼠相比，滋陰潛陽組、貝那普利組大鼠TLR4-mRNA表達明顯減少(P<0.01)。

表2 各組大鼠腎臟組織TLR4-mRNA的含量表達

注：與假手術組比，**P<0.01；與模型組比，##P<0.01。

3.3 大鼠腎臟組織TLR4、NF-κBp65的含量表達 結(jié)果見表3。與假手術組相比，模型組TLR4、NF-κBp65兩個指標蛋白表達均明顯升高(P<0.01)；灌胃8周后，與模型組相比，滋陰潛陽組、貝那普利組蛋白具有顯著性差異(P<0.01)。

表3 各組大鼠腎臟組織TLR4、NF-κBp65的含量表達

注：與假手術組比，**p<0.01,與模型組比，##P<0.01.

3.4 滋陰潛陽方在腎臟組織上清IL-6、IL-8、 TNF-α的表達影響 見表4。模型組上清中IL-6、IL-8、TNF-α水平均較假手術組相比顯著升高(P<0.05)；貝那普利組、滋陰潛陽組IL-6、IL-8、TNF-α水平較模型組新相比顯著降低(P<0.05)。

表4 各組大鼠腎臟組織上清中炎癥因子的比較 ng/L

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與貝那普利組比較，△P>0.05。

3.5 腎臟組織病理形態(tài)學 結(jié)果見圖1。HE染色示：假手術組的大鼠腎組織中血管內(nèi)皮細胞、基底膜、系膜細胞等鏡下結(jié)構(gòu)未見明顯改變；模型組較假手術組腎組織系膜區(qū)擴張，基底膜增厚、系膜細胞肥大；兩治療組較模型組相比，腎組織基底膜變薄，血管內(nèi)皮細胞、肥大的系膜細胞減小。

4 討論

中醫(yī)學中沒有高血壓腎損傷的專屬病名，其相關論述可見于“腎勞”“腰痛”等疾病范圍。課題組在其病因病機為肝腎陰虛的理論基礎之上，總結(jié)滋陰潛陽方，方中的生地黃、熟地黃、何首烏滋肝腎、養(yǎng)陰精，鉤藤、石決明、牡蠣熄風潛陽以降壓。全方標本兼治、和調(diào)陰陽，從而達到平穩(wěn)降壓的目的[9]。廖圣寶等[10]研究指出在中醫(yī)證候?qū)傩灾?K1C大鼠模型屬于陰虛陽亢型。本研究應用此模型，觀察滋陰潛陽方對該模型大鼠的干預是符合中醫(yī)辨證論治的思維。

A.假手術組；B.模型組；C.貝那普利組；D.滋陰潛陽組

NF-κB是廣泛存在于真核細胞中的一個重要的轉(zhuǎn)錄因子，新近研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB亦存在于腎臟組織細胞中，參與高血壓腎損害的過程[11]。NF-κB能與核內(nèi)DNA特定的序列即κB結(jié)合位點結(jié)合，增強各種炎癥因子的表達，由此引發(fā)大量的炎性細胞積聚浸潤于炎癥部位，導致持續(xù)或放大的炎癥反應[12]。高血壓在發(fā)生過程中會出現(xiàn)多臟器的低度炎癥，損傷靶器官的炎癥組織會釋放多種炎癥因子，炎癥因子作用于NF-κB，形成相互影響的炎癥循環(huán)過程，加重高血壓病的病情[13-14]。

本次實驗研究表明，①造模后2周，大鼠尾動脈收縮壓開始穩(wěn)定上升，且與假手術組相比，其余三組大鼠血壓均明顯升高，以此提示2K1C模型復制成功。灌胃4、8 周后，與模型組相比，兩治療組大鼠的血壓均明顯下降，證明中藥復方(滋陰潛陽方)具有一定的降壓效果。②滋陰潛陽方能夠一定程度上抑制2K1C高血壓大鼠腎臟細胞中TLR4-mRNA的表達。與假手術組相比，模型組TLR4-mRNA表達增強(P<0.01)；經(jīng)過治療后，與模型組相比，滋陰潛陽組與貝那普利組TLR4-mRNA表達降低(P<0.01)。滋陰潛陽方可以通過降低TLR4-mRNA抑制炎癥反應。③滋陰潛陽方能夠一定程度上抑制2K1C高血壓大鼠腎臟組織中TLR4、NF-κB的表達。與假手術組相比，模型組大鼠TLR4、NF-κB蛋白表達明顯增強(P<0.01)；經(jīng)過治療后，與模型組相比，滋陰潛陽組與貝那普利組TLR4、NF-κB的表達明顯降低，具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。滋陰潛陽方可以通過抑制降低TLR4、NF-κB的蛋白表達抑制炎癥反應。④模型組IL-6、IL-8、TNF-α的表達水平均高于假手術組；兩治療組IL-6、IL-8、TNF-α的表達水平與模型組相比均有所下降。這說明在大鼠血壓升高的同時，腎損傷也在發(fā)生；用藥后，兩治療組的炎癥水平都得到一定程度的控制，證實了滋陰潛陽方對降低炎癥因子含量具有一定的干預作用。⑤腎組織切片提示假手術組的鏡下觀未見特殊改變；與假手術組相比，其余三組的鏡下結(jié)構(gòu)均出現(xiàn)了一定的病理變化；但兩治療組的病理改變較模型組相比減輕了很多。這說明，滋陰潛陽方可能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路的激活來降低炎癥因子的釋放，從而改善高血壓對腎臟的損傷，證實其對腎損傷具有一定的干預保護作用。

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