miR-145下調c-Myc基因抑制人乳腺癌MCF-7細胞增殖

蔡延森，曾永秋，馬明義，稅清林，趙 矯

（西南醫(yī)科大學醫(yī)學細胞生物學與遺傳學教研室，四川瀘州 646000）

微小RNA（micro RNA，miR）是一類廣泛存在于真核細胞中的長度為21～25 nt的內源性非編碼單鏈RNA分子[1]，人類基因組中估計約有1000種miRNA，進化上均相當保守[2]。它們可以與特定靶基因mRNA 3'-UTR區(qū)完全或部分互補結合，降解靶基因的mRNA或抑制其翻譯，從而阻斷靶基因的表達[2]。

miR-145位于人類第5號染色體（5q32），其前體具有莖環(huán)結構，經剪切加工可形成miR-145-3p和miR-145-5p兩種片段。miR-145屬于抑癌基因，可直接作用于c-Myc、IRS-1等癌基因，從而抑制腫瘤細胞生長并促進細胞凋亡。文獻報道在多種腫瘤，如肺癌、食管癌、胃癌、前列腺癌、膀胱癌、結直腸癌、卵巢癌等中，miR-145表達明顯降低[3-9]。最近有研究顯示，非小細胞肺癌、直結腸癌中過表達miR-145均可抑制腫瘤細胞的增殖[5，10-13]，提示miR-145可作為抗腫瘤的一種手段。

目前，乳腺癌的發(fā)病率在惡性腫瘤中居全球第二，在發(fā)展中國家的女性腫瘤患者中居第一[1]。針對乳腺癌細胞miR-145的表達水平以及其與下游目的基因之間的關系的研究較少。本研究采用化學合成miR-145-3p和miR-145-5p，體外轉染人乳腺癌細胞MCF-7，通過檢測MCF-7細胞系中c-Myc mRNA表達變化以及細胞的增殖情況，初步探討人乳腺癌細胞MCF-7中miR-145與c-Myc表達的關系及miR-145在乳腺癌發(fā)生過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人乳腺癌MCF-7細胞購自西南醫(yī)科大學臨床醫(yī)學實驗中心。miR-145-3p、miR-145-5p由銳博生物制備。設計正反向引物及內參正反向引物，由Invitrogen合成。細胞轉染脂質體LipofectamineTM2000，RNA提取試劑盒TRIzol購自Invitrogen。凋亡試劑盒Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit購自凱基，CCK-8購自日本同仁化學研究所。

1.2 細胞傳染

常規(guī)培養(yǎng)（RPMI）1640培養(yǎng)基，10%小牛血清）乳腺癌MCF-7細胞，按4×105個細胞/孔進行接種于6孔板，培養(yǎng)至細胞融合度約為60%。實驗分為四個組：miR-145-3p組（3p組）、miR-145-5p組（5p組）、陰性對照組（空脂質體）、空白對照組（不轉染）。轉染實驗組細胞的LipofectamineTM 2000脂質體以無血清、無雙抗Opti-MEM按每孔5μL脂質體分別轉染10μL miR-145-3p或miR-145-5p。

1.3 CCK-8法檢測細胞的增殖抑制情況

將MCF-7細胞按每孔5×103個細胞的濃度接種于96孔板，每組分別設6個復孔，培養(yǎng)24 h后根據分組情況轉染對應的脂質體。轉染24、48、72 h后檢測各組細胞增殖情況。加入CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后用酶標儀測定450 nm波長OD值。以OD值為縱坐標，時間為橫坐標，繪制細胞生長曲線圖，計算細胞增殖抑制率。計算公式：細胞增殖抑制率＝（1-實驗各組OD值/空白組OD值）×100%。

1.4 RT-PCR檢測轉染后各組細胞c-Myc mRNA表達水平

于轉染后72 h使用TRizol提取各組細胞中總RNA。根據Choi等[14]合成引物進行RT-PCR擴增，目的基因為c-Myc長度102 bp的片段，正反向引物為：F:5’-GGCCCCAAGGTAGTTATCCTT-3’，R:5’-CGTTTCCGCAACAAGTCCTCT-3’。內 參 GAPDH基因擴增片段長度為250 bp，正反向引物為：F:5’-A AGGGCATCCTGGGCTACAC-3’，R:5’-AGGGTCTC TCTCTTCCTCTTGTG-3’。RT-PCR按兩步法試劑盒進行，反應程序為：94℃ 3 min；94 ℃ 30 s，60 ℃30 s，72 ℃ 25 s，循環(huán)28次；72 ℃ 5 min 。擴增產物經3%瓊脂糖凝膠電泳，用紫外凝膠成像分析儀照相并用Image Lab 4.0軟件掃描分析。重復3次。

1.5 統計學處理

使用SPSS17.0統計軟件處理各組數據，以x±s表示計量資料，進行多樣本均數兩兩比較的q檢驗方差分析。

2 結果

2.1 各組細胞增殖情況

與空白組和陰性對照組比較，5p組MCF-7細胞在24～72 h范圍內增殖抑制率平均為56%（24 h抑制率42%，48 h抑制率60%，72 h抑制率61%），差異顯著（P＜0.05）；3p組MCF-7細胞增殖抑制率平均為10%（24 h抑制率14%，48 h抑制率10%，72 h抑制率11%），差異則無顯著性(P＞0.05)。

圖1 乳腺癌MCF-7細胞的生長曲線

2.2 各組細胞c-Myc mRNA表達水平

5p組、3p組、陰性對照組、空白組MCF-7細胞轉染72 h后，c-Myc mRNA的表達量分別為11.12±0.09，31.05 ± 0.05，63.64 ± 0.11，59.49 ± 0.08（圖2）。RT-PCR結果顯示與陰性對照組和空白組相比，5p組和3p組細胞中c-Myc mRNA的表達量均出現下調，分別下降了約82%和50%（P＜0.05）。

圖2 RT-PCR檢測miR-145轉染72 h后細胞中c-Myc mRNA表達

3 討 論

miR-145屬于抑癌基因，其表達量在正常乳腺細胞中高于乳腺癌細胞；而c-Myc是癌基因，其表達量在正常乳腺細胞中低于乳腺癌細胞。目前，腫瘤的基因治療可以從兩個方面開展工作：一是將癌基因特異性敲除、沉默或下調其表達，從而抑制腫瘤生長；二是將抑癌基因的重新導入細胞，上調其表達來對抗腫瘤、促使其凋亡[15-17]。無論是基因的敲出/沉默還是重新導入，均需要構建高效可靠的表達體系。本研究通過化學方法合成的miR-145表達體系制備快捷且能在細胞中穩(wěn)定過表達，可彌補腺病毒/慢病毒載體法等傳統導入方法瞬時轉染持續(xù)時間短的不足，可高效穩(wěn)定的導入MiR并沉默靶基因。

miR-145 mRNA的兩種片段3p和5p，在細胞中的功能不盡相同。已有研究表明，在非小細胞肺癌、直結腸癌細胞中，miR-145-5p受P53直接激活，然后作用于c-Myc抑制其表達，進而使細胞停止生長并促使細胞凋亡，但miR-145-3p則幾乎沒用作用[7、18]。在乳腺癌中，miR-145的兩種片段是否調控c-Myc基因，它們在功能上是否存在差異，目前尚不清楚。

本研究構建的3p和5p表達體系在體外轉染乳腺癌MCF-7細胞后，結果顯示，與陰性組和空白組相比，3p組細胞中雖然c-Myc mRNA的表達量下降約50%，但細胞的增殖只受到微弱抑制（平均約為10%）；而5p組細胞中不僅c-Myc mRNA的表達量下降更顯著（約82%），且細胞生長受到了明顯抑制（約56%）。本研究發(fā)現乳腺癌MCF-7細胞中miR-145的兩種片段均可作用于c-Myc基因，但5p片段對細胞增殖的抑制效果顯著，而3p片段則較不顯著。

miR-145兩種片段之所以會有這樣的差異，可能是由于它們不僅共同作用于c-Myc基因，還同時分別作用于多個不同的靶基因來調控細胞導致的。這些靶基因對乳腺癌細胞的生長調控，以及miR-145與它們的關系和影響將是我們下一步的研究方向。本研究針對性的結合了miRNA和腫瘤基因治療兩大熱點領域，構建了一種安全可靠的miR-145表達體系并運用于乳腺癌細胞使其下調原癌基因的高表達，為腫瘤基因治療提供一種新的研究策略。

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