鹽脅迫下花生幼苗期相關(guān)性狀的QTL分析

苗華榮，楊偉強(qiáng)，胡曉輝，張勝忠，崔鳳高，陳 靜

(山東省花生研究所，山東 青島 266100)

栽培種花生(A.hypogaeaL.)為異源四倍體，是世界上重要的油料作物，廣泛分布于世界半干旱區(qū)域。2010-2014年，全球種植面積為25.27百萬(wàn)hm2，產(chǎn)量達(dá)到42.27百萬(wàn)t[1]。分子遺傳圖譜廣泛應(yīng)用于基因定位、圖位克隆以及分子標(biāo)記輔助育種。目前，遺傳圖譜通常包含RFLP、AFLP、SSR、SNP標(biāo)記。自2001年以來(lái)，共27個(gè)四倍體花生遺傳連鎖圖譜公布，其中23個(gè)遺傳圖譜是基于栽培種花生構(gòu)建的，4個(gè)是栽培種花生與合成四倍體花生構(gòu)建的[2-17]?；谶z傳圖譜，花生重要性狀的QTL定位取得了一定進(jìn)展，張新友[18]運(yùn)用栽培種RIL群體和F2群體定位了與產(chǎn)量、品質(zhì)等性狀相關(guān)的62個(gè)QTL；Shirasawa等[12]基于栽培種花生遺傳圖譜，獲得了與開(kāi)花日期、分枝角度、主莖高、莢果長(zhǎng)、莢果厚、莢果寬的QTL；Wang等[19]利用栽培種花生Tifrunner×GT-C20構(gòu)建的群體定位到與番茄斑萎病毒(TSWV)、葉斑病相關(guān)的QTL；Huang等[8]利用RIL群體對(duì)3個(gè)環(huán)境下花生株高進(jìn)行了QTL分析；Pandey等和Wang等[9，20]分別利用SunOleic97R×NC94022和Tifrunner×GT-C20構(gòu)建的RIL群體對(duì)花生脂肪酸和油脂含量進(jìn)行了QTL分析；成良強(qiáng)等[21]利用富川大花生×ICG6375構(gòu)建的F2群體和F3家系對(duì)花生主莖高和總分枝數(shù)進(jìn)行了QTL分析。

目前，花生耐鹽性研究主要集中在不同耐鹽鑒定方法的探索[22-23]、花生耐鹽性種質(zhì)資源鑒定和評(píng)價(jià)[24]、鹽脅迫下花生生理特性變化以及鹽脅迫對(duì)花生品質(zhì)影響等方面[25-26]，但是對(duì)花生耐鹽分子遺傳機(jī)理的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究利用花育28號(hào)和P76構(gòu)建的RIL群體，對(duì)2013，2014年2個(gè)年份鹽脅迫下的表型進(jìn)行調(diào)查，基于構(gòu)建的高密度遺傳連鎖圖譜，開(kāi)展花生鹽脅迫下相關(guān)性狀的QTL分析，對(duì)花生耐鹽基因的挖掘具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以花育28號(hào)和P76為親本構(gòu)建的RIL群體為試材?；ㄓ?8號(hào)由山東省花生研究所育成，通過(guò)了山東省農(nóng)作物品種審定委員會(huì)審定；P76為來(lái)源于山東省花生研究所的高油酸品系，RIL群體包含146個(gè)株系。2013年(F2∶9)和2014年(F2∶10)材料種植于山東省花生研究所試驗(yàn)站，2013，2014年收獲后晾干備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 幼苗期耐鹽性鑒定 選取親本和RIL群體各株系飽滿種子40粒于雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，置于黑暗條件下人工培養(yǎng)箱(28～30 ℃)中進(jìn)行培養(yǎng)，3 d后選擇芽長(zhǎng)約2 cm生長(zhǎng)狀況良好且相對(duì)一致的花生種子移栽至2組裝滿純水的花生種子發(fā)芽盒A、B中，放置在人工氣候室內(nèi)，在29 ℃條件下培養(yǎng)至幼苗長(zhǎng)成“兩葉一心”后對(duì)A、B這2組進(jìn)行處理，種子發(fā)芽盒中溶液的鹽濃度分別為0，0.75%，之后每2 d換一次鹽溶液和純水，處理7～9 d后從A、B 2組中各挑選不同株系的長(zhǎng)勢(shì)大致相同的花生幼苗3株為樣本進(jìn)行測(cè)量，測(cè)定各株高、主根長(zhǎng)、莖葉干質(zhì)量、根干質(zhì)量、莖葉鮮質(zhì)量、根鮮質(zhì)量；重復(fù)3次。

花生耐鹽性指標(biāo)：耐鹽指數(shù)=鹽處理值/對(duì)照值。將各指標(biāo)轉(zhuǎn)化為相對(duì)值；利用Excel對(duì)各耐鹽堿指標(biāo)進(jìn)行分析。

1.2.2 圖譜構(gòu)建和QTL分析 利用RIL群體構(gòu)建了包含2 334個(gè)標(biāo)記的高密度遺傳圖譜，該圖譜包含68個(gè)SSR標(biāo)記和2 266個(gè)SLAF標(biāo)記，覆蓋全基因組圖距為2 586.37 cM，分布于20個(gè)連鎖群，標(biāo)記間的平均距離為2.25 cM。應(yīng)用完備區(qū)間作圖軟件IciMapping v3.0(http：//www. isbreeding.net/)[27]對(duì)表型值進(jìn)行QTL分析。LOD閾值經(jīng)1 000次模擬計(jì)算后得到，其中將 LOD 值低于 2.5 的 QTL 忽略，以增加 QTL 檢測(cè)的準(zhǔn)確性與可靠性。

QTL 命名方法按照 QTL+性狀+群體名稱+染色體+QTL 數(shù)。其中，QTL 以 q 表示，性狀和群體以英文縮寫(xiě)表示，染色體以花生染色體表示，染色體上 QTL 數(shù)目以數(shù)字表示，性狀與群體名稱間加“-”，群體名稱和染色體間加“-”，染色體和 QTL 數(shù)間加“.”。如qSmsh-HP-A10.1表示A10 染色體上鹽脅迫株高(SMSH)的 QTL，HP為花育28號(hào)×P76構(gòu)建的 RIL 群體的縮寫(xiě)，1 表示該染色體上的第一個(gè)鹽脅迫株高的 QTL。

2 結(jié)果與分析

2.1 幼苗期耐鹽性相關(guān)性狀的表型變異

在0.75%鹽濃度條件培育下，花育28號(hào)和P76各測(cè)定指標(biāo)的絕對(duì)值和相對(duì)值表現(xiàn)有一定差異(表1)。鹽脅迫下花育28號(hào)株高、主根長(zhǎng)(2013年除外)、莖葉干質(zhì)量、根干質(zhì)量、莖葉鮮質(zhì)量、根鮮質(zhì)量的相對(duì)值均高于P76。各指標(biāo)的偏度和峰度絕對(duì)值表現(xiàn)有差異，鹽脅迫下根干質(zhì)量(2014年)絕對(duì)值的峰度為3.72，其他指標(biāo)的峰度絕對(duì)值均小于1或接近1；鹽脅迫下根系相關(guān)指標(biāo)相對(duì)值的峰度偏高，而地上指標(biāo)相對(duì)值的峰度較低；這些性狀表現(xiàn)為連續(xù)變異，每個(gè)性狀都表現(xiàn)超親分離，且多數(shù)性狀頻數(shù)分布基本符合正態(tài)分布；表明為多基因控制的數(shù)量性狀，適合進(jìn)行 QTL 定位分析。

2.2 幼苗期耐鹽性相關(guān)性狀 QTL 分析

表1 RIL 群體及其親本的鹽脅迫相關(guān)性狀在不同環(huán)境下的表現(xiàn)Tab.1 Evaluation of traits related to salt stress of the RIL populations and their parents in different environments

利用IciMapping對(duì)鹽脅迫下各表型絕對(duì)值進(jìn)行分析，獲得13個(gè)相關(guān)的QTL，分布于10個(gè)連鎖群上。其中，株高相關(guān)的QTL 3個(gè)：qSmsh-HP-A10.1、qSmsh-HP-B02.1和qSmsh-HP-B05.1分別位于A10、B02和B05染色體，解釋的表型變異分別是4.13%，4.79%和6.69%，加性效應(yīng)分別為0.36，0.40和-0.44，其中qSmsh-HP-A10.1、qSmsh-HP-B02.1的增效等位基因來(lái)源于花育28號(hào)，qSmsh-HP-B05.1的增效等位基因來(lái)源于P76。主根長(zhǎng)相關(guān)的QTL 2個(gè)：qSrl-HP-A03.1和qSrl-HP-A06.1分別位于A03、A06染色體，解釋的表型變異分別是5.63%，4.17%，加性效應(yīng)分別為0.32，0.21，二者的增效等位基因來(lái)源于花育28號(hào)。莖葉干質(zhì)量相關(guān)的QTL 2個(gè)：qSwdp-HP-A08.1和qSwdp-HP-A07.1分別位于A08、A07染色體，解釋的表型變異分別是4.99%，3.08%，二者的增效等位基因來(lái)源于花育28號(hào)。莖葉鮮質(zhì)量相關(guān)的QTL 4個(gè)：qSwfp-HP-A04.1、qSwfp-HP-B02.1、qSwfp-HP-B03.1、qSwfp-HP-B07.1分別位于A04、B02、B03和B07染色體，解釋的表型變異分別是6.13%，5.73%，6.88%和5.30%，qSwfp-HP-A04.1的增效等位基因來(lái)源于P76，qSwfp-HP-B02.1、qSwfp-HP-B03.1、qSwfp-HP-B07.1的增效等位基因來(lái)源于花育28號(hào)。根鮮質(zhì)量相關(guān)的QTL個(gè)：qSwfr-HP-B03.1、qSwfr-HP-B03.2均位于B03染色體，解釋的表型變異分別是2.81%，3.12%，二者的增效等位基因來(lái)源于花育28號(hào)。

對(duì)鹽脅迫下各指標(biāo)相對(duì)值進(jìn)行分析表明，檢測(cè)到株高相對(duì)值相關(guān)的QTL 3個(gè)：qRmsh-HP-A06.1、qRmsh-HP-B02.1和qRmsh-HP-B04.1分別位于A06、B02和B04染色體，解釋的表型變異分別是3.01%，2.80%和3.47%，其增效等位基因均來(lái)源于花育28號(hào)。檢測(cè)到主根長(zhǎng)相對(duì)值相關(guān)的QTL 2個(gè)：qRrl-HP-A08.1、qRrl-HP-B06.1分別位于A08、B06染色體，解釋的表型變異分別是16.72%，22.42%，其增效等位基因來(lái)源于P76。檢測(cè)到莖葉鮮質(zhì)量相對(duì)值相關(guān)的QTL 1個(gè)：qRwfp-HP-B02.1位于B02染色體，解釋的表型變異分別是5.43%，其增效等位基因來(lái)源于花育28號(hào)。

對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在B02染色體上檢測(cè)到4個(gè)QTL(表2、圖1)，分別為qSmsh-HP-B02.1、qSwfp-HP-B02.1、qRmsh-HP-B02.1、qRwfp-HP-B02.1，其控制鹽脅迫下絕對(duì)株高、相對(duì)株高、絕對(duì)莖葉鮮質(zhì)量和相對(duì)莖葉鮮質(zhì)量，qSmsh-HP-B02.1、qSwfp-HP-B02.1、qRwfp-HP-B02.1兩端的標(biāo)記為Ah1TC1B02和Marker774175，qRmsh-HP-B02.1兩端的標(biāo)記為Marker774175和Marker911824，4個(gè)QTL的增效等位基因均來(lái)源于花育28號(hào)。

表2 鹽脅迫相關(guān)性狀的 QTL 檢測(cè)結(jié)果Tab.2 QTLs for traits related to salt stress

圖1 鹽脅迫下絕對(duì)株高、相對(duì)株高、絕對(duì)莖葉鮮質(zhì)量和相對(duì)莖葉鮮質(zhì)量相關(guān)QTL在全基因組上的分布Fig.1 QTL overviews of absolute and relative value of main stem height and shoot fresh weight on salt stress

3 討論與結(jié)論

花生生長(zhǎng)的各個(gè)時(shí)期耐鹽性表現(xiàn)不同。吳蘭榮等[23]對(duì)花生全生育期進(jìn)行耐鹽性鑒定，表明花生芽期和幼苗期是對(duì)鹽害最敏感時(shí)期，花生芽期耐鹽性與后期耐鹽性無(wú)明顯相關(guān)。因此，本試驗(yàn)將幼苗期作為花生耐鹽性重要時(shí)期進(jìn)行QTL定位。根據(jù)前期大量不同鹽濃度處理結(jié)果，選用0.75%鹽濃度作為水培條件下花生耐鹽性鑒定濃度。對(duì)于花生耐鹽性鑒定指標(biāo)，慈敦偉等[22]采用盆栽試驗(yàn)，開(kāi)展花生苗期耐鹽性評(píng)價(jià)及耐鹽指標(biāo)篩選，認(rèn)為地上部形態(tài)和生物量可作為耐鹽評(píng)價(jià)的首選指標(biāo)，而主根長(zhǎng)和出苗速度可作為輔助指標(biāo)用以判斷花生品種的綜合耐鹽能力。本研究選用鹽脅迫下主莖高、莖葉鮮質(zhì)量、莖葉干質(zhì)量、主根長(zhǎng)、根鮮質(zhì)量、根干質(zhì)量作為調(diào)查指標(biāo)研究花生的耐鹽性。

花生耐鹽性分子生物學(xué)的研究集中于轉(zhuǎn)外源基因?qū)τ诨ㄉ望}性影響和花生耐鹽相關(guān)基因的克隆。王亞等[28]通過(guò)花粉管通道法，將攜帶條斑紫菜PyTPS基因的pCAMBIA2300-PyTPS重組載體導(dǎo)入花生；宗自衛(wèi)等[29]將甜茶堿BADH基因轉(zhuǎn)入花生；表明轉(zhuǎn)基因植株比對(duì)照植株耐鹽性有所提高。王寶枝[30]克隆出了花生中的2種耐鹽基因液泡膜 Na+/H+逆轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NHX1 基因和多胺生物合成中的一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)節(jié)酶SAMDC基因；Chen等[31]通過(guò)序列分析及同源性比對(duì)方法從花生已有cDNA文庫(kù)中篩選到6個(gè)AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子基因，并獲得其全長(zhǎng)，轉(zhuǎn)基因擬南芥表明，AhERF6轉(zhuǎn)入擬南芥中能夠增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株鹽脅迫下鹽脅迫相關(guān)關(guān)鍵基因的表達(dá)。而目前關(guān)于花生耐鹽性QTL的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究檢測(cè)到13個(gè)鹽脅迫下各指標(biāo)絕對(duì)值相關(guān)的QTL，分布于10個(gè)連鎖群上；檢測(cè)到6個(gè)鹽脅迫下各指標(biāo)相對(duì)值相關(guān)的QTL。在B02染色體上檢測(cè)到1個(gè)QTL熱點(diǎn)區(qū)，包含4個(gè)QTL：qSmsh-HP-B02.1、qSwfp-HP-B02.1、qRmsh-HP-B02.1、qRwfp-HP-B02.1，控制鹽脅迫下株高和莖葉鮮質(zhì)量，其貢獻(xiàn)率分別4.79%，5.73%，2.80%和5.43%，增效等位基因均來(lái)源于花育28號(hào)，qRmsh-HP-B02.1兩端標(biāo)記為Marker774175和Marker911824，其他3個(gè)QTL兩端標(biāo)記為Ah1TC1B02和Marker774175。這種熱點(diǎn)區(qū)對(duì)于深入研究花生耐鹽機(jī)制具有重要意義。

本研究基于RIL群體表型數(shù)據(jù)和高密度遺傳圖譜，檢測(cè)到19個(gè)鹽脅迫下相關(guān)的QTL。檢測(cè)到1個(gè)QTL熱點(diǎn)區(qū)，位于B02染色體，包含4個(gè)QTL：qSmsh-HP-B02.1、qSwfp-HP-B02.1、qRmsh-HP-B02.1、qRwfp-HP-B02.1，鹽脅迫下株高和莖葉鮮質(zhì)量，增效等位基因均來(lái)源于花育28號(hào)。這種熱點(diǎn)區(qū)對(duì)于深入研究花生耐鹽機(jī)制具有重要意義。

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