煙草過氧化物酶基因NtPOD1的克隆及表達模式分析

楊尚諭，李立芹，陳 倩，卓 維，劉 侖，魯黎明

(四川農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，四川 成都 611130)

過氧化物酶(Peroxidase，POD)是一種廣泛存在于植物中的氧化還原酶，在結構上可以分為3類，最常見的是Ⅲ類分泌過氧化物酶(Secretory peroxidase)，其生物學功能是催化除去H2O2，并參與有毒還原劑的氧化、木質(zhì)素的生物合成和降解、蘇木素化、生長素分解代謝、植物形態(tài)建成[1-4]，并參與環(huán)境脅迫響應如傷害、病原體攻擊和氧化應激反應等[5-7]。

目前，在許多植物中已經(jīng)克隆到POD基因，如擬南芥(Arabidopsisthaliana)[8]、水稻(Oryzasativa)[9]、小桐子(JatorphacurcasL.)[10]、銀杏(GinkgobilobaL.)[11]、割手密(Saccharumspontaneum)[12]、芋頭(Colocasiaesculenta)[13]、蘿卜(RaphanussativusL.)[14]、甘蔗(Saccharumspp.)[15]、巴西橡膠樹(Heveabrasiliensis)[16]、石榴(PunicagranatumL.)[17]以及陸地棉(Gossypiumhirsutum)[18]等。其中，除了ScPOD02屬于Ⅱ類胞外過氧化物酶外，其余基因均屬于Ⅲ類分泌過氧化物酶。在功能研究方面，JcPOD73的表達受低溫強烈誘導；GbPOD1和ScPOD02均顯著受水楊酸、茉莉酸甲酯、脫落酸、聚乙二醇和鹽處理的誘導表達，GbPOD1的表達還受金屬Cu和Cd，以及甲基紫晶和機械傷害處理的顯著誘導，而ScPOD02還受過氧化氫處理誘導表達。

煙草是我國重要的經(jīng)濟作物之一，也是一個植物科學研究的模式植物。在實際生產(chǎn)中，干旱、鹽堿等非生物脅迫嚴重影響煙葉的產(chǎn)量及品質(zhì)[19]。因此，研究煙草的過氧化物酶基因的結構與功能，對于煙草抗逆性的提高具有重要意義。然而，煙草POD基因克隆與功能研究方面的報道較少。羅秀云[20]從普通煙草中克隆出了屬于Ⅲ類分泌過氧化物酶的煙草過氧化物酶基因Ntpx。Ntpx基因在根、莖、葉、花中均有表達，在花中表達量最高；同時，其表達還受到溫度及脫落酸等植物激素的顯著誘導。

雖然煙草POD基因已有克隆，但POD基因是一個多基因家族，具有高度多型性、功能多樣性的特點。所以，本研究對普通煙草的POD基因進行了克隆，并研究了其組織器官及逆境脅迫表達模式，旨在為煙草過氧化物酶基因的功能及結構研究奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及試劑

試驗材料為烤煙品種K326(Nicotianatabacumcv K326)。

從寶生物工程(大連)有限公司購買目的基因的克隆及回收使用的TRIzol試劑、cDNA合成試劑盒、限制性內(nèi)切酶等試劑；從天根公司購買DNA凝膠純化回收試劑盒；從南京唯贊生物科技有限公司購買大腸桿菌感受態(tài)DH5α；在上海生工生物工程有限公司完成了引物合成與測序。

1.2 試驗方法

1.2.1 煙草幼苗的處理 挑選的煙草種子要飽滿且大小一致，然后分別用75%的乙醇、10%的次氯酸鈉溶液和無菌水浸泡及清洗數(shù)次后播種于MS培養(yǎng)基上。在16 h光/8 h暗，25 ℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d后，挑選長勢一致的幼苗進行氧化(10 mmol/L H2O2)、低鉀(10 μmol/L K+)、高鹽(200 mmol/L NaCl)、干旱(5% PEG-6000)和ABA處理(1 μmol/L)。每處理設3次重復，處理0，3，6，12，24 h后，將煙苗整株在液氮中速凍，并置于-80 ℃冰箱中保存，用于RNA的提取。

低鉀培養(yǎng)基的配制方法，參見張雪薇等[21]的方法進行。

選取正常生長62 d的無菌苗植株，分別取植株根、莖、葉和花(盛花期)在液氮中速凍，并置于-80 ℃冰箱中保存，用于RNA的提取。

1.2.2 煙草NtPOD1基因的克隆 參考GenBank收錄的絨毛煙草(Nicotianatomentosiformis)POD42序列(ID：XP_009613011.1)，用DNAMAN軟件設計全長擴增引物NtPOD1-F和NtPOD1-R(表1)。RNA的提取采用TRIzol法，并參照魯黎明等[22]的方法進行。cDNA第一鏈的合成，參照反轉錄試劑盒按說明書進行。以反轉錄后的cDNA為模板，進行基因全長的擴增。擴增反應、電泳檢測、目的片段純化等試驗步驟參照卓維等[23]的方法進行。最后，隨機挑選3個陽性克隆送至上海生工生物工程有限公司測序。

1.2.3 煙草NtPOD1基因生物信息學分析NtPOD1編碼蛋白的理化性質(zhì)和疏水性分別用ExPASy ProtParam tool分析和在線軟件ProtScale分析；NtPOD1蛋白的二級結構和三級結構分別用IBCP的在線工具SOPMA和SWISS-MODEL的RasTop軟件預測；NtPOD1蛋白質(zhì)信號肽用 Signal-P 在線預測；NtPOD1的亞細胞定位用在線工具PSORT預測；NtPOD1編碼蛋白氨基酸的結構域用NCBI數(shù)據(jù)庫的 CDD分析；系統(tǒng)進化樹運用Clustalx-2.0.9、Bio Edit及MEGA 5軟件以鄰近法構建。

在本節(jié)，我們提出了2個身份認證的階段：用戶和傳感器之間的群組輕量級認證階段，傳感器與證書中心、傳感器與路由器之間的基于區(qū)塊鏈技術的身份認證階段。

1.2.4 煙草NtPOD1基因的表達模式分析 用Primer Premier 5.0根據(jù)所克隆基因的cDNA序列設計qPCR引物NtPOD1-qF和NtPOD1-qR(表1)，用煙草18S rRNA為內(nèi)參進行qPCR擴增。RNA的提取及cDNA的合成，均按本研究1.2.2的方法進行。qRT-PCR擴增參照卓維等[23]的方法進行?；蛳鄬Ρ磉_水平用2-ΔΔCt方法進行計算。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2 結果與分析

2.1 NtPOD1基因克隆及序列分析

進行PCR擴增的cDNA模板是以煙草葉片總RNA反轉錄合成的，電泳結果顯示，在1 000 bp位置上有清晰的條帶(圖1)。將該條帶進行回收純化測序，結果顯示，目的片段大小為981 bp。

利用DNAMAN軟件進行分析及多重序列比對，推導出該基因編碼326個氨基酸(aa)(圖2)，起始于ATG密碼子和終止于TAG密碼子。多重序列比對結果表明，其氨基酸序列與其他農(nóng)作物POD氨基酸序列有相似的結構域，包括血紅結合位點、活性位點、底物結合位點、鈣離子結合位點(圖3)，于是將所克隆的基因命名為NtPOD1。

M.Marker；1.NtPOD1基因。M.Marker；1.NtPOD1 gene PCR product.

圖2 NtPOD1基因的cDNA和氨基酸序列Fig.2 cDNA and amino acid sequence of the NtPOD1 gene

2.2 NtPOD1基因的生物信息學分析

2.2.1 NtPOD1蛋白的理化性質(zhì)和疏水性分析 利用ExPASy ProtParam tool軟件，對NtPOD1編碼蛋白進行了理化性質(zhì)分析，結果顯示：在NtPOD1基因編碼的326個氨基酸中，亮氨酸(9.8%)含量最高，其次為頡氨酸(7.7%)，然后為賴氨酸(7.4%)及精氨酸(7.1%)。該蛋白預測的分子量為37.19 ku，等電點PI為8.89，不穩(wěn)定系數(shù)(Instability index)為37.34，說明該蛋白可能是一個穩(wěn)定的蛋白。用在線軟件ProtScale進行的疏水性分析，結果其親水性平均指數(shù)為-0.362，預測該蛋白屬于親水性蛋白(圖4)。

2.2.2 NtPOD1蛋白的二級結構和三級結構預測 NtPOD1蛋白的二級結構利用SOPMA進行預測發(fā)現(xiàn)，該結構包含了α-螺旋(Alpha helix)、延伸鏈(Extended strand)、β-轉角(Beta turn)及無規(guī)則卷曲(Random coil)，其參與的氨基酸比例分別為47.24%，11.66%，14.11%及26.99%(圖5)。

圓點表示血紅素結合位點與活性中心的氨基酸序列；星號表示底物結合結構域的氨基酸序列；加號表示Ca2+結合位點。The origin indicates the amino acid sequence of the heme binding site and the active site；The asterisk indicates the amino acid sequence of the substrate binding domain；The plus sign indicates the Ca2 + binding site.

圖4 NtPOD1蛋白的疏水性分析Fig.4 Hydrophobicity analysis of target protein of NtPOD1

NtPOD1的三級結構運用 SWISS-MODEL的RasTop軟件進行了預測，結果見圖6。

利用PSORT在線預測NtPOD1的亞細胞定位，結果顯示，該蛋白在細胞外(包括細胞壁)占44.4%，在線粒體上占22.2%，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中占22.2%，在高爾基中占11.1%。此結果說明，NtPOD1可能主要定位在細胞外(包括細胞壁)。

圖5 NtPOD1蛋白的二級結構預測Fig.5 Predicted secondary structure of target protein of NtPOD1

2.2.4 NtPOD1蛋白的結構域 CDD分析結果表明(圖8)，NtPOD1蛋白具有過氧化物酶完整的保守結構域，結構域由第26-320位氨基酸組成，包括血紅素結合位點(Heme binding site)、活性位點(Active site)、底物結合位點(Substrate binding site)、鈣離子結合位點(Calcium binding sites)。還含有分泌過氧化物酶(Secretory peroxidase，Cd00693)和植物過氧化物酶超家族(Plant-peroxidase-like superfamily，C100196)2個保守功能域。該結果表明，本研究所獲得基因?qū)儆跓煵莸倪^氧化物酶基因家族。

圖6 NtPOD1蛋白的三級結構預測Fig.6 Prediction of tertiary structure of NtPOD1 protein

圖7 NtPOD1的信號肽預測Fig.7 Signal peptide prediction of NtPOD1

圖8 NtPOD1的結構域分析Fig.8 Structure domain analysis of NtPOD1

2.2.5NtPOD1基因的同源性分析 在 NCBI 數(shù)據(jù)庫中將NtPOD1編碼的氨基酸序列進行 Blast 比對，然后構建系統(tǒng)進化樹(圖9)，結果表明，NtPOD1與野生煙草(Nicotianaattenuata) POD42(XP_019240044.1)、美花煙草(Nicotianasylvestris) POD42(XP_009779064.1)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)POD42(XP_006348116.1)等具有較高的氨基酸序列同源性，分別為99%，99%，94%，與擬南芥(Arabidopsisthaliana)過氧化物酶ATP1a(CAA66862.1)的同源性最低，為81%。

同源性分析的結果表明，本研究所克隆的NtPOD1可能是煙草的過氧化物酶基因。

2.3 NtPOD1基因的組織表達分析

采用qPCR的方法分析了NtPOD1基因在根、莖、葉、花等組織的表達量，結果顯示，NtPOD1在根、莖、葉、花中均有表達(圖10)，在葉中的表達量最高。葉中表達量分別是莖的1.1倍、根的1.5倍、花的28.5倍。說明，NtPOD1的表達不存在組織特異性。

NtPOD1基因在根、莖、葉及花中均有表達，暗示NtPOD1基因廣泛參與了煙草的生長發(fā)育過程。

2.4 NtPOD1基因在非生物逆境脅迫下的表達分析

Na.野生煙草(XP_019240044.1)；Ns.美花煙草(XP_009779064.1)；St.馬鈴薯(XP_006348116.1)；Sl.番茄(XP_004232712.1)；Sp.潘那利番茄(XP_015066723.1)；Ca.辣椒(XP_016560122.1)；In.牽?；?XP_019171850.1)；Ib.紅薯(AFY26877.1)；Si.芝麻(XP_011096066.1)；Cr.長春花(AAY26520.1)；Gh.陸地棉(XP_016749469.1)；Co.油菜(ACT21094.1)；Tc.可可(XP_007026071.1)；Me.木薯(XP_021587652.1)；Bg.木欖(ADD54644.1)；Va.紅豆(XP_017406176.1)；Cs.黃瓜(XP_004145112.1)；Vv.葡萄(XP_002274769.1)；At.擬南芥(CAA66862.1)。

Na.Nicotianaattenuata；Ns.Nicotianasylvestris；St.Solanumtuberosum；Sl.Solanumlycopersicum；Sp.Solanumpennellii；Ca.Capsicumannuum；In.Ipomoeanil；Ib.Ipomoeabatatas；Si.Sesamumindicum；Cr.Catharanthusroseus；Gh.Gossypiumhirsutum；Co.Camelliaoleifera；Tc.Theobromacacao；Me.Manihotesculenta；Bg.Bruguieragymnorhiza；Va.Vignaangularis；Cs.Cucumissativus；Vv.Vitisvinifera；At.Arabidopsisthaliana.

圖9NtPOD1系統(tǒng)進化分析
Fig.9HomologyanalysisofNtPOD1

為了探索NtPOD1是否參與煙草的非生物脅迫響應，對NtPOD1在低鉀(10 μmol/L K+)、5% PEG-6000、10 mmol/L H2O2、200 mmol/L NaCl和1 μmol/L ABA處理后的表達量進行了分析，結果表明，5% PEG-6000和H2O2處理后，表達量上調(diào)，分別在24，12 h達到最大，分別為對照的2.79倍和5.52倍(圖11)。200 mmol/L NaCl處理后，表達量下調(diào)，呈現(xiàn)先下降-升高-下降的趨勢；1 μmol/L ABA和低鉀處理后，表達量受到誘導，分別在24，12 h達到最大，分別為對照的3.53倍和3.67倍(圖12)。試驗表明，NtPOD1基因受非生物脅迫刺激誘導，說明NtPOD1基因可能在煙草的應激反應中發(fā)揮作用。

多重比較采用Duncan′s法，圖中不同組織之間不同小寫字母表示P<0.05差異顯著。圖11-12同。Multiple comparisons using Duncan′s method，the figure in different lowercase letters between different organizations P <0.05 significant difference.The same as Fig.11-12.

圖11 NtPOD1在 5% PEG-6000和10 mmol/L H2O2處理下的相對表達量Fig.11 Relative expression of NtPOD1 under 5% PEG-6000 and 10 mmol/L H2O2 treatment

圖12 NtPOD1在200 mmol/L NaCl、1 μmol/L ABA和10 μmol/L K+處理下的相對表達量Fig.12 Relative expression of NtPOD1 under 200 mmol/L NaCl，1 μmol/L ABA and 10 μmol/L K+ treatment

3 討論

過氧化物酶(POD)在植物正常生長和應激反應中發(fā)揮著重要作用，是植物重要的保護酶類，在高等植物中分布較為廣泛。根據(jù)結構的不同可將過氧化物酶分為3類[24]，Ⅰ類為胞內(nèi)過氧化物酶，包括抗壞血酸-過氧化物酶(Ascorbic acid-peroxidase，APx)、細胞色素C-過氧化物酶(Cytochrome C-peroxidase，Ccp)等；Ⅱ類為胞外過氧化物酶，包括錳-過氧化物酶(Manganese-peroxidase，MnP)、木質(zhì)素酶-過氧化物酶(Ligninase-peroxidase，LiP)等；Ⅲ類是分泌過氧化物酶(Secretory peroxidase)，如辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)。分泌過氧化物酶是植物血紅素依賴性過氧化物酶，催化涉及過氧化氫作為電子受體的多步氧化反應，含有4個保守的二硫鍵和2個保守的鈣結合位點[25]。

本研究從烤煙品種K326中克隆到一個cDNA序列，在 NCBI 數(shù)據(jù)庫中進行 Blast 結果顯示，該基因與漸窄葉煙草POD42、美花煙草POD42、馬鈴薯POD42等具有很高同源性，說明其可能是一個POD基因。該基因編碼蛋白的功能結構域分析結果表明，該蛋白具有過氧化物酶完整的peroxidase-4保守結構域，包括血紅結合位點、活性位點、底物結合位點、鈣離子結合位點，還含有2個保守功能域。與閆師杰等[26]、鄭雯等[27]、王海波等[10]、程華等[11]、羅秀云[20]等研究的結果一致，NtPOD1屬于植物血紅素依賴性過氧化物酶超家族的Ⅲ類的分泌氧化酶。在結構方面，NtPOD1蛋白二級結構以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主，與石榴的PgPOD[17]和小桐子的JcPOD73[10]結構相似。NtPOD1的亞細胞定位預測結果與Ren等[28]研究毛果楊的PtPRX6和PtPRX24定位結果相似。同源性、結構功能域與結構分析等均證明了NtPOD1屬于植物血紅素依賴性過氧化物酶超家族的Ⅲ類的分泌氧化酶。

NtPOD1在根、莖、葉、花中均有表達，與前人的研究結果相一致[10-11，18，20]，說明POD基因的表達并沒有組織特異性。但不同的POD基因在各個組織中的表達水平并不相同，如NtPOD1在葉中表達量最高，Ntpx基因在花中表達量最高[20]，GbPOD1[11]和JcPOD73[10]在莖中表達量最高。此外，郭媖等[18]從陸地棉中克隆的2個相似性達99%的POD基因，在不同組織、不同生長階段的表達亦有所不同。由此說明，作為多基因家族的POD基因，具有高度多型性及功能多樣性的特點。

作為植物的重要保護酶類，POD基因在植物的脅迫響應中發(fā)揮著重要作用。研究表明，銀杏GbPOD01基因在ABA及PEG脅迫下表達量下調(diào)[11]，白楊PoPOD1基因在PEG脅迫下表達量下調(diào)[7]。甘蔗ScPOD02基因在ABA、PEG 及NaCl 脅迫下表達量上調(diào)[15]，Ntpx基因在ABA和干旱脅迫下，表達量上調(diào)[20]。本研究結果表明，NtPOD1的表達同樣受干旱、鹽、H2O2、低鉀和ABA處理誘導。其在ABA和PEG模擬干旱處理下的表達模式，與Ntpx基因相一致[20]；NtPOD1在NaCl 脅迫下表達量下調(diào)，則與GbPOD01及PoPOD1基因的鹽誘導表達相類似[7，11]。同時，NtPOD1基因受10 mmol/L H2O2和低鉀(10 μmol/L K+)強烈誘導，上調(diào)表達。由此說明，NtPOD1基因參與了煙草低鉀、干旱、鹽、H2O2和ABA的脅迫響應，并可能在煙草的應激反應中發(fā)揮重要作用。

本研究克隆出了煙草過氧化物酶基因NtPOD1，其表達沒有組織特異性。NtPOD1基因的表達受非生物脅迫的誘導，但其在煙草生長發(fā)育及脅迫響應中的具體作用，尚有待進一步研究。

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