黃野螟谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶Sigma 1基因的鑒定及表達模式

程 杰，王春燕，林 同

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣東 廣州 510640)

土沉香(Aquilariasinensis(Lour1)Gilg)亦稱白木香，為瑞香科沉香屬植物，是我國生產(chǎn)沉香的唯一植物資源，其經(jīng)濟價值很高，現(xiàn)已被列為國家2級珍稀瀕危保護植物。黃野螟(HeortiavitessoidesMoore)屬鱗翅目(Lepidoptera)螟蛾科(Pyralidae)，在我國廣泛分布于廣東、廣西、海南和云南等南方各省以及香港特別行政區(qū)。黃野螟是土沉香的重要害蟲，以食葉危害大，發(fā)生時常把葉片吃光，使其變成禿稍，嚴(yán)重影響了植株的生長[1-3]。

谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GSTs，EC 2.5.1.18)屬于多功能酶，廣泛存在于真核細胞及原核細胞中[4]。GSTs可以分為15個家族(Alpha、Beta、Delta、Epsilon、Kappa、Lambda、Mu、Omega、Pi、Phi、Rho、Sigma、Theta、Tau和Zeta)[5]，而大部分昆蟲GSTs可分為6個家族(Delta、Epsilon、Omega、Sigma、Theta和Zeta)。其中Delta和Epsilon是昆蟲特異的家族[6]。GSTs不僅成員眾多，而且功能復(fù)雜。有研究表明，GSTs功能涉及內(nèi)源與外源化合物的脫毒反應(yīng)、氧化應(yīng)激、胞內(nèi)運輸以及激素合成[7]。在昆蟲中，GSTs功能涉及兩大部分，一部分功能是作為配體結(jié)合蛋白結(jié)合有毒物質(zhì)，從而行使解毒功能；另一部分功能是催化谷胱甘肽巰基和一些親電性有毒物質(zhì)(如過氧化物、殺蟲劑及醌類化合物等)進行軛合反應(yīng)[8]。一些研究表明，昆蟲GSTs在殺蟲劑代謝中起到關(guān)鍵作用[9-10]。

本研究基于黃野螟成蟲轉(zhuǎn)錄組文庫數(shù)據(jù)，經(jīng)過Blast同源比對，獲得黃野螟谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶Sigma家族Sigma1基因cDNA全長，命名為HvGSTs1，首次對其進行生物信息學(xué)分析以及不同發(fā)育時期不同組織部位表達分析，以期為以后研究黃野螟Sigma家族GST的生理功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

黃野螟卵及幼蟲采自廣東省化州市平定鎮(zhèn)(22°01′N，110°25′E)，在人工氣候箱設(shè)置溫度為27 ℃、相對濕度為75%、光照周期L/D=16 h/8 h條件下，用新鮮的土沉香葉片飼養(yǎng)至蛹及成蟲。分別收集黃野螟各蟲態(tài)蟲體各5頭(卵、幼蟲、蛹、成蟲)經(jīng)清洗、消毒、麻醉，將樣品置于無菌去酶的EP管液氮速凍后，放于-80 ℃冰箱保存。選取30頭4齡幼蟲及30頭2日齡成蟲用上述方法解剖并獲得幼蟲頭、體壁、脂肪體、中腸，成蟲頭、胸、腹、足、翅。

1.2 主要試劑

(OMEGA公司)總RNA提取試劑盒(E.Z.N.ATMTotal RNA KitⅡ)；(TaKaRa公司)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser)及實時熒光定量試劑盒(SYBR premix Ex TapTM)。

1.3 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

各樣本總RNA的提取嚴(yán)格按照E.Z.N.ATMTotal RNA KitⅡ提取試劑盒說明書進行，各樣本的RNA質(zhì)量使用1.5% 瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，各樣本的RNA濃度使用微量紫外分光光度計(Nanodrop 2000)進行檢測，符合后續(xù)試驗要求的-80 ℃低溫保存。取2 μL RNA并使用PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第1鏈cDNA。

1.4 基因克隆

從黃野螟成蟲轉(zhuǎn)錄組文庫(NCBI SRA登錄號：SRX3035102)中克隆出GSTs1基因完整編碼序列。

1.5 生物信息學(xué)分析

NCBI ORF Finder工具(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)用于ORF搜索；ExPASy-ProtParam工具(http：//web.expasy.org/protparam/)用于蛋白理化性質(zhì)分析；SignalP-4.1工具(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)用于信號肽預(yù)測；NetPhos 3.1 工具(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)用于蛋白磷酸化位點預(yù)測；SubLoc v1.0工具(http：//www.bioinfo.tsinghua.edu.cn/SubLoc/)用于亞細胞定位預(yù)測；TMHMM v.2.0工具(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)用于跨膜區(qū)預(yù)測；COILS工具(http：//www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html)用于卷曲螺旋預(yù)測；SOPMA工具(https：//npsa-prabi.ibcp.fr)用于蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測；SSpro 4.0 工具(http：//beta.swissmodel.expasy.org/)用于蛋白空間結(jié)構(gòu)預(yù)測；NCBI 蛋白Blast工具(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)用于獲得蛋白同源序列；ClustalX工具(http：//www.clustal.org/download/1.X/ftp-igbmc.ustrasbg.fr/pub/ClustalX/)用于對齊同源蛋白。在MEGA 4.0工具中使用鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。DNAMAN工具(v6.0.3.48)用于氨基酸同源性比對。

1.6 實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR反應(yīng)體系：2.0 μL的cDNA模板，10.0 μL的SYBR Premix ExTaq，上下游引物各0.4 μL，7.2 μL的ddH2O。利用Primer premier 5.0設(shè)計本試驗中所需要的引物(表1)。實時熒光定量PCR擴增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃解鏈10 s，60 ℃延伸20 s；共進行40個循環(huán)。實時熒光定量PCR內(nèi)參基因：微管蛋白(α-tubulin)基因(GenBank登錄號：MG132200)。實時熒光定量PCR陰性對照：無菌超純水。實時熒光定量PCR表達量測定：以黃野螟GSTs1在卵期的表達量為標(biāo)準(zhǔn)參量來測定其各蟲態(tài)的表達量，以黃野螟GSTs1在4齡幼蟲的表達量為標(biāo)準(zhǔn)參量來測定其在幼蟲各組織的表達量，以黃野螟2日齡成蟲GSTs1的表達量為標(biāo)準(zhǔn)參量測定其成蟲各部位的表達量，每個樣本3次重復(fù)。使用2-ΔΔCt法測定每個cDNA模板GSTs1基因的相對表達水平。上述數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用Excel和SPSS 18.0軟件的Duncan′s單因素方差分析法(ANOVA)。

表1 所用引物Tab.1 Primers used

2 結(jié)果與分析

2.1 基因序列及編碼氨基酸序列分析

通過對黃野螟成蟲轉(zhuǎn)錄組文庫(NCBI SRA登錄號：SRX3035102)進行篩選，再經(jīng)NCBI核酸序列數(shù)據(jù)庫在線Blast同源性比對后，篩選出一條具有完整ORF的序列，鑒定其屬于谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶Sigma家族，為黃野螟谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶Sigma1基因，命名為HvGSTs1(GenBank：MF521977)，全長1 054 bp，其中開放閱讀框長度為615 bp，共編碼204個氨基酸(圖1)，推測的編碼蛋白質(zhì)分子量23.198 ku，等電點pI為5.24，不穩(wěn)定系數(shù)為47.61，脂肪系數(shù)80.88。疏水性分析表明，該蛋白為親水蛋白。無信號肽和跨膜區(qū)。蛋白磷酸化位點預(yù)測表明，HvGSTs1蛋白含有絲氨酸磷酸化位點9個，蘇氨酸磷酸化位點2個，酪氨酸磷酸化位點6個。

方形符號用于標(biāo)注絲氨酸(Ser)磷酸化位點；圓形符號用于標(biāo)注蘇氨酸(Thr)磷酸化位點；三角符號用于標(biāo)注酪氨酸(Tyr)磷酸化位點；起始密碼子ATG及終止密碼子TAA以加粗表示。The phosphorylation sites of Ser are indicated in square. The phosphorylation sites of Thr are indicated in circle.The phosphorylation sites of Tyr are indicated in triangle. The initiation and termination codons are indicated in bold font.

2.2 亞細胞定位及功能結(jié)構(gòu)域

亞細胞定位顯示，GSTs1蛋白定位在細胞質(zhì)的可能性最大，為52.2%，推測該蛋白存在于細胞質(zhì)中。使用NCBI Conserved Domains Search工具對HvGSTs1蛋白保守結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測，結(jié)果表明，HvGSTs1屬于GST Sigma型蛋白(圖2)，8-73位氨基酸為GST_N_Sigma_like結(jié)構(gòu)域，屬于thioredoxin_like superfamily；83-186位氨基酸為GST_C_Sigma_like結(jié)構(gòu)域，屬于GST_C_family superfamily。

圖2 HvGSTs1蛋白保守區(qū)預(yù)測Fig.2 Conserved domains of HvGSTs1 protein

2.3 高級結(jié)構(gòu)

HvGSTs1蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測使用SOPMA軟件，結(jié)果表明，該蛋白的二級結(jié)構(gòu)由α 螺旋(50.00%)、無規(guī)則卷曲(29.90%)、延伸鏈(11.76%)、β 轉(zhuǎn)角(8.33%)構(gòu)成。以此推測該蛋白的主要二級結(jié)構(gòu)由α螺旋和無規(guī)則卷曲構(gòu)成?？臻g結(jié)構(gòu)分析使用SSpro 4.0 工具(圖3)，結(jié)果表明，HvGSTs1蛋白具有1個谷胱甘肽的結(jié)合區(qū)域，即N端結(jié)構(gòu)域；還具有1個識別并結(jié)合底物區(qū)域，即C端結(jié)構(gòu)域。

2.4 同源序列比對及系統(tǒng)發(fā)育樹

基于黃野螟和其他6種鱗翅目昆蟲GSTs Sigma 1氨基酸序列同源性比對結(jié)果表明(圖4)，黃野螟與二化螟(Chilosuppressalis)同源性最高，為76%，與家蠶(Bombyxmori)、菜粉蝶(Pierisrapae)、棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)、斜紋夜蛾(Spodopteralitura)、稻縱卷葉螟(Cnaphalocrocismedinalis)同源性分別是73%，74%，70%，71%，70%。黃野螟與其他6種鱗翅目昆蟲的GSTs Sigma 1氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹結(jié)果表明(圖5)，黃野螟與二化螟遺傳距離最近，與同源性分析的結(jié)果一致。

圖中1、2、3、4分別表示α螺旋、β轉(zhuǎn)角、延伸鏈、無規(guī)則卷曲。N、C表示蛋白N端和C端。The alpha helix，beta turn，extended strand，random coil are denoted by1，2，3，4 respectively. N and C indicate N-terminal and C-terminal ends of the protein，respectively.

圖 4 不同鱗翅目昆蟲GSTs1的多序列比對Fig.4 Multiple sequence alignment of GSTs1 from different Lepidoptera insects

圖5 不同昆蟲GSTs1蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.5 Phylogenetic analysis of GSTs1 proteins from other species

2.5 HvGSTs1基因的表達

用RT-qPCR分析了黃野螟不同發(fā)育階段、幼蟲不同部位及成蟲不同部位HvGSTs1相對表達量，結(jié)果表明，在黃野螟4個不同發(fā)育階段均檢測到HvGSTs1的表達。具體而言，HvGSTs1的相對mRNA水平主要表達在蛹期，是卵期的958%，在其他發(fā)育階段檢測到相對較低的mRNA表達水平(P<0.05)(圖6)。在幼蟲各部位的脂肪體中發(fā)現(xiàn)最高的HvGSTs1表達水平(P<0.05)，是對照的225%，而在幼蟲的中腸中發(fā)現(xiàn)最低的HvGSTs1表達水平(P<0.05)，是對照的20%，頭及表皮基因表達量都顯著低于對照(P<0.05)，分別是對照的50%和61%，幼蟲4個不同部位之間基因表達差異顯著(P<0.05)(圖7)。HvGSTs1基因在成蟲的腹部和胸部表達量最高，分別為對照的447%和325%，在足表達量最低，為對照的28%，該基因在成蟲的5個部位的表達水平均有顯著差異(P<0.05)(圖8)。

圖中數(shù)據(jù)代表3個生物重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。基于ANOVA分析，柱上不同小寫字母表明差異顯著(P<0.05)。圖7-8同。

The data represent mean ±SD of 3 biological repeats. Small letters indicate significant differences atP< 0.05 level according to ANOVA.The same as Fig.7-8.

圖6黃野螟不同發(fā)育階段HvGSTs1表達譜
Fig.6ThetemporaltranscriptpatternsofHvGSTs1

圖 7 HvGSTs1基因在黃野螟幼蟲中的表達Fig.7 The spatial expression patterns of HvGSTs1 in larvae

圖 8 HvGSTs1基因在黃野螟成蟲中的表達Fig.8 The spatial expression patterns of HvGSTs1 in adults

3 討論

GSTs屬于超基因家族酶，它可以催化機體內(nèi)還原性谷胱甘肽(GSH)與外源性及內(nèi)源性有毒物質(zhì)發(fā)生親電子基團反應(yīng)，反應(yīng)后使有毒物質(zhì)更容易排出體外，降低機體遭受的損害，是生物體內(nèi)一類重要的Ⅱ相解毒酶[11]?；诩毎凶湮恢?，將GSTs分為三大類型，即微粒體型(Microsomal GSTs)、線粒體型(Mitochondrial GST)和胞質(zhì)型(Cytosolic GSTs)[12]。其中，胞質(zhì)型GSTs是研究最多的類型，通常所指的谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶即為此類。胞質(zhì)型GSTs屬于二聚體蛋白，由同源或者異源亞基組成，每個亞基200～250個氨基酸，分子量大小為20～28 ku。不同家族的GST亞基在氨基酸序列上已經(jīng)高度進化，但每個亞基都由2個結(jié)構(gòu)域組成：N-末端結(jié)構(gòu)域(結(jié)構(gòu)域Ⅰ)和C-末端結(jié)構(gòu)域(結(jié)構(gòu)域Ⅱ)。N-末端結(jié)構(gòu)域含有G位點，可以與GSH結(jié)合，C-末端結(jié)構(gòu)域含有H位點，可以親電子底物結(jié)合，二者構(gòu)成了GSTs的催化反應(yīng)活性中心[13-14]。黃野螟GSTs1和其他物種GSTs結(jié)構(gòu)一樣，NCBI對其蛋白保守域預(yù)測顯示，在第8-73位為保守的N端結(jié)構(gòu)域，在第83-186位為C端結(jié)構(gòu)域。

隨著殺蟲劑的使用范圍越來越廣、使用劑量越來越高，據(jù)統(tǒng)計，約500種昆蟲對不同的殺蟲劑產(chǎn)生了抗性[15]。近年來，對于昆蟲GTSs的研究主要集中在殺蟲劑抗性方面[16-18]，不同的殺蟲劑處理后，GSTs可以催化谷胱甘肽與殺蟲劑的特殊基團結(jié)合從而進行脫毒作用(脫氯化氫作用等)[19]。在昆蟲GSTs 6個家族中，Delta和Epsion是昆蟲特有的GSTs，大量研究表明，二者參與了對殺蟲劑(例如對有機磷、有機氯殺蟲劑及擬除蟲菊素類殺蟲劑)的脫毒作用[20-21]。也有研究表明，在昆蟲中，Sigma和Omega家族GSTs對內(nèi)外源的有毒物質(zhì)，包括對殺蟲劑也有脫毒作用[22-23]。除此之外，有報道指出，在果蠅(Drosophilamelanogaster)和家蠅(Muscadomestica)飛行肌中，Sigma型GSTs與肌鈣蛋白H有密切聯(lián)系，此外，昆蟲Sigma GSTs還具有催化活力[24]。

不同昆蟲在不同發(fā)育時期其體內(nèi)的GSTs活性不同，例如在甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)中，SeGSTs1基因mRNA相對表達量在3齡幼蟲時期最高[25]，而在扶桑綿粉蚧(Phenacoccussolenopsis)中，PsGSTz1基因在1齡幼蟲中的表達量最高，是其成熟雌蟲的2.65倍[26]。黃野螟GSTs1在不同發(fā)育階段均有表達，表明在黃野螟整個生命過程中均起重要作用。HvGSTs1在蛹期的表達量最高，是卵期的958%，推測HvGSTs1可能參與黃野螟羽化，與赤擬谷盜(Triboliumcastaneum)中TcGSTd1和TcGSTd2表達模式類似[27]。黃野螟GSTs1基因在4齡幼蟲不同部位中均有表達，其中在脂肪體中相對表達量最高，在稻縱卷葉螟[28]、棉鈴蟲[29]、美洲棉鈴蟲[30]中同樣是脂肪體GSTs活性最高，原因是脂肪體是昆蟲中重要的解毒場所，同時也是許多生理代謝作用進行的場所[31]。黃野螟GSTs1基因在2日齡成蟲頭、胸、腹、足、翅都均有表達，在腹部及胸部中表達量最高，推測原因可能是由于腹部作為黃野螟成蟲生殖及代謝中心，胸部作為運動中心，會消耗大量能量并產(chǎn)生內(nèi)源性有毒物質(zhì)。HvGSTs1在上述部位大量表達有助于黃野螟抵御體內(nèi)有毒物質(zhì)的侵害。

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