京郊快菜細(xì)菌性軟腐病病原鑒定

李曉穎，田 宇，趙 亮，陳昌龍，謝 華

(北京市農(nóng)林科學(xué)院 北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)基因資源與生物技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097)

胡蘿卜軟腐果膠桿菌(Pectobacteriumcarotovorum(Pc))是自然條件下普遍存在、寄主范圍和地理分布最為廣泛的植物病原菌之一[1]。Pc表現(xiàn)出高度的遺傳多樣性，可被進(jìn)一步劃分為3個亞種：胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種P.carotovorumsubsp.carotovorum(Pcc)、胡蘿卜軟腐果膠桿菌黃檀亞種P.carotovorumsubsp.odoriferum(Pco)和胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西亞種P.carotovorumsubsp.brasiliensis(Pcb)[2]。不同于以往認(rèn)為的引發(fā)白菜細(xì)菌性軟腐病的病原菌為Pcc亞種[3-4]，對北京地區(qū)白菜型油菜(Brassicarapasubsp.chinensis)軟腐病株進(jìn)行分離，得到了Pcb菌株[5-6]，而引發(fā)該地區(qū)芹菜(Apiumgraveolens)軟腐病原菌則以Pco為主[7-8]；可見，Pc不同亞種菌株具有各自的寄主偏好性。快菜(苗用大白菜，Brassicarapasubsp.pekinensis)因具有口感好、營養(yǎng)價(jià)值高和生長周期短等優(yōu)點(diǎn)，已成為京郊主要種植的葉類蔬菜。近年來，隨著其種植面積的不斷增加和設(shè)施種植模式的快速推廣，細(xì)菌性軟腐病發(fā)生日益頻繁，成為快菜上一類毀滅性病害。目前，尚未見到有關(guān)快菜軟腐病原的詳細(xì)報(bào)道。

本研究針對2015年從北京不同區(qū)縣快菜產(chǎn)地采集的軟腐病株，結(jié)合病原菌形態(tài)學(xué)、生理生化及分子生物學(xué)手段對病原菌進(jìn)行綜合鑒定，以明確引發(fā)快菜軟腐病致病菌種類及其生物學(xué)特性，為該病害的科學(xué)防治提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株來源及分離

本研究的軟腐病菌采自北京昌平、通州、懷柔、大興和房山區(qū)的快菜種植區(qū)。病原菌分離及回接試驗(yàn)參考《植病研究方法》(第3版)[9]。從接種48 h后發(fā)病組織上重新分離獲得病原菌，并編號為KC-01～KC-19、KC-21～KC-30(表1)，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

表1 Pc菌株的致病力等級Tab.1 Pathogenicity levels of the Pc strains isolated

注：大興1.大興區(qū)長子營鎮(zhèn)南蒲洲村；大興2.北京市大興區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)示范站；不同小寫字母代表顯著性差異分析結(jié)果(P<0.05，Duncan)；M.中致病力；H.高致病力。

Note：Daxing1.Nanpuzhou，Zhangziying，Daxing District；Daxing2.Agricultural Technology Demonstration Station，Daxing District；a-i.The different superscript letters indicate significant difference(P<0.05，Duncan)；M.Medium pathogenicity；H. High pathogenicity.

1.2 致病力測定

選取健康的大白菜用于致病性分析。接種方法及致病力分級標(biāo)準(zhǔn)參照胡娜娜等[6]的方法。在同等條件下，設(shè)接種無菌0.9% NaCl生理鹽水的植物組織為對照。接種后24 h測量病斑的長度，設(shè)置3次重復(fù)，取其平均值作為平均病斑長度。采用SPSS 19.0方差分析程序(ANOVA)對不同菌株間的致病力進(jìn)行差異顯著性分析。

1.3 菌株形態(tài)、Biolog微生物鑒定系統(tǒng)及生理生化特性分析

菌株形態(tài)觀察、結(jié)晶紫果膠酸鹽(Crystal violet pectate，CVP)、菌落在KB培養(yǎng)基上的熒光反應(yīng)及7% NaCl和37 ℃培養(yǎng)、氧化還原酶和磷酸酶活性、明膠液化以及其他12種碳水化合物的利用參考《植物病原細(xì)菌鑒定實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》(第3版)[10]。每個菌株設(shè)3次重復(fù)，參試的對照菌株為PccECC71[11]、PcoBCS7[12]和PcbBC1，不接菌的培養(yǎng)基為空白對照。Biolog微生物鑒定參照田宇等[7]的方法。

1.4 特異性PCR擴(kuò)增分析

將純化后的29個菌株于液體LB培養(yǎng)基中28 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，使用Easy Pure Genomic DNA Kit(TRANSGEN)試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA。本研究所利用的特異性引物包括Pc的果膠酸鹽裂解酶基因(pectate-lyase，pelY)特異性引物Y1/Y2[13](5′-TTACCGGACGCCGAGCTGTGGCGT-3′/5′-CAGGAAGATGTCGTTATCGCGAGT-3′)和Pcb特異性引物BR1f/L1r[14](5′-GCGTGCCGGGTTTATGACCT-3′/5′-CAAGGCATCCACCGT-3′)。利用引物G1/L1(5′-GAAGTCGTAACAAGG-3′/5′-CAAGGCATCCACCGT-3′)擴(kuò)增16S～23S rDNA ITS(Intergenic transcribed spacer)，結(jié)合限制性內(nèi)切酶RsaⅠ(Ferments，USA)酶切，進(jìn)行PCR-RFLP鑒定[15]。

1.5 16S rDNA和pmrA基因序列系統(tǒng)關(guān)系分析

采用16S rDNA引物Pe1/Pe2[6]和pmrA基因引物F0145/E2477[16]對上述菌株基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測序。基于本研究中29個菌株與NCBI上相關(guān)菌株的16S rDNA和pmrA基因完整序列，利用軟件MEGA 6.0分別構(gòu)建UPGMA(The unweighted pair group method with arithmetic averages)系統(tǒng)發(fā)育樹，獲得各菌株間的遺傳關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 軟腐病原菌形態(tài)特征

從北京不同區(qū)縣采集的快菜軟腐病病樣(圖1-A)中分離得到了29株菌株。經(jīng)回接驗(yàn)證(圖1-D)，均可引發(fā)快菜軟腐病。發(fā)病部位呈淡黃色半透明的水浸狀病斑，病部逐漸擴(kuò)展后呈淺褐色的黏稠狀，具惡臭氣味。病原菌在LB固體培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)24 h，菌落呈圓形、乳白色、半透明且邊緣整齊(圖1-B)，在CVP上可產(chǎn)生杯狀凹陷(圖1-C)。病原菌為革蘭氏陰性菌(圖1-E)，形態(tài)呈短桿狀，兩頭稍鈍圓，鞭毛周生(圖1-F)。以上菌株形態(tài)特征與Pectobacterium一致[9]。

A. 快菜軟腐病田間發(fā)病癥狀；B. LB固體培養(yǎng)基上菌落形態(tài)；C. 菌株在CVP平板上產(chǎn)生杯狀凹陷；D. 回接48 h后活體快菜發(fā)病癥狀(左為接種菌液后發(fā)病植株，右為接種清水的對照植株)；E. 革蘭氏染色(G-)；F. 鞭毛染色。

A. Soft rot symptoms of Chinese cabbage in the fields；B. Bacterial colonies on LB medium；C. Cavities formed on CVP medium；D. Soft rot symptoms on Chinese cabbage 48 h after inoculation(the left side was the infected plant inoculated with the bacteria solution and the right side was the control plant inoculated with water)；E. Gram staining of the bacterial isolates(G-)；F. Flagella staining of the bacterial isolates.

圖1快菜軟腐癥狀和病原菌形態(tài)學(xué)特征
Fig.1SoftrotsymptomsonChinesecabbageandphenotypiccharacteristicsofthebacterialsoftrotpathogens

2.2 軟腐病菌生理生化特性

Biolog微生物自動化鑒定系統(tǒng)將29株菌株鑒定為Pc，進(jìn)一步生理生化特征分析結(jié)果顯示：所有菌株在過氧化氫酶反應(yīng)中呈陽性，可使明膠液化，在磷酸酶、氧化酶反應(yīng)中呈陰性，在KB培養(yǎng)基上生長不產(chǎn)生熒光，可利用纖維素二糖、蜜二糖產(chǎn)酸，不能利用菊糖、山梨醇、α-甲基葡糖苷產(chǎn)酸；同時(shí)也與Pco可利用山梨醇和α-葡糖苷產(chǎn)酸特性不同，符合Pcc和Pcb生理生化性狀特征描述[14，17-20]。這些菌株的生理生化特性也存在一些差異(表2)：菌株KC-03和KC-06不具備在37 ℃及7% NaCl條件下生長的能力；僅KC-05、KC-12、KC-17、KC-23和KC-24可微利用異麥芽酮糖、D-麥芽糖、D-阿拉柏糖醇；KC-07不能利用棉籽糖產(chǎn)酸以及菌株KC-01～03、KC-06和KC-07無法利用檸檬酸鹽。

表2 Pc菌株生理生化特征Tab.2 Physiological and biochemical characterizations of the strains

注：+. 陽性；-. 陰性；W. 微弱利用。

Note：+. Positive；-. Negative；W. Weak positive.

2.3 特異性引物PCR鑒定

利用Pc的Pel基因特異性引物Y1/Y2對29株菌株基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均可得到預(yù)期片段大小為434 bp的產(chǎn)物(圖2-A)，而Pcb特異性引物BR1f/L1r在17株菌株及對照菌株BC1(Pcb)中均擴(kuò)增出大小約322 bp的產(chǎn)物(圖2-D)；L1/G1引物16S～23S rDNA ITS區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(圖2-B)RsaⅠ酶切結(jié)果顯示，特征性帶型可將29株菌株劃分為Group Ⅰ～Ⅲ 3組(圖2-C)。Group Ⅰ包含的17株菌株帶型與對照菌株BC1(Pcb)相同，與Pcb特異性引物擴(kuò)增結(jié)果一致；Group Ⅱ包含的4株菌株P(guān)CR-RFLP帶型與ECC71(Pcc)帶型相同；Group Ⅲ的8株菌株P(guān)CR-RFLP帶型雖與本研究中的對照菌株均不相同，但與Toth等[15]報(bào)道的Pcc帶型一致。

A. 引物 Y1/Y2；B. 引物G1/L1；C. Rsa Ⅰ限制性內(nèi)切酶切ITS-RFLP帶型；D. 引物BR1f/L1r。1～29. 分離菌株KC-01～19、KC-21～30；30～32. 標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)cc ECC71、Pcb BC1和Pco BCS7；33. 陰性對照ddH2O。A. Primers Y1/Y2；B. Primers G1/L1；C. ITS-RFLP patterns digested with Rsa Ⅰrestriction enzyme；D. Primers BR1f/L1r .1-29. Isolated strains KC-01-19 and KC-21-30；30-32. Standard strains Pcc ECC71，Pcb BC1，and Pco BCS7；33. Negative control ddH2O.

2.4 16S rDNA和pmrA基因序列及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

對29株菌株的16S rDNA(GenBank登錄號為KY021028-KY021056)和pmrA基因(KY020997-KY021015、KY021015-KY021026)進(jìn)行PCR擴(kuò)增測序，分別獲得片段大小為666，1 530 bp的產(chǎn)物?；趐mrA基因完整序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中(圖3)，17株菌株與已發(fā)表的5株P(guān)cb菌株形成了明顯的Pcb類群，其余12株菌株則與已發(fā)表的5株P(guān)cc菌株形成了Pcc類群，該結(jié)果與上述特異性引物和PCR-RFLP帶型鑒定結(jié)果一致；因此，綜合以上形態(tài)學(xué)、多種生理生化和分子生物學(xué)分析結(jié)果，確定了29株快菜細(xì)菌性軟腐病菌株均屬Pectobacteriumcarotovorum，其中17株為Pcb，12株為Pcc(表2)。pmrA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹又進(jìn)一步將所有的Pcc菌株分為2個亞類群(Ⅰ和Ⅱ)：亞群Ⅰ包含ITS-RFLP帶型中Group Ⅱ的4個菌株(KC-01、KC-02、KC-03和KC-06)，亞群Ⅱ包含ITS-RFLP帶型中Group Ⅱ的8株菌株(KC-05、KC-12、KC-14、KC-15、KC-16、KC-17、KC-23、KC-24)。

圖3 基于pmrA基因完整序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on the complete pmrA sequences

基于16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析中(圖4)，4株菌株的聚類結(jié)果與上述鑒定結(jié)果(特異性引物PCR、PCR-RFLP和pmrA基因序列分析)不一致，其中，3株被上述結(jié)果鑒定為Pcb的菌株(KC-09、KC-11和KC-26)被聚類至Pcc類群；1株被上述結(jié)果鑒定為Pcb的菌株(KC-10)，因擴(kuò)增出2種類型(Type 1和Type 2)的16S rDNA序列被分別聚類至Pcb和Pcc類群。

2株Dickeya菌株為外群；KC-10菌株包含2種16S rDNA序列類型，KC-10 type 1歸至Pcb類群，而KC-10 type 2歸至Pcc類群；標(biāo)記的4株菌株聚類情況與其在基于pmrA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹中聚類情況不同。Two Dickeya strains were used as the out-group；KC-10 strain had two types 16S rDNA sequences，KC-10 type 1 was belong to Pcb cluster，while KC-10 type 2 was belong to Pcc cluster；The four strains signed were placed differently from them in the pmrA sequences phylogenetic tree．

2.5 軟腐病菌致病力測定

29株P(guān)ectobacterium菌株接種離體大白菜24 h后，軟腐病斑長度經(jīng)單因素方差比較分析發(fā)現(xiàn)，不同菌株間致病力存在一定差異。除2株分別來自北京大興和房山的Pcb菌株(KC-18和KC-21)和1株來自北京昌平的Pcc菌株(KC-02)表現(xiàn)出中等致病力外，其余菌株均表現(xiàn)出高致病力；不存在弱毒或無毒菌株(表1)。

3 討論與結(jié)論

近年來，細(xì)菌性軟腐病在葉類蔬菜上普遍發(fā)生[20-22]，給葉菜產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本研究的29株病原菌株在形態(tài)學(xué)特征上符合果膠桿菌(Pectobacterium)的描述[10]。根據(jù)其生理生化特征將29株病原菌株確定為Pcc和Pcb。特異性引物PCR、ITS-RFLP和pmrA基因序列分析結(jié)果將這些菌株進(jìn)一步鑒定為17株P(guān)cb菌株和12株P(guān)cc菌株。本研究對這些菌株也進(jìn)行16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，其中4株菌株的聚類結(jié)果與上述鑒定結(jié)果(特異性引物PCR、PCR-RFLP和pmrA基因序列分析)不一致。有研究表明，16S rDNA高度保守性不能提供足夠的區(qū)分度和支持率來進(jìn)行軟腐果膠桿菌亞種水平的遺傳多樣性分析[23]，而pmrA基因是影響細(xì)菌胞外酶產(chǎn)生的一個重要單拷貝基因，存在于大部分的腸桿菌科(Enterobacteriaceae)細(xì)菌中，且其核酸序列在亞種中具有高度的保守性[24]。本研究中該基因序列分析可用于快菜軟腐病原菌亞種水平的鑒定。另外，本研究中基于該序列構(gòu)建的進(jìn)化樹將Pcc亞種菌株劃分為不同亞群，其結(jié)果與ITS-RFLP帶型分類結(jié)果一致。因此，pmrA比16S rDNA更適用于果膠桿菌亞種內(nèi)鑒定，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

與以往報(bào)道的典型Pcc菌株不同的是，本研究發(fā)現(xiàn)了9株非典型Pcc菌株，表現(xiàn)為不具備在37 ℃和7% NaCl條件下生長的能力或不能分解檸檬酸鹽或可微利用D-阿拉伯糖醇、異麥芽酮糖醇和D-麥芽糖，但該結(jié)果與其他報(bào)道中非典型Pcc菌株特征相近[17，25-26]。根據(jù)ITS-RFLP和pmrA基因序列分析結(jié)果，本研究鑒定得到的12株P(guān)cc菌株被進(jìn)一步分為了2個亞群(亞群Ⅰ和亞群Ⅱ)；而生理生化分析結(jié)果表明，亞群Ⅰ的菌株均不能利用檸檬酸鹽，而亞群Ⅱ的菌株均能利用檸檬酸鹽，由此說明2個亞群菌株間存在基因組和表型差異。此外，本研究對北京快菜軟腐病原菌株的鑒定結(jié)果與此前對北京白菜類油菜(Brassicarapasubsp.chinensis)軟腐病原菌株的報(bào)道[6]一致，均為Pcc和Pcb亞種，推測這2個亞種可能是引發(fā)北京地區(qū)白菜類蔬菜細(xì)菌性軟腐病的優(yōu)勢種群。最后，為明確北京地區(qū)快菜軟腐菌的致病力，本研究還對分離到的29株P(guān)ectobacterium菌株進(jìn)行了致病力測定，結(jié)果顯示，除3株菌株表現(xiàn)為中等致病力外，其余菌株均表現(xiàn)為強(qiáng)致病力，這與此前報(bào)道的北京地區(qū)油菜和芹菜上分離的軟腐菌株大多表現(xiàn)出高致病力的研究結(jié)果一致[6-7]。

本研究通過對快菜細(xì)菌性軟腐病菌形態(tài)學(xué)、多種生理生化及分子鑒定結(jié)果的綜合分析，明確了引起北京地區(qū)快菜軟腐病的主要致病菌為Pectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorum和Pectobacteriumcarotovorumsubsp.brasiliensis，且多數(shù)菌株具有強(qiáng)致病力。確認(rèn)了pmrA基因序列分析在軟腐果膠桿菌亞種鑒定中的準(zhǔn)確性和適用性。本研究結(jié)果對快菜軟腐病的綜合防治具有重要意義。

參考文獻(xiàn)：

[1] Davidsson P R, Kariola T, Niemi O, et al. Pathogenicity of and plant immunity to soft rot pectobacteria[J]. Front Plant Science,2013, 4:191.

[2] Nabhan S，Wydra K，Linde M，et al. The use of two complementary DNA assays，AFLP and MLSA，for epidemic and phylogenetic studies of pectolytic enterobacterial strains with focus on the heterogeneous speciesPectobacteriumcarotovorum[J]. Plant Pathology，2012，61(3)：498-508.

[3] Alvarado I C M，Michereff S J，Mariano R L R，et al. Characterization and variability of soft rot-causing bacteria in Chinese cabbage in north eastern Brazil[J]. Journal of Plant Pathology，2011，93(1)：173-181.

[4] Shim H, Myung I S, Hong S K, et al. Outbreak of soft rot disease caused byPectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorumof Chinese cabbage followed by climate change in highlands of Korea[C]. Korea:Society for plant pathology in China Annual Academic Symposium, 2011: 218-221.

[5] Waleron M，Waleron K，Lojkowska E. First report ofPectobacteriumcarotovorumsubsp.Brasiliensecausing soft rot on potato and other vegetables in Poland[J]. Plant Disease，2015，99(9)：1271.

[6] 胡娜娜，李 超，王 茜，等. 北京地區(qū)油菜軟腐病病原菌的鑒定[J]. 微生物學(xué)報(bào)，2015，55(10)：1253-1263.

[7] 田 宇，馬亞麗，何付新，等. 北京地區(qū)芹菜細(xì)菌性軟腐病菌鑒定及其致病力分析[J]. 植物病理學(xué)報(bào)，2016，46(4)：433-442.

[8] 晉知文，宋加偉，謝學(xué)文，等. 芹菜細(xì)菌性軟腐病病原的分離與鑒定[J]. 植物病理學(xué)報(bào), 2016, 46(3): 304-312.

[9] 方中達(dá). 植病研究方法[M]. 北京：農(nóng)業(yè)出版社，1979：165-211.

[10] Schaad N W. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria[M]. St. Paul: APS Press , 2001.

[11] Mukherjee A，Cui Y，Ma W，et al.hexAofErwiniacarotovorassp.carotovorastrain Ecc71 negatively regulates production of RpoS and rsmB RNA，a global regulator of extracellular proteins，plant virulence and the quorum-sensing signal，N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine lactone[J]. Environmental Microbiology，2000，2(2)：203-215.

[12] Zhu L，Xie H，Chen S，et al. Rapid isolation，identification and phylogenetic analysis ofPectobacteriumcarotovorumssp. [J]. Journal of Plant Pathology，2010，92(2)：479-483.

[13] Darrasse A，Priou S，Kotoujansky A，et al. PCR and restriction fragment length polymorphism of apelgene as a tool to identifyErwiniacarotovorain relation to potato diseases[J]. Applied and Environmental Microbiology，1994，60(5)：1437-1443.

[14] Duarte V，de Boer S H，Ward L J，et al. Characterization of atypicalErwiniacarotovorastrains causing blackleg of potato in Brazil[J]. Journal of Applied Microbiology，2004，96(3)：535-545.

[15] Toth I K，Avrova A O，Hyman L J. Rapid identification and differentiation of the soft rot erwinias by 16S-23S intergenic transcribed spacer-PCR and restriction fragment length polymorphism analyses[J]. Applied and Environmental Microbiology，2001，67(9)：4070-4076.

[16] Kettani-Halabi M，Terta M，Amdan M，et al. An easy，simple inexpensive test for the specific detection ofPectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorumbased on sequence analysis of thepmrAgene[J]. BMC Microbiology，2013，13(1)：176.

[17] Terta M，El Karkouri A，Mhand R，et al. Occurrence ofPectobacteriumcarotovorumstrains isolated from potato soft rot in Morocco[J]. Cellular and Molecular Biology，2010，56(S1)：OL1324-OL1333.

[18] Gardan L，Gouy C，Christen R，et al. Elevation of three subspecies ofPectobacteriumcarotovorumto species level：Pectobacteriumatrosepticumsp. nov.，Pectobacteriumbetavasculorumsp. nov. andPectobacteriumwasabiaesp. nov[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2003，53(Pt 2)：381-391.

[19] Perombelon M C, van der Wolf J M. Methods for the detection and quantification ofErwiniacarotovorasubsp.atrosepticaon potatoes suitable for commercial use: a laboratory manual[M]. Invergowrie, Dundee, Scotland: Scottish Crop Research Institute, 2002.

[20] Faquihi H，Terta M，Amdan M，et al. Phenotypic and genotypic diversity ofPectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorumcausing soft rot disease of potatoes in Morocco[J]. European Journal of Plant Pathology，2015，143(4)：801-811.

[21] Meng X, Chai A, Li B, et al. Emergence of bacterial soft rot in cucumber caused byPectobacteriumcarotovorumsubsp.brasiliensein China[J]. Plant Disease, 2017, 101(2): 279-287.

[22] Queiroz M F, Gama M A S, Mariano R L R, et al. First report of soft rot in kale caused byPectobacteriumcarotovorumsubsp.brasiliensisin Brazil[J]. Plant Disease, 2017，101: 1542.

[23] Staley J T. The bacterial species dilemma and the genomic-phylogenetic species concept[J]. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B，Biological Sciences，2006，361(1475)：1899-1909.

[24] W?sten M M，Groisman E A. Molecular characterization of thePmrAregulon[J]. The Journal of Biological Chemistry，1999，274(38)：27185-27190.

[25] Nabhan S，De Boer S H，Maiss E，et al. Taxonomic relatedness betweenPectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorum，Pectobacteriumcarotovorumsubsp.odoriferumandPectobacteriumcarotovorumsubsp.brasiliensesubsp. nov[J]. Journal of Applied Microbiology，2012，113(4)：904-913.

[26] Baghaee-Ravari S，Rahimian H，Shams-Bakhsh M，et al. Characterization ofPectobacteriumspecies from Iran using biochemical and molecular methods[J]. European Journal of Plant Pathology，2011，129(3)：413-425.