水稻OsAMTR310基因的克隆與在干旱脅迫下的功能分析

李嘉明，孫 健，張明輝，冷 月，孫 琦，趙宏偉，鄒德堂

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

干旱脅迫正在嚴重影響著全球的水稻產(chǎn)量和種植面積[1]，因此，揭示水稻抗逆的分子機制、克隆出與干旱脅迫相關(guān)的重要功能基因以及相應(yīng)的基因工程改良對于提高水稻抗逆性和環(huán)境適應(yīng)性、擴大水稻生產(chǎn)面積具有重要的意義[2]。轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.x)是催化氨基酸與酮酸之間氨基轉(zhuǎn)移的一類酶，參與氨基酸的分解和合成，普遍存在于動物、植物組織和微生物中。通過生物信息學(xué)及酶工程學(xué)方法對轉(zhuǎn)氨酶基因編碼的相應(yīng)產(chǎn)物及其特異底物、非自然底物進行了分析，初步驗證了其在生物代謝中的各種功能[3]。由轉(zhuǎn)氨酶催化的反應(yīng)在各種代謝途徑中起著不可或缺的作用，包括氨基酸的生物合成和分解代謝、維生素代謝、碳和氮的同化和穿梭、次生代謝、光呼吸、乙醛酸解毒和糖異生作用[4]。通常大多數(shù)氨基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)是自由可逆的；然而，存在由產(chǎn)物不穩(wěn)定性，產(chǎn)物通道化或氨基轉(zhuǎn)移酶對反應(yīng)產(chǎn)物的低親和力產(chǎn)生的單向轉(zhuǎn)氨酸的情況[5-7]。在植物體內(nèi)，轉(zhuǎn)氨酶參與植物的生長、代謝和抵抗非生物脅迫。轉(zhuǎn)氨酶Ⅲ家族是轉(zhuǎn)氨酶家族中重要的一個亞族，通過對擬南芥中的轉(zhuǎn)氨酶進行基因組分析和與其他物種的比對以及對轉(zhuǎn)氨酶已知與未知功能的基因序列進行MPSS分析，預(yù)測了未知基因的功能，并將其分為4個家族[4]?，F(xiàn)已在擬南芥體內(nèi)確定了6種轉(zhuǎn)氨酶Ⅲ家族基因AcOAT、δ-OAT、GSA1、GSA2、GABA-T、DAPA-AT，其功能也已確定，其中，δ-OAT(δ-鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶)基因的表達與提高植物滲透脅迫耐性和脯氨酸的含量有密切聯(lián)系，而將擬南芥δ-OAT基因轉(zhuǎn)入水稻體內(nèi)后對高鹽和干旱脅迫都表現(xiàn)出較強的忍耐力。GABA-T在擬南芥生長過程中不僅參與葉的生長、乙醛酸的合成，同時也響應(yīng)鹽脅迫。在水稻中，通過將水稻與擬南芥中、粳稻與秈稻中的轉(zhuǎn)氨酶Ⅲ家族基因進行了系統(tǒng)發(fā)育分析并在低溫、干旱、高鹽條件下對其進行了實時定量 PCR分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，12個轉(zhuǎn)氨酶基因在非生物脅迫下對至少一種逆境有響應(yīng)[8]。

本研究擬通過RT-PCR法克隆粳稻轉(zhuǎn)氨酶Ⅲ家族基因中的OsAMTR310基因并分析其在水稻苗期干旱脅迫下的表達模式，將克隆出的目的基因片段與超表達載體連接，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其轉(zhuǎn)入水稻體內(nèi)，培育出轉(zhuǎn)基因水稻植株，進一步分析轉(zhuǎn)基因植株在干旱條件下的表型差異和生理變化，為揭示OsAMTR310基因的功能和利用其培育抗逆水稻新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

水稻品種野生型日本晴(OryzasativaL. subsp.japonicacv. Nipponbare)與轉(zhuǎn)基因受體水稻東農(nóng)427種子由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)寒地水稻研究中心保存。TRIzol RNA 提取試劑盒(RNAisoTMPlus)、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、DNase Ⅰ、質(zhì)粒小提試劑盒和熒光定量PCR試劑盒、大腸桿菌DH5α、TaqDNA 聚合酶、DL2000 DNA Marker、克隆載體pMD18-T、限制性內(nèi)切酶購自寶生物(大連)有限公司(TaKaRa Co.Ltd. Dalian，China)；超表達載體pCAMBIA1302、根癌土壤農(nóng)桿菌株EHA105由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物技術(shù)研究中心保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 植物材料培養(yǎng) 水稻種子經(jīng)10%次氯酸鈉溶液表面消毒后，播于1/2 MS固體培養(yǎng)基上，置于光照培養(yǎng)箱(22 ℃)中培養(yǎng)。14 d后，當幼苗長出2片真葉時，將幼苗移栽于土壤中，然后轉(zhuǎn)入人工氣候室中培養(yǎng)，光照周期為光/暗16 h/8 h，溫度為28 ℃/22 ℃，相對濕度70%[9]。

1.2.2 水稻總RNA 的提取和cDNA 第一鏈的合成 用TRIzol法提取上述水稻葉片的RNA[10]，具體方法參照產(chǎn)品說明書，并用DNase Ⅰ去除RNA中可能存在的基因組DNA。再以RNA為模板，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以其為模板進行RT-PCR反應(yīng)。

1.2.3OsAMTR310基因的克隆與序列生物信息學(xué)分析 用Primer premier 5.0軟件在基因的編碼序列兩端設(shè)計引物OsAMTR310F(5′-CATGCCATGGATGATTTGCCGCAGTCTCCT-3′)和OsAMTR310R(5′-GACTAGTACCCCTCTTGGCTTTGAGCTC-3′)，在引物的5′端分別加入一個NcoⅠ酶切位點(上游)、SpeⅠ酶切位點(下游)。25 μL PCR反應(yīng)體系包括：10×PCR Buffer 2.5 μL、dNTP Mixture 2.5 μL、Primer1 0.5 μL、Primer2 0.5 μL、DNA模板1 μL、Taq0.2 μL、H2O 17.8 μL。反應(yīng)過程為：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物于4 ℃保存。根據(jù)測序結(jié)果，通過水稻基因組數(shù)據(jù)庫對測序基因序列進行比對，以驗證所測基因序列是否為目的基因。

1.2.4 超表達載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化 確定測序正確以后，將pCAMBIA1302表達載體與含目的片段的質(zhì)粒用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進行雙酶切，將目的基因片段與表達載體連接，送至華大生物公司進行測序。根據(jù)片段的測序結(jié)果，通過NCBI對測序基因進行序列比對驗證其正確性。將含有目的基因的超表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中，并通過侵染東農(nóng)427水稻愈傷組織完成遺傳轉(zhuǎn)化[11]，并篩選陽性轉(zhuǎn)基因植株。

1.2.5 PCR鑒定陽性O(shè)sAMTR310轉(zhuǎn)基因植株 當植株生長正常后，從幼嫩葉片中通過CTAB法提取DNA進行PCR鑒定。根據(jù)pCAMBIA1302載體上的抗性篩選基因序列設(shè)計PCR檢測引物hygF (5′-GTCTCCGACCTGATGCAGCTCTCGG-3′)，hygR(5′-GTCCGTCAGGACATTGTTGGAG-3′)，以上述DNA為模板、25 μL體系進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物于4 ℃保存。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.6 蛋白提取與免疫印跡分析 轉(zhuǎn)基因植株與正常對照植株生長35 d左右時，取正常生長的葉子并迅速置于液氮中保存；之后干旱處理相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植株與對照植株24 h，并取葉片置于液氮中保存。植物總蛋白提取采用生工生物工程(上海)公司的植物總蛋白提取試劑盒，提取后的蛋白在-80 ℃保存。蛋白質(zhì)免疫印跡的試驗過程：SDS-PAGE電泳后，取出膠，按照負極到正極的方向，將濾紙、凝膠、NC膜、濾紙按順序放好，放在電泳槽中，接通電源，恒壓反應(yīng)90 min；反應(yīng)結(jié)束后用麗春紅染色2～3 min，剪下所需條帶部分；用新鮮配制的5%的脫脂乳37 ℃封閉2 h；一抗4 ℃孵育過夜；將NC膜放在TBS/T緩沖液中清洗。加入二抗，37 ℃孵育1 h；將NC膜在TBS/T中洗3次，每次10 min；將NC膜放入化學(xué)發(fā)光成像儀中，調(diào)整曝光時間直到得到清晰的目的條帶[12]。

1.2.7 Real-time PCR分析轉(zhuǎn)基因水稻在干旱脅迫下的表達模式 分別取脅迫處理后的陰性對照植株和超表達植株的新鮮葉片并提取其RNA，試驗設(shè)置3次重復(fù)。根據(jù)OsAMTR310的CDS序列，用Primer premier 5.0軟件根據(jù)轉(zhuǎn)錄序列設(shè)計引物OsAMTR310qF(5′-AAGAAAATGGGTTCAAGGGGC-3′)，OsAMTR310qR(5′-TTCCAAAAGGAGTGGTAGAAGGGT-3′)，用NCBI的Blast程序在水稻基因組數(shù)據(jù)庫中驗證這2個基因的擴增特異性。以Actin1 作為內(nèi)參基因[13]。Real-time PCR 在Roche LightCycler 2.10中進行，PCR反應(yīng)程序為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，45個循環(huán)。用2-ΔΔCT法計算基因的表達量，其中ΔΔCT = (CT目的基因-CT內(nèi)參基因)處理樣品-(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)對照樣品[14]。試驗設(shè)3次重復(fù)。

1.2.8 轉(zhuǎn)基因植株的生理指標測定 測定干旱脅迫后對照植株與轉(zhuǎn)基因植株的存活率，試驗設(shè)置3次重復(fù)；并且分別測定脅迫處理前后對照植株和轉(zhuǎn)基因植株的游離脯氨酸含量。水稻葉片中的脯氨酸含量通過酸性茚三酮法測定[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsAMTR310基因的克隆與序列分析

OsAMTR310基因cDNA全長為1 873 bp，編碼區(qū)全長1 533 bp[8]。根據(jù)在Phytozome數(shù)據(jù)庫中比對出的OsAMTR310基因的CDS序列設(shè)計了一對引物OsAMTR310F和OsAMTR310R，并以水稻幼苗葉片的cDNA為模板進行PCR擴增，獲得了一條1 500 bp左右的片段(圖1)，將其與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α后將菌液送公司測序，確認其片段長度為1 533 bp，與筆者在Phytozome數(shù)據(jù)庫中比對出的OsAMTR310基因的開放閱讀框(ORF)長度一致，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAG。

M.DL2000；1.無模板無引物的陰性對照；2.有模板無引物的陰性對照；3.無模板有引物的陰性對照；4～5.OsAMTR310的PCR產(chǎn)物。

M.DL2000；1.Negative control without template and primers；2.Negative control without primers with template；3.Negative control without template with primers；4-5.PCR products ofOsAMTR310.

圖1OsAMTR310基因CDS序列PCR擴增
Fig.1PCRamplificationofCDSsequenceofOsAMTR310

2.2 OsAMTR310的蛋白質(zhì)生物信息學(xué)分析

OsAMTR310編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物是一個4-氨基丁酸酯-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶，包括510個氨基酸，分子量為56 ku，推測等電點為6.34，蛋白質(zhì)穩(wěn)定系數(shù)為49.76。在與其他水稻轉(zhuǎn)氨酶Ⅲ家族成員的序列比對后，預(yù)測OsAMTR310具有3個保守的結(jié)構(gòu)域，一個4-氨基丁酸酯-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶結(jié)構(gòu)域，一個腺苷甲硫氨酸-8-氨基-7-氧代壬酸氨基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域和一個乙酰鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶家族的共有保守結(jié)構(gòu)域。

2.3 轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定

OsAMTR310基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入到粳稻品種東農(nóng)427中，在第1輪篩選中，根據(jù)轉(zhuǎn)化株的潮霉素抗性進行篩選，總共選擇了40個潛在的轉(zhuǎn)基因植株，然后轉(zhuǎn)移到溫室土壤中。當植物達到約12 cm時，通過PCR擴增進行第2次篩選。結(jié)果表明，9個株系顯示PCR陽性(圖2)。所有檢測中，非轉(zhuǎn)基因的東農(nóng)427均為PCR陰性。對這些轉(zhuǎn)基因株系用GFP抗體和his抗體進行了蛋白質(zhì)免疫印跡分析，結(jié)果顯示，3個轉(zhuǎn)基因株系S2、 S4和 S7的OsAMTR310-GFP蛋白在轉(zhuǎn)基因水稻中高度表達(圖3)。對這3個轉(zhuǎn)基因水稻株系進行了進一步的分子鑒定，在干旱環(huán)境下調(diào)查了3個轉(zhuǎn)基因植株的表達模式。如圖4所示，OsAMTR310的表達明顯受干旱誘導(dǎo)，其在干旱條件下的相對基因表達量是正常條件下的3.0倍，而且在轉(zhuǎn)基因株系中的相對表達水平要顯著高于野生型水稻，這個結(jié)果揭示了OsAMTR310表達的特異性和對環(huán)境壓力做出的應(yīng)答。

M.DL5000；1.陰性東農(nóng)427；2～10.轉(zhuǎn)基因株系。M.DL5000；1.Negative Dongnong 427；2-10.Transgenic lines.

圖3 OsAMTR310-GFP/his融合蛋白質(zhì)的免疫印跡分析Fig.3 Immunoblot analysis of OsAMTR310-GFP/his fusion protein

2.4 轉(zhuǎn)基因植株的生理鑒定

分別取轉(zhuǎn)基因與野生型水稻幼苗在正常生長條件和干旱脅迫條件下的葉片，用比色法測定葉片中游離脯氨酸的含量(以鮮質(zhì)量計)，結(jié)果表明，在正常條件下，轉(zhuǎn)基因和野生型水稻之間的游離脯氨酸含量并不明顯，然而，經(jīng)過干旱脅迫后，轉(zhuǎn)基因水稻的脯氨酸水平是野生型水稻的1.5～2.0倍(圖5)，表明OsAMTR310調(diào)節(jié)干旱脅迫下的水稻幼苗中游離脯氨酸的積累。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖5-6同。Different letters indicate significant difference (P <0.05)，according to ANOVA-protected LSD 0.05 test. The same as Fig.5-6.

圖5 野生型水稻與轉(zhuǎn)基因水稻葉片脯氨酸含量測定Fig.5 Determination of proline content of wild type and transgenic rice

2.5 轉(zhuǎn)基因植株的表型分析

對3個轉(zhuǎn)基因株系在正常生長條件下與干旱脅迫條件下的表型與野生型水稻做了比較，并進行了初步的耐旱性試驗。野生型和OsAMTR310轉(zhuǎn)基因水稻均在28 ℃下生長21 d，并經(jīng)受干旱處理21 d，然后將它們轉(zhuǎn)移到正常的營養(yǎng)液中，觀察其生長，結(jié)果顯示，經(jīng)過干旱處理后，大部分的野生型水稻均死亡，存活率僅為38%；相比之下，大部分的OsAMTR310轉(zhuǎn)基因水稻植株呈現(xiàn)健康的形態(tài)，并在營養(yǎng)液里恢復(fù)生長，圖6顯示，3個OsAMTR310轉(zhuǎn)基因株系的存活率分別為60.9%，66.8%，72.5%，是野生型水稻的1.5～2.0倍。

圖6 干旱條件下野生型水稻與OsAMTR310轉(zhuǎn)基因水稻的存活率測定Fig.6 Survival rate of wild type and OsAMTR310 transgenic rice under normal and drought stress

3 結(jié)論與討論

OsAMTR310基因編碼的蛋白質(zhì)隸屬于乙酰鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶家族，該家族是依賴于磷酸吡哆醛(PLP)的天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶總科，其主要包括鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶、乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶、丙氨酸-乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶、二烷基甘氨酸脫羧酶、4-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶、β-丙氨酸-丙酮酸氨基轉(zhuǎn)移酶、腺苷甲硫氨酸-8-氨基-7-氧代壬酸酯氨基轉(zhuǎn)移酶和谷氨酸-1-半醛2，1-氨基變位酶。這個總科的所有酶均作用于堿性氨基酸，其衍生物涉及氨基轉(zhuǎn)移或脫羧。而OsAMTR310蛋白作用之一是作為一種腺苷甲硫氨酸-8-氨基-7-氧代壬酸酯轉(zhuǎn)氨酶(其他名稱包括7，8-二氨基脂肪酸氨基轉(zhuǎn)移酶，DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶)[16]。前人已經(jīng)通過試驗證明，這種酶是生物素生物合成途徑中的輔助因子和輔基，而轉(zhuǎn)氨酶與生物素常與植物抵抗非生物脅迫有關(guān)[17]，暗示了OsAMTR310基因編碼的產(chǎn)物可能參與了非生物脅迫抵抗。

各種各樣的分子生物學(xué)手段比如轉(zhuǎn)基因用來鑒定由各種非生物脅迫誘導(dǎo)的基因，在脅迫條件下，被誘導(dǎo)的基因可以通過產(chǎn)生應(yīng)激蛋白來保護細胞免受脅迫危害[18]。前人研究表明，轉(zhuǎn)氨酶在水稻中發(fā)揮了多重的關(guān)鍵作用，尤其是提高非生物脅迫耐性。比如，水稻谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因OsOAT作為脅迫應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子SNAC2的靶標基因，其在水稻中的表達隨著干旱和氧化脅迫而增加，表明OsOAT基因在提高植物脅迫忍耐性中起了新的作用[19]；轉(zhuǎn)氨酶基因OsAMTR1對非生物脅迫有應(yīng)答，可以提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的非生物脅迫抗性，而且可以提高轉(zhuǎn)基因植株的發(fā)芽率，根的發(fā)育和植株的鮮質(zhì)量[20-21]。研究中心在前期工作中已經(jīng)通過生物信息學(xué)分析與實時定量PCR驗證了OsAMTR310基因?qū)Ω珊得{迫有響應(yīng)，在本研究，通過RT-PCR法將OsAMTR310的編碼序列從水稻總cDNA中克隆出來，并且構(gòu)建了pCAMBIA1302-OsAMTR310超表達載體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其轉(zhuǎn)入到水稻中，進一步驗證了OsAMTR310基因的功能。首先通過PCR與抗性篩選了陽性轉(zhuǎn)基因水稻苗，并且根據(jù)蛋白質(zhì)免疫印跡法確定了OsAMTR310在轉(zhuǎn)基因水稻中正常表達。在表型鑒定試驗中，在正常條件下，OsAMTR310轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株的生長狀態(tài)沒有明顯的差別；而在干旱脅迫下，OsAMTR310轉(zhuǎn)基因植株明顯比野生型植株具有更強的耐旱能力。植物對環(huán)境脅迫的適應(yīng)通常與代謝調(diào)節(jié)有關(guān)，例如脯氨酸的積累。脯氨酸在植物調(diào)節(jié)自身滲透壓，抵抗環(huán)境脅迫的內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中起中心作用，所以，植物的脯氨酸水平是衡量其非生物脅迫耐性的重要生理指標[22]。在干旱脅迫下，OsAMTR310轉(zhuǎn)基因植株葉片中的脯氨酸含量顯著高于野生型植株，說明OsAMTR310轉(zhuǎn)基因植株具有更高的耐旱性，并且暗示了OsAMTR310參與了水稻脯氨酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與生物合成途徑。

綜上所述，通過對水稻乙酰鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶家族基因OsAMTR310的克隆和對轉(zhuǎn)基因植株的功能分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OsAMTR310提高了水稻干旱脅迫耐性，并可提高轉(zhuǎn)基因植株在干旱條件下的游離脯氨酸含量，表明OsAMTR310在水稻抗旱脅迫中發(fā)揮重要功能。

參考文獻：

[1] Yin X，Cui Y，Wang M，et al. Overexpression of a novel MYB-related transcription factor，OsMYBR1，confers improved drought tolerance and decreased ABA sensitivity in rice [J]. Biochem Biophys Res Commun，2017，490(4)：1355-1361.

[2] Li J J，Li Y，Yin Z G，et al. OsASR5 enhances drought tolerance through a stomatal closure pathway associated with ABA and H2O2signalling in rice [J]. Plant Biotechnology Journal，2017，15(2)：183-196.

[3] Hwang B Y，Cho B K，Yun H，et al. Revisit of aminotransferase in the genomic era and its application to biocatalysis [J]. Journal Of Molecular Catalysis B-Enzymatic，2005，37(1)：47-55.

[4] Liepman A H，Olsen L I. Genomic analysis of aminotransferases inArabidopsisthaliana[J]. Critical Reviews in Plant Sciences，2004，23(1)：73-89.

[5] Givan C V. Aminotransferases in higher plants [J]. The biochemistry of plants ，1980，5：329-357.

[6] Reumann S. The structural properties of plant peroxisomes and their metabolic significance[J]. Biological Chemistry，2000，381(8)：639-648.

[7] Yang Q Q，Zhang C Q，Chan M L，et al. Biofortification of rice with the essential amino acid lysine：molecular characterization，nutritional evaluation，and field performance[J]. Journal of Experimental Botany，2016，67(14)：4285-4296.

[8] Sun J，Xie D W，Zhao H W，et al. Genome-wide identification of the class Ⅲ aminotransferase gene family in rice and expression analysis under abiotic stress[J]. Genes & Genomics，2013，35(5)：597-608.

[9] Wu W X，Zheng X M，Chen D B，et al.OsCOL16，encoding a CONSTANS-like protein，represses flowering by up regulating Ghd7 expression in rice[J]. Plant Science，2017，260：60-69.

[10] Huang X Y，Deng F L，Yamaji N，et al. A heavy metal P-type ATPase OsHMA4 prevents copper accumulation in rice grain[J]. Nature Communications，2016，7：12138.

[11] Hiei Y，Ohta S，Komari T，et al. Efficient transformation of rice (OryzasativaL.) mediated byAgrobacteriumand sequence analysis of the boundaries of the T-DNA[J]. The Plant Journal ：for Cell and Molecular Biology，1994，6(2)：271-282.

[12] Tuteja N，Sahoo R K，Garg B，et al. OsSUV3 dual helicase functions in salinity stress tolerance by maintaining photosynthesis and antioxidant machinery in rice (OryzasativaL. cv. IR64) [J]. Plant Journal，2013，76(1)：115-127.

[13] Siahpoosh M R，Dehghanian E，Kamgar A. Drought tolerance evaluation of bread wheat genotypes using water use efficiency，evapotranspiration efficiency，and drought susceptibility index[J]. Crop Science，2011，51(3)：1198-1204.

[14] Livak K J，Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using Real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmethod[J]. Methods，2001，25(4)：402-408.

[15] Wang F，Tong W，Zhu H，et al. A novel Cys2/His2 zinc finger protein gene from sweetpotato，IbZFP1，is involved in salt and drought tolerance in transgenicArabidopsis[J]. Planta，2016，243(3)：783-797.

[16] Menta P K，Hale T I，Chrisien P.Evolutionary relationships among aminotransferases [J]. The FEBS Journal，1989，186(1-2)：249-253.

[17] Roosens N H C J，Thu T T，Iskandar H M，et al. Isolation of the ornithine-δ-aminotransferase cDNA and effect of salt stress on its expression inArabidopsisthaliana[J]. Plant physiology，1998，117(1)：263-271.

[18] Nakashima K，Yamaguchi-Shinozaki K，Shinozaki K. The transcriptional regulatory network in the drought response and its crosstalk in abiotic stress responses including drought，cold，and heat[J]. Frontiers in Plant Science，2014，5：170.

[19] You J，Hu H，Xiong L. An ornithine delta-aminotransferase geneOsOATconfers drought and oxidative stress tolerance in rice [J]. Plant Sci，2012，197 ：59-69.

[20] Dansana P K，Kothari K S，Vij S，et al. OsiSAP1 overexpression improves water-deficit stress tolerance in transgenic rice by affecting expression of endogenous stress-related genes[J]. Plant Cell Reports，2014，33(9)：1425-1440.

[21] Kothari K S，Dansana P K，Giri J A. Rice stress associated protein 1 (OsSAP1) interacts with aminotransferase (OsAMTR1) and Pathogenesis-Related 1a protein (OsSCP) and regulates abiotic stress responses[J]. Frontiers in Plant Science，2016，7：1057.

[22] Zhang X，Zhang B，Li M J，et al. OsMSR15 encoding a rice C2H2-type zinc finger protein confers enhanced drought tolerance in transgenicArabidopsis[J]. Journal of Plant Biology，2016，59(3)：271-281.