MSX2基因在山羊真皮毛乳頭細胞增殖中的調控作用

郝 斐，閆 瑋，郭曉東，朱 兵，劉東軍

(1.內蒙古大學 省部共建草原家畜生殖調控與繁育國家重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010021；2.烏蘭察布市農牧業(yè)科學研究院，內蒙古 烏蘭察布 012000)

阿爾巴斯絨山羊是我國優(yōu)秀的絨山羊品種之一，以其具有潔白、柔軟和纖細的羊絨而享譽全球，具有非常高的經濟價值，但是由于其產量不足，多年來限制了羊絨產業(yè)的發(fā)展。為了提升羊絨產業(yè)在我國經濟發(fā)展中的重要地位，對絨山羊進行改良，提升羊絨的產量和品質已經迫在眉睫。搞清楚羊絨的生長機制是我們面臨的首要問題。依據絨山羊皮膚毛囊的發(fā)生時間和結構特征不同，將其劃分為初級毛囊和次級毛囊2種。其中，初級毛囊發(fā)育形成羊毛，次級毛囊發(fā)育形成羊絨[1-2]。毛囊是控制毛發(fā)生長的復雜皮膚輔助器官，它由表皮和真皮2個部分組織組成[3]，其結構包括毛球、毛干、內根鞘、外根鞘和結締組織鞘5個部分[4]。毛球由真皮毛乳頭和毛發(fā)基質組成。真皮毛乳頭細胞位于毛囊底部，它們分泌各種細胞因子以調節(jié)鄰近組織，從而調節(jié)毛發(fā)的生長和更新[5]。因此，真皮毛乳頭細胞被大家認為是毛囊的“指揮中心”[6]。所以，真皮毛乳頭細胞可以用作研究毛囊生長和周期性變化的細胞模型。

MSX基因屬于Hox基因家族成員。在脊椎動物中MSX分為3種亞形，分別為MSX1、MSX2和MSX3。它們在脊椎動物的皮膚、心臟、乳腺等多個器官的形成過程中發(fā)揮著重要作用[7-8]。有研究表明，MSX2基因調控了皮膚中上皮和間充質之間的信號轉導，影響了毛囊的形態(tài)發(fā)生和周期性變化。過表達MSX2轉基因小鼠，表皮因過度增殖而變厚，毛發(fā)短且髓質干癟。而MSX2基因敲除小鼠的毛母質細胞減少，毛干形成異形，并且在脫毛后再進入生長期會發(fā)生延遲。因此，MSX2可以獨立地調節(jié)毛囊進入生長期[9]。也有研究者發(fā)現，MSX2在毛囊的基質細胞中表達，當MSX2缺乏時，小鼠會產生彎曲毛發(fā)[10]。由此認為，MSX2基因對毛發(fā)生長是必需的，它對毛囊的生長和周期性變化具有調控作用。本研究旨在探究MSX2基因對絨山羊真皮毛乳頭細胞增殖能力的調控。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

山羊皮膚樣本由內蒙古億維白絨山羊有限責任公司提供，pSIREN-RetroQ-ZsGreen質粒和pDsRed2質粒在內蒙古大學省部共建草原家畜生殖調控與繁育國家重點實驗室保存。DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、PBS、0.25%胰酶(Trypsin)購自Hyclone；冷凍保護劑(DMSO)購自日本和光；脂質體Lipofectamine 2000購自Invitrigen；質粒大提試劑盒EndoFree?Plasmid Maxi Kit購自QIAGEN，限制性內切酶、T4連接酶、反轉錄試劑盒PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser、實時定量PCR試劑SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ購自TaKaRa。α-SMA和CD133抗體購自Boster Biotech，MSX2、LEF-1、cyclin D1、β-actin抗體均購自abcam。

1.2 試驗方法

1.2.1 絨山羊真皮毛乳頭細胞的分離和培養(yǎng) 2017年9月于毛囊生長期，在內蒙古億維白絨山羊有限責任公司的種羊場中，選擇2～3歲的雌性絨山羊作為皮膚樣本收集的對象。剃毛消毒后，切取腹部皮膚組織(1～2 cm2)，通過機械法分離單根毛囊，然后用濃度為2 g/L的Ⅱ型膠原酶處理上述游離的毛囊約1 h，再通過機械分離法分離出真皮毛乳頭細胞。最后用含有10% 新生牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液洗滌2～3遍，接種于培養(yǎng)皿中，置于37 ℃，5% CO2，100%飽和濕度的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，待細胞生長匯合度達到80%時，凍存一部分細胞，將其他細胞傳代培養(yǎng)[11]。

1.2.2 免疫細胞化學 免疫細胞化學試驗的目的主要是對分離得到的山羊真皮毛乳頭細胞進行鑒定。將真皮毛乳頭細胞培養(yǎng)在載玻片上。待細胞培養(yǎng)生長匯合度達90%時，開始進行試驗。首先用0.01 mol/L PBS將上述待處理的細胞清洗3遍，洗去死細胞和培養(yǎng)液，然后用4%的多聚甲醛于4 ℃孵育30 min進行固定處理。固定好的細胞再用0.01 mol/L PBS清洗3遍，然后用0.5% Triton X-100進行通透處理10 min，再用0.01 mol/L PBS清洗3遍。而后用含有5% BSA的PBS 4 ℃過夜處理上述通透好的細胞，目的是為了避免抗體的非特異性結合。再用α-SMA(1∶100 稀釋；Boster Biotech)和CD133(1∶100 稀釋；Boster Biotech)抗體4 ℃過夜處理上述細胞。再用0.01 mol/L PBS清洗3遍，再用帶有綠色熒光的二抗37 ℃ 60 min處理上述細胞。然后用1 mg/L的DAPI染細胞核5 min。最后將上述處理完畢的細胞置于載玻片上封片，通過共聚焦顯微鏡進行細胞熒光拍攝。

1.2.3 質粒的構建和轉染 將擴增完整的MSX2基因CDS序列通過分子生物學技術連入pDsRed2骨架質粒中，完成MSX2的過表達載體。同時也設計并完成了骨架載體為pSIREN-RetroQ-ZsGreen的干擾載體的構建，干擾片段為5′-GCGGAAACACAAGACCAAT-3′。將上述構建好的載體經過測序確認正確后通過Lipofectamine 2000對真皮毛乳頭細胞進行轉染試驗。細胞轉染48 h后觀察熒光效果，同時收集上述轉染細胞用于下游的試驗。

1.2.4 真皮毛乳頭細胞生長曲線的繪制 取上述生長良好的細胞，經胰酶消化后，用新鮮培養(yǎng)基制成細胞懸液，根據細胞計數結果，按每孔5×104個/mL的細胞密度傳代培養(yǎng)。之后每間隔24 h后進行細胞計數一次，每次計數3孔細胞，計算平均值，連續(xù)計數7 d。最終根據細胞計數結果繪制生長曲線。

1.2.5 Real-time PCR 將上述各組試驗細胞用RNAiso Plus(TaKaRa Biotechnology，Dalian，China)試劑提取總RNA，然后用gDNA Eraser處理提取總RNA，目的是為了去除基因組DNA對之后試驗的干擾，然后取等量的上述各組細胞總RNA進行反轉錄試驗，制備各樣本的cDNA。Real-time PCR試驗中選擇GAPDH基因為內參基因，用于修正試驗數據?；騇SX2、LEF-1、cyclinD1、GAPDH的引物設計見表1。Real-time PCR 試驗以SYBR Premix ExTaq酶 (TaKaRa，Dalian，China)，通過iQ5 系統(tǒng) (Bio-Rad，Hercules，CA，USA)來完成。通過用2-ΔΔCt方法來比較各基因的Ct值，從而完成對上述樣本中各基因的相對表達量分析。

表1 Real-time PCR反應各基因引物Tab.1 Primers for Real-time PCR

1.2.6 Western Blot 提取上述各試驗細胞的總蛋白質，選取等量的蛋白進行試驗。首先用MSX2(1∶500 稀釋；abcam)、LEF-1(1∶500稀釋；abcam)、cyclin D1(1∶500稀釋；abcam)、β-actin(1∶500稀釋；abcam)抗體對各樣本的蛋白質膜4%孵育過夜處理，然后用二抗(1∶1 000稀釋；abcam)處理。

1.3 數據分析

數據通過Graphpad Prism 6軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 真皮毛乳頭細胞的體外培養(yǎng)和鑒定

本研究這2種細胞在體外培養(yǎng)中呈長梭形貼壁生長。培養(yǎng)5～7 d，這2種細胞會出現凝集生長現象。通過對細胞進行α-SMA 和 CD133表面標記的檢測，發(fā)現均為陽性。由此說明，分離得到的細胞即為山羊的毛乳頭細胞(圖1)。

圖1 山羊真皮毛乳頭細胞的鑒定Fig.1 Identification of Cashmere goat DPCs

2.2 真皮毛乳頭細胞的過表達載體和干擾載體轉染

分別對初級毛乳頭細胞和次級毛乳頭細胞進行MSX2過表達載體和干擾載體的轉染。通過熒光的表達情況監(jiān)測轉染效率(圖2)。通過Real-time PCR完成對各樣本中MSX2基因和其他各相關基因的mRNA表達檢測，用2-ΔΔCt方法比較各基因的Ct值，根據比較結果從而完成對各個試驗組中各基因的相對表達量的分析。在結果分析中以未轉染任何質粒的細胞作為試驗對照組，在初級毛乳頭細胞MSX2表達檢測中發(fā)現，過表達試驗組的MSX2表達量是對照的11.85倍，干擾試驗組MSX2表達量是對照的0.31倍。同時，在次級毛乳頭細胞MSX2表達檢測中發(fā)現，過表達試驗組的MSX2表達量是對照的10.59倍，在干擾試驗組中MSX2表達量是對照的0.45倍(圖3)。本研究結果表明，在真皮毛乳頭細胞中，MSX2基因的過表達和干擾細胞系已被成功建立。

2.3 MSX2在真皮乳頭細胞增殖中激活了LEF-1和 cyclin D1基因的表達

A．真皮毛乳頭細胞；B.轉染MSX2過表達載體的真皮毛乳頭細胞；C.轉染MSX2干擾載體的真皮毛乳頭細胞。A.Dermal papilla cells；B.DPCs transfected with the MSX2-overexpressing vector；C.DPCs transfected with the MSX2-interference vector.

圖中不同小寫字母表示不同實驗組間基因表達差異顯著水平(P<0.05)。Different letters represent significant difference in gene expression(P<0.05).

通過Real-time PCR檢測了MSX2、LEF-1和cyclinD1基因的表達情況，研究表明，當MSX2過表達時，LEF-1和cyclinD1的表達量也隨之增加。在MSX2干擾試驗組中，LEF-1和cyclinD1的表達量也隨之減少，并且也發(fā)現無論是在初級毛乳頭細胞還是次級毛乳頭細胞中都具有同樣的表達趨勢(圖3)。同時在Western Blot試驗中得到的結果與Real-time PCR檢測的結果一致(圖4)。LEF-1蛋白和cyclin D1蛋白的表達量隨MSX2蛋白的表達量的增加而增加，隨 MSX2蛋白表達量的減少而減少，這樣進一步印證了Real-time PCR的試驗結果。

2.4 MSX2對真皮毛乳頭細胞增殖的影響

1.真皮毛乳頭細胞；2.轉染MSX2干擾載體的真皮毛乳頭細胞；3.轉染MSX2過表達載體的真皮毛乳頭細胞。1．Dermal papilla cells；2.DPCs transfected with the MSX2-interference vector；3.DPCs transfected with the MSX2-overexpressing vector.

通過各細胞株的生長曲線可以發(fā)現，在培養(yǎng)3 d后各組細胞的生長曲線表現差異，MSX2基因過表達試驗組和干擾試驗組分居對照組兩側。隨著MSX2基因表達量的增加，細胞的增殖速度有所增加，而MSX2基因干擾試驗組中細胞的生長速度慢于對照試驗組。由此說明，MSX2基因的過表達促進毛乳頭細胞增殖能力提高，而MSX2基因的下調使得毛乳頭細胞增殖能力下降(圖5)。

圖5 真皮毛乳頭細胞的生長曲線Fig.5 The growth curve of dermal papilla cells

3 討論與結論

毛囊是皮膚組織中復雜的亞器官結構，它經過生長期、退行期和休止期周期性生長[12]。毛囊發(fā)生時位于其基板處的間充質細胞凝聚，緊緊包裹基底細胞形成了真皮毛乳頭細胞。真皮毛乳頭細胞與其周圍細胞相互作用形成毛球。因此，真皮毛乳頭細胞被視為毛囊的生長調節(jié)中心[13]。所以，本研究選擇真皮毛乳頭細胞作為細胞模型來探究影響毛囊生長發(fā)育過程中相關信號分子的調節(jié)作用。

本研究的目的基因MSX2是參與毛囊發(fā)育和毛干分化過程中重要的信號因子之一。MSX2基因在動物胚胎發(fā)育過程中參與并維持了各組織的生長發(fā)育，它屬于同源異形盒基因家族的成員之一[14-15]。有研究表明，當MSX2基因的表達異常時，會使得動物皮膚毛囊生長發(fā)育異常[16]。有研究發(fā)現，MSX2敲除小鼠脫發(fā)不是由于毛干的斷裂，而是由于整個毛球的異常。毛球的異?？赡苁敲轭^或毛母質發(fā)生了異常，因為在毛囊的完整結構中，毛球部分包括真皮毛乳頭細胞和毛母質，其中真皮毛乳頭誘導毛母質增殖分化最終形成毛干。還有研究證明，MSX2的缺失將導致構成毛干的三層細胞的缺失，推測MSX2能夠調控毛母質細胞的分化，因為MSX2在毛母質擴增遷移成為前皮質細胞和隨后分化成毛發(fā)的區(qū)域中表達。MSX2不僅參與調節(jié)毛母質細胞和前皮質細胞之間的分化，還調控毛發(fā)周期的不同階段之間的轉換，影響了毛囊的生長發(fā)育過程[17]。因此，本研究就是討論MSX2對真皮毛乳頭細胞增殖的調控作用。

本試驗結果表明，MSX2基因參與真皮毛乳頭細胞的增殖調控。在真皮毛乳頭細胞中，隨著MSX2表達量的增加，細胞的增殖能力有所增加；相反，當MSX2表達量減少，細胞的增殖能力有所下降。這就有力地說明MSX2基因在毛乳頭細胞的增殖過程中發(fā)揮著一定作用。毛囊的形態(tài)發(fā)生和周期性變化受到多種信號通路調節(jié)，包括：Wnt、Shh、Notch、BMP等[18]。在這些信號通路中，Wnt信號通路與毛囊生長和發(fā)育以及細胞周期維持密切相關，所以本研究也重點檢測了Wnt信號通路中關鍵的幾個信號分子的表達變化情況[19]。LEF-1是Wnt信號通路中關鍵的細胞調節(jié)因子，它們在毛囊的生長發(fā)育和周期性變化中作用顯著，任何表達異常，都會使得毛囊生長發(fā)生變化。研究表明，MSX2的過表達可導致經典Wnt信號通路的活化，進而促進上皮間質轉化。還有研究發(fā)現，MSX2的過表達會導致DKK1的表達減少，從而促進Wnt信號通路的轉導。研究表明，MSX2可以激活Wnt信號通路，被激活的Wnt信號通路使得細胞內β-catenin積累并轉移進入了細胞核中，LEF-1作為轉錄因子與β-catenin結合，完成轉錄功能，對下游靶基因的轉錄進行調控[20-21]。cyclinD1是Wnt信號通路中的一個靶基因，它是一個重要的細胞周期蛋白，通過介導CDK4和CDK6調節(jié)細胞從G1期向S期的增殖[22]。通過比較發(fā)現，隨著MSX2基因表達量的增加，LEF-1、cyclinD1基因的表達量也會同步增加，最終促進了真皮毛乳頭細胞的增殖。這就表明在真皮毛乳頭細胞的增殖過程中，MSX2基因的表達變化引發(fā)了Wnt信號通路中LEF-1的表達變化，進而對cyclinD1基因的表達產生了影響，最終調節(jié)了真皮毛乳頭細胞的增殖。

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