ZmLTP3基因對玉米的遺傳轉化及耐鹽性鑒定

李云富，江 敏，寧慧宇，張丙林，鄒華文，吳忠義

(1.長江大學 農(nóng)學院，湖北 荊州 434025；2.北京市農(nóng)林科學院 北京農(nóng)業(yè)生物技術研究中心，農(nóng)業(yè)基因資源與生物技術北京市重點實驗室，北京 100097)

植物轉脂蛋白(Lipid transfer proteins，LTPs)是一類小分子量的堿性蛋白，因其能與脂類結合，并在膜之間進行脂類的轉運而被命名。因其對各種脂類(包括磷脂、脂肪酸和輔酶A等)都具有較高的親和力，又被稱為非專一性轉脂蛋白(non-specific lipid transfer proteins，nsLTPs)[1-3]。它們在結構上的典型特征是分子內都含有一個由8個半胱氨酸組成的保守基序(C-Xn-C-Xn-CC-Xn-CXC-Xn-C-Xn-C)(通常被稱為8CM)，這8個半胱氨酸形成4對二硫鍵，所以轉脂蛋白分子具有較高的耐高溫、耐變性等特性[4]。核磁共振、紅外和Raman光譜分析表明，LTPs蛋白分子主要由4個或5個α-螺旋組成，分子內有一疏水空穴，可結合并容納脂質分子[4-5]。根據(jù)分子量的大小，植物LTPs成員最初被分為2種類型：Ⅰ型和Ⅱ型。其中，Ⅰ型LTPs含有大約90個氨基酸，而Ⅱ型LTPs含有大約70個氨基酸；這種類型的LTPs成員之間在序列相似性(大約30%)及轉脂效率方面都有很大差異[6]。隨后發(fā)現(xiàn)，苔蘚、地錢等低等植物中的LTPs不能歸屬以上2種傳統(tǒng)的分類類型。因此，Edstam等[2]根據(jù)半胱氨酸之間的距離、保守內含子的位置以及翻譯后糖基磷脂酰肌醇錨(GPI-anchor)的添加與否，把LTPs重新劃分為1、2、C、D、E、F、G、H、J和K型。

由于具有膜間轉移脂分子的功能，植物LTPs最初被認為參與生物膜系統(tǒng)的生物合成[7]，然而N-端信號肽的發(fā)現(xiàn)和胞外定位，使人們開始重新認識LTPs的功能?，F(xiàn)有研究表明，LTPs涉及植物多種生理過程，包括參與蠟質的合成和運輸、生殖器官的發(fā)育以及提高植物抗病性、促進細胞壁的伸長、調節(jié)果膠降解活性等[6]；其中，研究較多的是其在蠟質的合成和運輸、生殖器官的發(fā)育以及在提高植物抗病性當中的作用。相對于生物抗性而言，人們對LTPs在非生物抗性中作用的研究相對偏少，并且多數(shù)是間接證據(jù)。例如Cameron等[8]研究發(fā)現(xiàn)，LTPs可以在特定組織的表面聚集成較高的濃度，并以此來適應外界環(huán)境脅迫；Jiang等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在過量表達一個鹽誘導轉錄因子-WRKY25的擬南芥中，有3個LTPs家族成員的表達量明顯上升，表明LTPs參與了擬南芥的抗鹽信號途徑；Wang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，LTPs基因的表達可以被極端溫度、滲透脅迫以及干旱等環(huán)境脅迫所誘導；Yang等[11]發(fā)現(xiàn)，菜豆根尖中的1個LTP基因表達可以被滲透脅迫(PEG處理)強烈誘導。

前期研究從玉米中克隆了1個LTP基因家族成員，并命名為ZmLTP3(GenBank Accession No. JX435819)。經(jīng)RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，ZmLTP3基因的表達可以被多種非生物脅迫因子(尤其是高鹽)所誘導[12]。在本研究中，構建Ubiquitin啟動子驅動的表達載體，利用花粉管通道法轉化玉米，以期獲得其響應非生物逆境脅迫的直接證據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

植物材料：玉米自交系京2416，由北京農(nóng)業(yè)生物技術研究中心玉米課題組保存。

菌株：大腸桿菌(Trans1-T1 Phage Resistant)；植物表達載體：改造后的pGreen0229由北京農(nóng)業(yè)生物技術研究中心玉米課題組保存。

試劑：限制性內切酶、rTaq酶和Marker購自TaKaRa公司；KOD酶購自東洋紡公司；PCR回收試劑盒購自Premaga公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純，購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1植物表達載體的構建 玉米ZmLTP3基因的cDNA片段經(jīng)PCR擴增并測序驗證正確后，通過MluⅠ/NotⅠ克隆位點構建到改造后的植物表達載體pGreen0229[13](圖1)。

圖1 ZmLTP3基因表達載體的構建Fig.1 Construction of the ZmLTP3 expression vector

1.2.2 玉米的基因轉化 參考李杰等[13]方法提取質粒、混合穿膜肽Tat 2，并通過花粉管通道法轉化玉米。

1.2.3 轉基因株系的鑒定

1.2.3.1 轉化植株的篩選 收取轉化后的玉米種子，種植于試驗田中，將收獲的種子種植于田間，在玉米幼苗長至三葉期時，噴灑濃度為200 mg/L的草甘膦，以篩選生長正常的植株。

1.2.3.2 轉化植株的PCR檢測 四葉一心期時，選取草甘膦抗性較強的植株，用CTAB法提取其幼嫩葉片的總DNA，進行PCR檢測。用于PCR檢測的片段起點位于EPSP基因上游199 bp的啟動子序列處，終點位于EPSP基因的第1 000 bp處，長度為1 199 bp。引物如下：

上游引物：5′-TGTGCAGAACCCATCTCTTATC-3′；

下游引物：5′-CGACAGCGAGAATCGGATATT-3′。

PCR反應體系：2.5 μL 10×Buffer，2 μL dNTP，1 μL玉米基因組DNA，上下游引物各1 μL，0.5 μLrTaq酶，17 μL ddH2O。

PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；98 ℃變性10 s，65 ℃退火30 s，72 ℃反應1.5 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸7min。

1.2.3.3 轉化植株的免疫檢測 參考QualiPlateTMKit for LibertyLink?PAT/EPSP說明書直接檢測EPSP基因的表達。

1.2.4 轉基因玉米的耐鹽性鑒定 將鑒定的轉基因陽性株系加代，并對每一代進行PCR及EPSP檢測驗證，以保證獲得轉ZmLTP3基因的純合體株系。將京2416自交系(CK)及轉基因T3純合體株系(OE)種子種植于基質中，基質成分為花卉土和蛭石等體積混合。將萌發(fā)的玉米放置于日長/夜長為12 h/12 h，白天、夜間溫度分別為27，16 ℃，相對濕度為60%～70%的環(huán)境中。待玉米長至三葉一心期時開始，選取生長一致的幼苗進行鹽脅迫處理，并進行相關形態(tài)、生理指標的測定。鹽脅迫處理方法為：用250 mmol/L的NaCl溶液澆灌玉米幼苗至水分飽和狀態(tài)，之后隨時用250 mmol/L的NaCl溶液補充，保證基質的濕潤狀態(tài)。分別于鹽處理的前1(0 d)，7，14 d測量各種生理指標；于鹽處理14 d后測量各種形態(tài)指標；于鹽處理7 d拍照。玉米相關形態(tài)指標、葉綠素及MDA含量、相對外滲電導率等測定方法參照張憲政[14]主編的《作物生理研究法》進行，SOD、POD及CAT活性測定參考Kumar等[15]的方法。試驗共設置3個重復，每次分別處理約50株各供試材料作為1次重復。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007、SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和方差分析。

2 結果與分析

2.1 載體構建及遺傳轉化

北京農(nóng)業(yè)生物技術研究中心玉米實驗室之前改造后的植物表達載體中含有MluⅠ和NotⅠ多克隆位點，而ZmLTP3序列中無這2個酶切位點，故選擇MluⅠ/NotⅠ作為本試驗的連接位點。經(jīng)常規(guī)的酶切、連接及轉化后提取質粒，用MluⅠ/NotⅠ酶切驗證，結果如圖2所示。電泳后在相應位置檢測到載體和目的片段，表明ZmLTP3序列已被成功連接到載體中。

載體驗證正確后，用李杰等[13]方法提取質粒、混合穿膜肽Tat 2，選擇100株左右長勢良好的玉米自交系作為受體，用花粉管通道法進行轉化[13]。待成熟后，將轉化株單獨收獲曬干脫粒，收獲的種子1萬粒左右，用于以后的除草劑篩選驗證。

2.2 轉基因玉米抗除草劑篩選

噴施草甘膦14 d后，大部分玉米植株葉片枯黃，表現(xiàn)出藥害癥狀，并且不能恢復，最后枯萎死亡；只有極少部分植株沒有表現(xiàn)藥害癥狀，葉片依舊保持綠色，健康生長，表現(xiàn)出明顯的除草劑抗性(圖3)。推測19株正常生長的植株很可能是轉基因陽性株系，被用作下一步的分子鑒定。

M.DL2000 Marker；P.重組質粒。M.DL2000 Marker；P.Recombined plasmid control.

圖3 轉基因玉米植株除草劑抗性鑒定Fig.3 Identification of herbicide resistance in transgenic maize

2.3 轉基因玉米的PCR檢測

對19株草甘膦抗性幼苗分別提取其幼葉基因組DNA，用于PCR檢測，擴增結果如圖4所示，以ddH2O及非轉基因的自交系陰性對照均未擴增出陽性條帶，19個草甘膦抗性株系中只有2、3、4、6、7、8、10、15、18、19這10個株系可擴增出目標片段。

2.4 轉基因玉米株系免疫分析

對PCR鑒定呈陽性的株系進一步做免疫鑒定，結果如圖5所示。除CK組外，2、3、6、7、8、10、15、18、19這9個轉基因株系均有明顯的檢測條帶，說明EPSP基因已經(jīng)在轉基因玉米株系中成功表達，進而證明ZmLTP3基因已經(jīng)被成功轉到玉米株系中。

2.5 轉基因玉米株系的耐鹽性鑒定

2.5.1 鹽脅迫對玉米植株生長的影響 在轉基因陽性株系中分別選取株系6、10和18做下一步的耐鹽性鑒定，分別記作OE6、OE10和OE18。圖6為高鹽處理7 d后的株系，可以看出，未轉基因的對照植株生長瘦弱、葉片萎蔫變黃嚴重，而3個轉基因株系生長狀況相對較好，株高、莖基寬、葉面積等指標明顯優(yōu)于對照。

M. DL5000 Marker；H.ddH2O；N.非轉基因自交系2416植株；P.質粒對照；1～19.草甘膦抗性株系。圖5同。M.DL5000 Marker；H.Water control；N.Non-transgenic maize 2416；P.Plasmid control；1-19.Herbicide resistance lines.The same as Fig.5.

圖5 轉基因株系EPSPS檢測Fig.5 EPSPS detection of the transgenic maize lines

圖6 鹽脅迫對轉基因株系生長的影響Fig.6 Effects of drought stress on growth of transgenic plants

進一步的形態(tài)學指標測量結果如表1所示，在鹽脅迫處理的14 d后，所有轉基因株系的株高和根長都極顯著高于對照；而莖基寬、鮮質量及干質量則顯著高于對照。結果表明，在高鹽脅迫條件下，轉基因株系的生長狀況顯著優(yōu)于對照。

2.5.2 鹽脅迫對玉米葉片葉綠素含量的影響 光合色素是葉片光合作用的基礎，光合色素含量的高低在一定程度上決定了光合能力的強弱。由表2可知，正常生長條件下，轉基因株系葉綠素a、b含量(以鮮質量計)與對照無明顯差異，隨著鹽脅迫處理時間的延長，所有試驗株系葉片中葉綠素含量都明顯下降。鹽脅迫處理7 d后轉基因株系葉綠素含量顯著高于對照；鹽脅迫處理14 d后轉基因株系葉綠素含量則極顯著高于對照；轉基因株系間葉綠素含量差異不顯著，說明在鹽脅迫條件下，轉基因株系能夠維持較高葉綠素水平，進而維持較高的光合能力。

表1 鹽脅迫下CK與轉基因株系部分形態(tài)學指標測定Tab.1 Partial morphological analysis of transgenic and CK plants under salt stress

注：表中同列不同小寫字母表示P<0.05水平下差異顯著；不同大寫字母表示P<0.01水平下差異極顯著。表2-4同。

Note：Values followed by different lowercase and capital letters within each column indicated significant differences at level ofP<0.05 andP<0.01，respectively. The same as Tab.2-4.

表2 鹽脅迫下CK與轉基因株系葉片葉綠素含量的測定Tab.2 Chlorophyll content analysis in leaves of transgenic and CK plants under salt stress mg/g

2.5.3 鹽脅迫對玉米植株體內保護酶活性的影響 逆境經(jīng)常導致植物體內活性氧的大量產(chǎn)生，而SOD、POD和CAT是消除活性氧傷害的重要保護膜系統(tǒng)。由表3可知，當植株受到鹽脅迫時，對照與轉基因株系葉片中的SOD、POD、CAT均呈現(xiàn)上升的趨勢，在處理14 d后轉基因株系葉片中保護酶活性極顯著高于對照，各轉基因株系之間無顯著差異。結果表明，過量表達ZmLTP3基因可以提高高鹽條件下植株體內SOD、POD、CAT等保護酶的活性，從而提高植株耐鹽性。

表3 鹽脅迫下CK與轉基因株系葉片保護酶活性的測定Tab.3 Protective enzyme activity analysis in leaves of CK and transgenic plants under salt stress U/mg

2.5.4 鹽脅迫對玉米植株體內MDA含量和相對外滲電導率的影響 MDA和相對電導率都是衡量細胞膜受傷害程度大小的指標。由表4可知，對照與轉基因株系葉片內的MDA含量和相對外滲電導率隨著鹽脅迫時間的延長而增加；鹽脅迫處理7 d后轉基因株系的MDA含量及相對外滲電導率顯著低于對照；鹽脅迫處理14 d后，轉基因株系的MDA含量及相對外滲電導率則極顯著低于對照。試驗結果表明，過量表達ZmLTP3基因可以在一定程度上維持鹽脅迫條件下膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

表4 鹽脅迫下CK與轉基因株系葉片MDA和相對外滲電導率的測定Tab.4 MDA content and relative electric conductivity analysis of transgenic and CK plants under salt stress

3 結論與討論

鹽脅迫能顯著影響植物的生長和發(fā)育，在鹽脅迫的早期階段植物的葉片及莖生長都被明顯抑制。葉片和莖的緩慢生長有利于保持有限的碳水化合物含量，從而維持植物體基本的代謝[16]。本研究分別比較了在正常及鹽脅迫條件下轉基因株系及對照的株高、莖基寬、根長、植株鮮質量及干質量等形態(tài)學指標。結果表明，在正常條件下轉基因株系和對照的上述指標沒有明顯差異，但是在鹽脅迫條件下，轉基因株系的莖基寬、鮮質量及干質量則顯著高于對照，而株高及根長則極顯著高于對照，說明轉基因株系在鹽脅迫條件下可以維持較好的生長狀態(tài)。在鹽脅迫條件下轉基因株系的葉綠素含量也顯著或者極顯著高于對照株系，說明轉基因植株在鹽脅迫條件下可以維持較高的葉綠素水平，這可能是其具有較高生物量及較好生長狀態(tài)的重要原因之一。

轉脂蛋白主要位于植物地上部器官的表皮組織，以利于把脂質轉移到植物體表面[17]。研究表明，在鹽脅迫條件下植物的細胞壁及細胞膜的成分均發(fā)生改變[18]。轉脂蛋白可能參與修復逆境導致的細胞膜、細胞壁等細胞成分的破壞，從而維持細胞結構的穩(wěn)定性[19]。MDA含量和外滲電導率是衡量細胞膜系統(tǒng)受傷害程度的重要指標。在本研究中，鹽脅迫條件下轉基因株系體內的MDA含量和外滲電導率均顯著或者極顯著低于對照植株，與前人研究結果相一致。同時，相對于對照株系，鹽脅迫條件下轉基因株系體內的3種重要保護膜的活性也一直維持在較高水平，這說明過量表達ZmLTP3基因可以顯著減少鹽脅迫條件下的活性氧傷害，提高植株的耐鹽性，但其確切的作用機制還有待進一步研究。

參考文獻：

[1] Ng T B，Cheung R C，Wong J H，et al. Lipid-transfer proteins[J]. Biopolymers，2012，98(4)：268-279.

[2] Edstam M M，Viitanen L，Salminen T A. Evolutionary history of the Non-Specific lipid transfer proteins[J]. Molecular Plant，2011，4(6)：947-964.

[3] Smith L J，Roby Y，Allison J R，et al. Molecular dynamics simulations of barley and maize lipid transfer proteins show different ligand binding preferences in agreement with experimental data[J]. Biochemistry，2013，52(30)：5029-5038.

[4] Edstam M M，Laurila M，Hoglund A，et al. Characterization of the GPI-anchored lipid transfer proteins in the mossPhyscomitrellapatens[J]. Plant Physiology and Biochemistry，2014，75：55-69.

[5] Salminen T A，Blomqvist K，Edqvist J. Lipid transfer proteins：classification，nomenclature，structure，and function[J]. Planta，2016，244(5)：971-997.

[6] Yeats T H，Rose J K. The biochemistry and biology of extracellular plant lipid-transfer proteins(LTPs)[J]. Protein Science，2008，17(2)：191-198.

[7] Deeken R，Saupe S，Klinkenberg J，et al. The nonspecific lipid transfer protein AtLtpI-4 is involved in suberin formation ofArabidopsisthalianacrown galls[J]. Plant Physiology，2016，172(3)：1911-1927.

[8] Cameron K D，Teece M A，Smart L B. Increased accumulation of cuticular wax and expression of lipid transfer protein in response to periodic drying events in leaves of tree tobacco[J]. Plant Physiology，2006，140(1)：176-183.

[9] Jiang Y，Deyholos M K. Functional characterization ofArabidopsisNaCl-inducible WRKY25 and WRKY33 transcription factors in abiotic stresses[J]. Plant Molecular Biology，2009，69(1/2)：91-105.

[10] Wang N J，Lee C C，Cheng C S，et al. Construction and analysis of a plant non-specific lipid transfer protein database(nsLTPDB)[J]. BMC Genomics，2012，13(S1)：S9.

[11] Yang Z B，Eticha D，Rotter B，et al. Physiological and molecular analysis of polyethylene glycol-induced reduction of aluminium accumulation in the root tips of common bean(Phaseolusvulgaris)[J]. New Phytologist，2011，192(1)：99-113.

[12] 孫小艷，朱 泳，趙明敏，等. 玉米轉脂蛋白基因ZmLTP3的克隆及表達特性分析[J]. 玉米科學，2014，22(1)：62-66.

[13] 李 杰，郭欣慰，張中保，等. 將擬南芥ATNCED3基因導入玉米自交系的研究[J]. 作物雜志，2014(1)：58-62.

[14] 張憲政. 作物生理研究法[M]. 北京：農(nóng)業(yè)出版社，1992.

[15] Kumar P，Tewari R K，Sharma P N. Modulation of copper toxicity-induced oxidative damage by excess supply of Iron in maize plants[J]. Plant Cell Reports，2008，27(2)：399-409.

[16] Zhou Y，Tang N，Huang L，et al. Effects of salt stress on plant growth，antioxidant capacity，glandular trichome density，and volatile exudates of schizonepeta tenuifolia Briq[J]. International Journal of Molecular Sciences，2018，19(1)：252.

[17] Jacq A，Pernot C，Martinez Y，et al. TheArabidopsislipid transfer protein 2(AtLTP2)is involved in Cuticle-Cell wall interface integrity and in etiolated hypocotyl permeability[J]. Frontiers in Plant Science，2017，8：263.

[18] Chalbi N，Martínez-Ballesta M C，Youssef N B，et al. Intrinsic stability ofBrassicaceaeplasmamembrane in relation to changes in proteins and lipids as a response to salinity[J]. Journal of Plant Physiology，2015，175：148-156.

[19] Liu F，Zhang X，Lu C，et al. Non-specific lipid transfer proteins in plants：presenting new advances and an integrated functional analysis[J]. Journal of Experimental Botany，2015，66(19)：5663-5681.