甘露寡糖對阿司匹林誘導大鼠腸道損傷修復作用的研究

陳勇江 王金榮* 喬漢楨 蘇蘭利 唐桂芬 黃 進 趙銀麗 高溫婷

(1.河南工業(yè)大學生物工程學院，鄭州 450001；2.河南牧業(yè)經濟學院，鄭州 450011)

溫度、濕度、空氣和飼糧的改變會引起動物應激，嚴重時會引起動物腸功能障礙，導致進食行為異常或腸絨毛損傷等腸道問題，通常表現為腹瀉、采食量下降和死亡率升高等[1]。腸道損傷在動物養(yǎng)殖生產過程中持續(xù)發(fā)生，預防和修復腸道損傷是提高養(yǎng)殖水平、保證養(yǎng)殖效益的重要措施之一。當腸道發(fā)生損傷時，修復就是恢復腸道健康的首要策略，除蛋氨酸和精氨酸等功能性氨基酸外，一些益生菌、益生元、微量元素和植物提取物也都有修復腸道、降低腹瀉率的功能，可以有效地提高動物的經濟報酬，但是益生元不被機體吸收，相比益生菌具有更穩(wěn)定的特點[2-3]。王麗[4]發(fā)現殼寡糖可以有效地改善糖尿病大鼠的氧化損傷，降低大鼠血清中的超氧化物歧化酶(SOD)活性，提高腎臟中的丙二醛(MDA)含量，可以起到清除自由基的效果，表明殼寡糖可以在一定程度上修復糖尿病模型大鼠氧化損傷的腎臟。馬寧等[5]利用益生菌乳酸菌和功能性寡糖的混合微生態(tài)制劑處理腸道受損小鼠，功能性制劑可以有效地改善腸道菌群，增加腸道平滑肌的收縮功能。同樣，段永艷[6]在低溫應激羅非魚飼料中補充L-精氨酸和寡糖，不但可以提高羅非魚在應激情況下的免疫能力，同樣還會提高羅非魚的抗氧化能力和基因修復能力。吳士[7]也發(fā)現魔芋甘露低聚糖和益生菌的混合使用，可以有效降低腸上皮細胞損傷所產生的炎癥因子，降低細胞的損傷程度。前期研究表明，不同濃度的阿司匹林(ASA)可以導致不同程度的腸道損傷，而甘露寡糖(MOS)濃度在600 mg/kg時，效果最好，低于該濃度效果較差，高于該濃度效果與該濃度效果一致，所以選擇600 mg/kg作為修復濃度[8]。MOS作為一種功能性寡糖，可以通過調節(jié)動物腸道菌群、提高機體免疫能力和維持上皮屏障功能完整性能等有效地提高動物的生長性能[9-10]。但對于單獨使用MOS對腸道損傷進行修復的研究相對較少，通常采用MOS和益生菌的混合添加，或者是MOS和其他益生元共同使用來進行研究。因此，本研究擬采用600 mg/kg的MOS來對不同濃度ASA所導致的腸道損傷進行修復，探討MOS對大鼠腸道損傷修復的作用效果。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

受試物：ASA(河南某生物科技有限公司，98%)；MOS(某酵母股份有限公司，PW120)。

試驗動物：SD大鼠購于河南省試驗動物中心[SCXK(豫)2017—0001]。

主要設備儀器：切片機(金華市益迪醫(yī)療設備有限公司，YD-202A)、高速離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司，2018113100)、正置倒置一體熒光顯微鏡(美國Echo公司，RVL-100-G)、酶標儀(帝肯奧地利有限責任公司，1711012817)。

1.2 試驗設計

試驗采用單因素試驗設計，36只6周齡SPF級SD雄性大鼠，體重為150～180 g，隨機分為6組，每組6個重復，即空白組、模型組、MOS組、ASA1組、ASA2組和ASA3組，具體試驗設計見表1。大鼠進行單籠飼養(yǎng)，自由采食和飲水，飼養(yǎng)過程中每天更換飲水，每2 d更換1次墊料。適應期1周，正式試驗3周。

表1 試驗設計

1.3 檢測指標

1.3.1 生長性能和臟器指數測定

正式試驗開始前對大鼠進行稱重記錄初體重，試驗期間每天定時對大鼠的飼糧重和體重進行稱重記錄，試驗結束前1天禁食，自由飲水，解剖前稱量記錄末體重，計算體增重(BWG)、平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)及飼料轉化率(FCR)。曲頸處死大鼠后進行解剖，對臟器進行稱重記錄。計算臟器指數，公式如下：

臟器指數(VI，%)=[臟器重(g)/ 體重(g)]×100。

1.3.2 血清生化指標測定

采用摘眼球方法對大鼠取血，血液在室溫下自然凝固，3 000 r/min下離心20 min，收集血清，-20 ℃保存?zhèn)溆?。對大鼠的血清溶菌?LZM)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、髓過氧化物酶(MPO)活性及白細胞介素-2(IL-2)、D-乳酸(D-Lac)含量進行檢測。具體操作方法嚴格按照上海鑫樂生物科技有限公司試劑盒說明書進行，最后在酶標儀450 nm的波長下測量吸光度。

1.3.3 腸道組織學的觀察與測定

取大鼠在空腸中段取5 cm，用pH為7.2的磷酸鹽緩沖液(PBS)進行清洗，后在10%福爾馬林中室溫下保存，將腸段用流動水沖洗12 h，用梯度乙醇脫水，二甲苯透明，經過石蠟包埋，制作切片，利用蘇木精-伊紅染色后，用顯微鏡觀察腸道絨毛，測量絨毛高度(VH)和隱窩深度(CD)，并計算絨毛高度/隱窩深度比值(VH/CD)。

1.3.4 腸道黏液量的測定

在腸道距幽門10 cm處取5 cm，PBS中保存；將腸道勻漿后加入1 mL的PBS溶液，成懸浮狀。在4 ℃時，以15 000 r/min離心15 min。加入高碘酸(0.1%，100 μL)在37 ℃下孵育2 h，加入100 μL希夫試劑，室溫下孵育30 min。在紫外可見分光光度計555 nm的波長下測量吸光度[11]。

1.3.5 腸道黏膜分泌型免疫球蛋白A(sIgA)含量測定

截取5 cm靠近十二指腸的空腸處的腸組織，將腸段在紗布上剪開鋪平，用玻璃片刮取腸黏膜置于離心管中，-80 ℃存放，采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測黏膜sIgA含量，按照sIgA試劑盒(上海鑫樂生物科技有限公司)說明書進行試驗操作，最后在酶標儀450 nm的波長下測量吸光度[12]。

1.4 統計分析

試驗數據是以平均值±標準差表示，以SAS 9.1統計軟件進行單因素方差分析，以P<0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結 果

2.1 MOS對大鼠生長性能和臟器指數的影響

由表2可知，與空白組相比，模型組的生長性能均有下降趨勢，大鼠的BWG、ADG、ADFI和FCR分別降低了14.67%、31.22%、9.34%和23.81%(P>0.05)。與模型組相比，MOS可以提高ASA3組大鼠的BWG、ADFI和FCR，分別提高了7.97%、2.13%和6.25%(P>0.05)。ASA1和ASA2組的生長性能均低于空白組，但是差異不顯著(P>0.05)。

表2 MOS對大鼠生長性能影響

由表3可知，與空白組相比，模型組的肝臟指數、脾臟指數和胸腺指數分別降低了9.70%、9.10%和15.79%(P>0.05)，MOS組肝臟指數和脾臟指數分別升高了1.39%和9.09%(P>0.05)。與模型組相比，ASA3組肝臟指數、脾臟指數和胸腺指數分別升高了1.02%、5.00%和6.25%(P>0.05)。

表3 MOS對大鼠臟器指數的影響

2.2 MOS對大鼠血清生化指標的影響

由表4可知，與對照組相比，模型組血清LZM和T-SOD活性顯著降低(P<0.05)，分別降低了45.22%和46.14%，而血清MPO活性及IL-2和D-Lac含量顯著增加(P<0.05)，分別提高了106.60%、38.80%、137.93%；ASA1組血清MPO活性和D-Lac含量分別提高了39.82%和12.58%(P<0.05)，但IL-2含量及LZM和T-SOD活性不存在顯著差異(P>0.05)；ASA2組血清LZM、MPO和T-SOD活性和D-Lac含量存在顯著差異(P<0.05)。與模型組相比，ASA3組血清MPO活性和IL-2、D-Lac含量分別降低了17.80%、13.21%、2.90%，LZM和T-SOD活性分別提高了5.70%和17.69%，但只有T-SOD達到顯著差異(P<0.05)。

表4 MOS對大鼠血清生化指標的影響

2.3 MOS對大鼠腸道發(fā)育的影響

由表5可知，與空白組相比，模型組VH、CD與VH/CD分別降低了24.27%、9.66%和14.98%，但只有VH和VH/CD達到顯著水平(P<0.05)；而MOS組的VH和CD分別增加了2.62%和9.22%(P>0.05)；ASA1和ASA2組的VH均有一定程度的降低，分別降低了9.88%和14.56%(P<0.05)，而CD和VH/CD與空白組相比均無顯著差異(P>0.05)。與模型組相比較，ASA3組VH和VH/CD分別提高了2.79%和10.85%，VH/CD達到顯著水平(P<0.05)。

表5 MOS對大鼠腸道發(fā)育的影響

2.4 MOS對大鼠腸道黏液量和黏膜sIgA含量的影響

由表6可知，與空白組相比，模型組黏膜sIgA含量減少了30.32%(P<0.05)，ASA1組黏膜sIgA含量與空白組不存在顯著差異(P>0.05)，ASA2組和ASA3組分別降低了7.39%和12.50%(P<0.05)；與模型組相比，ASA3組升高了25.59%(P<0.05)；與空白組相比，模型組黏液量降低了12.42%，其他ASA組相對于空白組均有一定程度的降低，但是都不存在顯著差異(P>0.05)。

表6 MOS對大鼠黏液量和黏膜sIgA含量的影響

3 討 論

很多研究證明了MOS具有益生作用，不僅可以提高養(yǎng)殖動物的生長性能和免疫能力，還可以改善動物的腸道形態(tài)和腸道菌群免疫能力[13-14]。但是關于生長性能的試驗結果卻有所不同。熊阿玲等[15]在不同生長階段肉雞的飼糧中添加0.3～0.6 g/kg的MOS，可以提高1～42日齡的肉雞的ADG和ADFI。而與本試驗結果相同的是Biggs等[16]在肉雞的飼糧中補充MOS，并不會影響生長肉雞的生長性能。本試驗大鼠的ADG、ADFI和FCR并沒有因為添加MOS而受到影響。肝臟、脾臟和胸腺作為動物的免疫器官，這些免疫器官的指數大小可以用來評價機體免疫狀態(tài)[17]。本試驗中，ASA1、ASA2和ASA3組的肝脾指數相較于模型組都有一定升高的趨勢，這一點也與沈文康等[18]在小鼠的試驗中得到的結果相同。ASA3組的肝臟指數與模型組相比都出現了一定幅度的上升，但是效果不明顯。這也表明了灌服600 mg/kg的MOS對ASA損傷大鼠的生長性能和免疫能力的修復效果不明顯。

大鼠血清中的IL-2含量和LZM活性也可以反映大鼠的免疫能力，而血清MPO與T-SOD活性可以反映ASA致大鼠損傷機體的氧化應激水平，血清D-Lac含量則可以反映腸道的通透性。本試驗中的模型組大鼠血清中的IL-2含量升高了38.8%，LZM活性降低了45.22%，后經過600 mg/kg的MOS處理后，IL-2含量降低了13.21%，LZM活性提高了5.70%，雖然有所改善，但是不存在顯著差異。另外經過50和100 mg/kg ASA損傷的大鼠血清IL-2含量恢復到了一個正常的范圍內，與IL-2含量變化不同的是，ASA3組(200 mg/kg ASA損傷)的血清T-SOD活性比模型組高了17.69%，出現顯著差異，但是ASA3組的活性仍低于空白組，且存在顯著差異。SOD活性的提高表明MOS可以有效地提高大鼠的抗氧化能力，降低大鼠氧化損傷造成的危害。郭志勛等[19]在魚飼料中添加益生元低聚糖，魚血清中的LZM和SOD活性都有一個很明顯的提升作用。同樣，梁金逢等[20]的試驗表明，MOS配合復合益生菌可以提高育成期牛血清中的SOD的活性，提高抗氧化能力。血清中D-Lac含量的升高表明腸道損傷導致了腸道黏膜屏障功能受損，腸道細菌產生的代謝廢物透過腸屏障進入血液循環(huán)。劉靜波等[21]在斷奶仔豬的腸道屏障試驗結果中指出，攝入短鏈果寡糖可以顯著降低仔豬血清中D-Lac含量，保護腸道屏障功能。而本試驗結果表明，添加MOS不會對大鼠的腸道通透性有影響，而且MOS對200 mg/kg ASA損傷大鼠的腸道通透性并沒有很明顯的修復作用，對于50、100 mg/kg ASA所導致的腸道損傷雖然有一定的修復趨勢，但并沒有達到損傷前的健康水平，表明灌服600 mg/kg的MOS對大鼠腸道輕微損傷有修復的作用。

腸道形態(tài)直接關系到動物的生長性能，良好的腸道形態(tài)可以促進機體對營養(yǎng)物質的消化吸收。VH可以體現出動物腸道與營養(yǎng)物質接觸面積，其值越高表明動物的吸收能力越強，CD與腸上皮生長速率有關，VH/CD反映出腸道的功能狀態(tài)[22]。本試驗中，模型組的VH、CD與VH/CD都出現下降趨勢，表明腸道損傷動物的腸道形態(tài)遭到了破壞，模型組的VH、VH/CD較空白組分別降低了24.27%和14.98%。本試驗與Galdino等[23]的研究結果是一致的，添加寡糖可以改善損傷動物的腸道形態(tài)。同樣的，Hagiographa等[24]在鵪鶉的飼糧中添加MOS，可以顯著提高空腸VH。本試驗中，在50、100和200 mg/kg ASA導致的腸道損傷動物飼糧中補充MOS，3個試驗組的VH都沒有出現顯著變化，但是ASA3組的VH/CD與模型組相比上升了10.85%，達到了與空白組相同的水平，ASA1和ASA2組的CD都與空白組無顯著差異，處于健康狀態(tài)。這表明MOS對腸道損傷大鼠的腸道形態(tài)具有一定的修復作用。

腸道作為機體最大的免疫器官和消化外界營養(yǎng)物質的場所，腸道免疫屏障也是至關重要的，而黏液和免疫蛋白是維持腸道屏障功能健康的主要成分[25-26]。喻振等[27]在5-氟尿嘧啶誘導的大鼠腸黏膜損傷模型中，模型組的大鼠腸道sIgA含量顯著降低。本試驗中ASA2和ASA3組的黏膜sIgA含量變化可以看出后添加MOS可以提高免疫蛋白的含量，但是并不會使sIgA含量恢復到正常水平，而ASA1組的黏膜sIgA含量可以恢復到健康狀態(tài)。大鼠sIgA含量的增加表明MOS可以降低腸道內的細菌和抗原等物質對腸道的損傷，修復改善了腸黏膜損傷導致的sIgA含量減少的情況。同樣，本試驗中的所有試驗組腸道黏液量都不存在顯著差異，MOS并不會減少大鼠腸道黏液量的分泌，表明腸道損傷的大鼠，后期補充MOS雖然可以提高大鼠腸道黏膜免疫，但對腸道損傷的修復沒有明顯作用。

4 結 論

在本試驗條件下，大鼠灌服600 mg/kg MOS對不同劑量ASA導致的大鼠腸道損傷修復作用不同。MOS可以提高ASA1組大鼠血清IL-2含量、LZM活性及黏膜sIgA含量，顯著提高ASA2組血清中的IL-2含量。在腸道形態(tài)方面，600 mg/kg的MOS可以有效提高不同劑量ASA損傷大鼠VH/CD，表明腸道損傷的大鼠經灌服MOS后，對ASA導致的大鼠腸道損傷具有一定的修復作用。