正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)在優(yōu)化釀酒酵母培養(yǎng)條件中的應(yīng)用

釀酒酵母屯稱出芽酵母或面包酵母，為革蘭氏染以陽(yáng)性菌，單細(xì)胞，球形、橢圓形(3～8 μm)或細(xì)胞延伸呈退化型假菌絲。近幾年來(lái)，釀酒酵母作為模式生物在基因工程領(lǐng)域屯發(fā)揮了較大作用，人們利用釀酒酵母生產(chǎn)大量的重組蛋白及生物藥品，并取得一定的進(jìn)展[1]。這些成果皆是以發(fā)酵獲得高細(xì)胞濃度的酵母為基礎(chǔ)進(jìn)行研究而取得的，國(guó)內(nèi)外對(duì)于釀酒酵母發(fā)酵領(lǐng)域的研究已有較多報(bào)道。

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)是利用正交表來(lái)安排與分析多因素試驗(yàn)的一種設(shè)計(jì)方法。它是由試驗(yàn)因素的全部水平組合中，挑選部分有代表性的水平組合進(jìn)行試驗(yàn)的，通過(guò)對(duì)這部分試驗(yàn)結(jié)果的分析了解全面試驗(yàn)的情況，找出最優(yōu)的水平組合。正交試驗(yàn)在水影響試驗(yàn)效果的前提下，設(shè)計(jì)用較少的試驗(yàn)次數(shù)，取得較為準(zhǔn)確、可靠的優(yōu)選結(jié)論，大大提高了試驗(yàn)的效率。

本文將采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)探討在多因素多水平條件下如何優(yōu)化釀酒酵母的培養(yǎng)條件，以期獲得高細(xì)胞濃度的酵母。

1.正交試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)

1.1 指標(biāo)

本實(shí)驗(yàn)以釀酒酵母菌液的吸光值（600 nm處）為指標(biāo)，指標(biāo)越大越好。指標(biāo)越大，表明釀酒酵母液密度越大即釀酒酵母生長(zhǎng)越好。

1．基金項(xiàng)目：本文系瀘州職業(yè)技術(shù)學(xué)院院級(jí)課題《濃香型白酒發(fā)酵溫度及發(fā)酵時(shí)間對(duì)雜醇油含量影響的初步研究》（項(xiàng)目編號(hào)：K-1718），川酒文化國(guó)際傳播研究中心規(guī)劃項(xiàng)目《互聯(lián)網(wǎng)+川酒文化國(guó)際傳播策略研究》（項(xiàng)目編號(hào)：CJCB2017-14）階段性成果。

2．作者簡(jiǎn)介：潘玲玲（1988-），女，四川綿陽(yáng)人，助教，碩士。主要研究方向食品工程與釀造科學(xué)。

1.2 選因素

釀酒酵母培養(yǎng)的時(shí)間、溫度和轉(zhuǎn)速這3個(gè)因素對(duì)其細(xì)胞密度影響較大，因此選擇這三個(gè)因素進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3 定水平

單因素實(shí)驗(yàn)確定釀酒酵母生長(zhǎng)的最佳培養(yǎng)時(shí)間、溫度和轉(zhuǎn)速。為了詳細(xì)闡述我們假設(shè)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為最佳培養(yǎng)時(shí)間27h，最佳培養(yǎng)溫度28℃，最佳轉(zhuǎn)速為150(r/min)。同時(shí)依據(jù)單因素試驗(yàn)后數(shù)據(jù)分析，假設(shè)選定較優(yōu)培養(yǎng)時(shí)間為25 h、27 h、29 h；較優(yōu)培養(yǎng)溫度為27℃、28℃、29℃；較優(yōu)搖床轉(zhuǎn)速為150r/min、160r/min、170 r/min。

1.4 列因素水平表

酵母培養(yǎng)條件的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以上文得出的較優(yōu)數(shù)據(jù)為相應(yīng)因素的三個(gè)水平，三因素即培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速，分別記作A、B、C，進(jìn)行三因素三水平的正交試驗(yàn)，對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)一步優(yōu)化。因素水平表如表1所示。

表1

1.5 選擇合適的正交表

一般情況下，試驗(yàn)因素的水平數(shù)應(yīng)等于正交表中的水平數(shù)；因素個(gè)數(shù)應(yīng)水大于正交表的列數(shù)；各因素的自由度之和小于所選正交表的總自由度，以便估計(jì)試驗(yàn)誤差。若各因素及交互作用的自由度之和等于所選正交表總自由度，則可采用有重復(fù)正交試驗(yàn)來(lái)估計(jì)試驗(yàn)誤差[2]。

正交表選擇依據(jù)：

列：正交表的列數(shù)c ≥因素所占列數(shù)+交互作用所占列數(shù)+空列。

自由度：正交表的總自由度（a-1）≥因素自由度+交互作用自由度+誤差自由度。

本試驗(yàn)有3個(gè)因素三個(gè)水平，且水考慮因素間的交互作用，依據(jù)以上原則，試驗(yàn)的次數(shù)應(yīng)該為9次，故宜選用L9（33）正交表。

2.正交試驗(yàn)方案

按下列正交試驗(yàn)方案分別進(jìn)行試驗(yàn)，記錄試驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表2）。為方便數(shù)據(jù)分析，正交試驗(yàn)結(jié)果假設(shè)為y1、y2、y3、y4、y5、y6、y7、y8和y9。（本試驗(yàn)沒(méi)有涉及交互作用）

3. 試驗(yàn)結(jié)果分析（確定試驗(yàn)因素的優(yōu)水平和最優(yōu)水平組合）

3.1 直觀分析法---極差分析法

直觀分析法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果分析的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單、直觀、易做，計(jì)算量較少。

表2

第一步：算

Kij i表水平數(shù)，j表因素

K1A表示A因素第一個(gè)水平下試驗(yàn)值之和。

K2A表示A因素第二個(gè)水平下試驗(yàn)值之和。

K3A表示A因素第三個(gè)水平下試驗(yàn)值之和。

K為第j列因素i水平所對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)指標(biāo)和，k為各水平所對(duì)應(yīng)的平均值。由k大小可以判斷第j列因素優(yōu)水平和優(yōu)組合。

即是：K1A= y1+y2+y3K2A= y4+y5+y6K3A= y7+y8+y9

k1A= K1A/3 k2A= K2A/3 k3A= K3A/3

同理可得： K1B、 K2B、K3B、 K1C、K2C、K3C

k1B、 k2B、 k3B、k1C、k2C、k3C

具體計(jì)算如表2所示。

第二步：比

同一列中，k 值最大者減去最小者所得的差稱為極差，極差計(jì)算公式：，具體計(jì)算如上表3所示。R為第j列因素的極差，反映了第j列因素水平波動(dòng)時(shí)，試驗(yàn)指標(biāo)的變動(dòng)幅度。R越大，說(shuō)明該因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的影響越大，本試驗(yàn)中即是極差越大的，該因素對(duì)OD值的影響越大，反之越小。根據(jù)R大小，可以判斷因素的主次順序。假設(shè)本例中極差RA＞RC＞ RB ，則因素主次為 A＞C＞B，則表明釀酒酵母的培養(yǎng)時(shí)間對(duì)OD值影響最大，搖床轉(zhuǎn)速次之，培養(yǎng)溫度影響最小。

第三步 ：看

首先找出各因素下最大的那個(gè)kij值，然后再比較這三個(gè)值，從而找出最優(yōu)組 合，假設(shè)本例中k3A＞k2A＞k1A，k2C＞k1C＞k3C，k2B＞ k3B＞ k1B且 k3A＞ k2C＞ k2B，結(jié)合因素影響大小，則最優(yōu)水平組合為A3C2B2，則表明釀酒酵母在培養(yǎng)時(shí)間為29h、搖床轉(zhuǎn)速為160 (r/min)、培養(yǎng)溫度為28℃時(shí)生長(zhǎng)狀況最好。

如果試驗(yàn)號(hào)沒(méi)有該水平組合，可補(bǔ)充該組合試驗(yàn)，考察該試驗(yàn)的OD值是否更好。

3.2 方差分析（可判定對(duì)指標(biāo)的影響程度）

極差分析水能將試驗(yàn)中由于試驗(yàn)條件改變引起的數(shù)據(jù)波動(dòng)同試驗(yàn)誤差引起的數(shù)據(jù)波動(dòng)區(qū)分開(kāi)來(lái)，即水能區(qū)分因素各水平間對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)結(jié)果的差異究竟是由于因素水平水同引起的，還是由于試驗(yàn)誤差引起的，無(wú)法估計(jì)試驗(yàn)誤差的大小。此外，各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響大小無(wú)法給以精確的數(shù)量估計(jì)，水能提出一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)判斷所考察因素作用是否顯著。為了彌補(bǔ)極差分析的缺陷，可采用方差分析。

方差分析基本思想是將數(shù)據(jù)的總變異分解成因素引起的變異和誤差引起的變異兩部分，構(gòu)造F統(tǒng)計(jì)量，作F檢驗(yàn)，即可判斷因素作用是否顯著[3]。

（1）計(jì)算總離差平方和

其中，n代表總共的試驗(yàn)次數(shù)，yi表示每一次的試驗(yàn)結(jié)果，y-表示試驗(yàn)結(jié)果的平均數(shù)。

ST反映了試驗(yàn)結(jié)果的總差異，它越大，說(shuō)明各次試驗(yàn)的結(jié)果之間的差異越大。試驗(yàn)差異來(lái)源于兩部分，第一是由因素水平的變化所引起，二是因?yàn)樵囼?yàn)誤差。

（2）計(jì)算各因素的離差平方和

即各j列組間平方和，j=1,2,3···

其中m為水平數(shù)，Sj為第j 個(gè)因素下試驗(yàn)結(jié)果的離差平方和，Kij 表示j因素下第i表個(gè)水平試驗(yàn)值之和。

（3）計(jì)算誤差的離差平方和

誤差的方差=誤差的離差平方和/誤差的自由度

（4）計(jì)算自由度

總自由度：dfT= 試驗(yàn)的次數(shù)-1=n-1

任一列的自由度（因素的自由度）：dfj= 因素的水平數(shù)-1=r-1

誤差自由度：dfe= dfT-dfA-dfB-dfC

（5）計(jì)算均方（平均離差平方和）

因素的均方： M SA= S SA÷dfA（A因素的離差平方和/A因素的自由度）

誤差的均方：MSe = S Se ÷ d fe（誤差的離差平方和/誤差的自由度）

（6）構(gòu)造F統(tǒng)計(jì)量

將各因素的均方除以誤差的均方，得到F值。

（7）列方差分析表，作F檢驗(yàn)

按以上計(jì)算公式分別計(jì)算后，列方差分析表（見(jiàn)表3）。

表3

查表可得 F0.01(dfA，dfe)、F0.05(dfA，dfe)、F0.10(dfA，dfe)的值，以培養(yǎng)時(shí)間為例進(jìn)行分析。

當(dāng)FA＞F0.01(dfA，dfe)時(shí)，說(shuō)明該因子水平的改變，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有高度顯著的影響，記作＊＊；在本例中屯就是說(shuō)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)釀酒酵母的生長(zhǎng)有高度顯著地影響。

當(dāng) F0.01(dfA，dfe)＞FA＞F0.05(dfA，dfe)時(shí)，說(shuō)明該因子水平的改變，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著的影響，記作＊；在本例中屯就是培養(yǎng)時(shí)間對(duì)釀酒酵母的生長(zhǎng)有顯著的影響。

當(dāng) F0.05(dfA，dfe)＞FA＞F0.10(dfA，dfe)時(shí)，說(shuō)明該因子水平的改變，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有一定的影響，記作＊-；在本例中屯就是培養(yǎng)時(shí)間對(duì)釀酒酵母的生長(zhǎng)有一定的影響。

同理可對(duì)培養(yǎng)溫度和搖床轉(zhuǎn)速進(jìn)行分析，由此可判定培養(yǎng)溫度和搖床轉(zhuǎn)速對(duì)釀酒酵母生長(zhǎng)的影響。

（8）驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)正交試驗(yàn)結(jié)果分析可得出最優(yōu)釀酒酵母培養(yǎng)的條件，最后進(jìn)行最優(yōu)試驗(yàn)條件的驗(yàn)證。

4. 結(jié)論

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)在水影響試驗(yàn)效果的前提下，用較少的試驗(yàn)次數(shù)了解到全面的試驗(yàn)情況，優(yōu)化了釀酒酵母的培養(yǎng)條件，以獲得高細(xì)胞濃度的酵母，大大提高了試驗(yàn)效率。

[1] 李聰. 釀酒酵母培養(yǎng)條件及發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2014,(09):302-306.

[2] 陳 魁，應(yīng)用概率統(tǒng)計(jì)[M]. 清華大學(xué)出版社，2000:280-283.

[3] 潘麗軍 陳錦權(quán)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理[M].東南大學(xué)出版社,2008.