3種基因型芹菜修復(fù)DDT老化污染農(nóng)田土壤初探

鄭學(xué)昊，孫麗娜, ，馬欣雨，劉克斌，王輝，張鴻齡，王曉旭，桑淑婷，李福臣

滴滴涕（Dichloro diphenyl trichloroethane，DDT），化學(xué)式為(ClC6H4)2CH(CCl3)，分子量為354.5，存在4種衍生物，具有污染持久性、生物富集性和長距離遷移性等特點，作為首批持久性有機污染物被列入《斯德哥爾摩持久性有機污染物控制公約》。20世紀(jì)，DDT作為農(nóng)藥殺蟲劑在世界范圍內(nèi)被廣泛應(yīng)用，但由于噴灑技術(shù)的限制，大部分DDT直接落入土壤，與土壤顆粒絡(luò)合并逐漸老化，長期存在于土壤中難以去除。農(nóng)作物在含有 DDT污染的土壤中生長會富集 DDT，使其進入食物鏈。有研究表明，DDT等有機氯農(nóng)藥對動物生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)都會產(chǎn)生重大影響（高艷菲，2011），在人類母乳、臍帶血中皆發(fā)現(xiàn)了DDT及其代謝產(chǎn)物的存在（屈偉月，2007），這意味著人體內(nèi)的 DDT甚至可以通過哺乳行為從母體傳遞給幼體，對人類健康造成極大危害。截至目前，中國雖已經(jīng)禁用DDT農(nóng)藥長達(dá)30余年，但其在土壤中依然有較高的檢出率（陳蘇等，2016）。近年來，一種被廣泛使用的新型殺蟲劑三氯殺螨醇中也含有DDT雜質(zhì)，這使得土壤中的DDT及其衍生物有了新的來源（Wang et al.，2017）。

傳統(tǒng)的物理和化學(xué)方法修復(fù)有機污染土壤雖已形成較為規(guī)范的技術(shù)路線和管理模式，但在施工時需要消耗較大的人力物力（鄭學(xué)昊等，2017；USEPA，1997），其主要修復(fù)目標(biāo)為高污染水平的工業(yè)區(qū)，不適用于農(nóng)田污染土壤修復(fù)。目前化學(xué)強化植物-微生物聯(lián)合修復(fù)方法因目標(biāo)性強，無二次污染等特色而成為 DDT污染農(nóng)田土壤修復(fù)的主要研究方向，其中植物篩選是構(gòu)成聯(lián)合修復(fù)方法的基礎(chǔ)性工作，而中國目前在該方面所篩選出的植物種類比較單一，主要集中在苜蓿（Medicago sativa）、黑麥草（Lolium perenne）等豆科、禾本科植物上（張娟，2016）。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)芹菜對多環(huán)芳烴類有機污染物具有較好的去除效果（Wei et al.，2017），多環(huán)芳烴和DDT同屬芳香烴類污染物，其開環(huán)氧化過程及過程參與酶皆有許多相似之處，同時也有研究通過對大量蔬菜樣品進行農(nóng)藥殘留調(diào)查發(fā)現(xiàn)芹菜產(chǎn)品中有機氯農(nóng)藥檢出率較高（Wu et al.，2016），這些研究結(jié)果可能預(yù)示著芹菜對土壤中 DDT污染物存在良好去除效果。由于土壤存在異質(zhì)性，實驗室研究所得出的結(jié)論可以作為研究基礎(chǔ)但難以在實際工程中直接應(yīng)用。因此，本研究以設(shè)施農(nóng)田為實驗場地，通過現(xiàn)場實驗的方式，以芹菜作為修復(fù)植物對老化 DDT污染土壤進行修復(fù)，同時對比了芹菜在不同污染水平下對 DDT的富集情況，最終以酶活性作為微生態(tài)指標(biāo)表征修復(fù)后對土壤的擾動程度，旨在為未來工程性修復(fù)土壤DDT污染時提供更多的可選植物。

1 材料方法

1.1 試驗場地

試驗場地為遼寧省沈陽市沈北新區(qū)某花卉生產(chǎn)基地，基地土地被分割成1 m×1 m樣方，相鄰樣方內(nèi)設(shè)置20 cm高的隔離帶以避免交叉污染。據(jù)調(diào)查，該基地有長年施用 DDT農(nóng)藥的歷史，土壤類型為粉砂質(zhì)黏土，pH值為 7.18，有機質(zhì)（SOM）含量為50.62 g·kg-1，土壤陽離子交換量（CEC）為13.10 cmol·kg-1。

1.2 試驗設(shè)計

選用3種芹菜，分別為西芹（Apium graveolens Linn，X）、美國紅芹（Rubrum apium，H）、中華藥芹（Libanotis seseloides Turcz，Z）作為供試植物對DDT污染土壤進行修復(fù)，以不栽種任何植物處理為對照試驗（自然去除率），前期采集供試樣地土樣，進行污染物背景值測定，在兩個污染水平的樣方內(nèi)直接進行3種芹菜實際修復(fù)實驗，芹菜先期育苗后栽種于樣方內(nèi)，保持溫度，定期澆水，使芹菜正常生長。實驗始于2017年6月15日，芹菜生長3個月后，采集根際土，同時采集植物樣品，測定芹菜體內(nèi)（地上/地下）DDT富集量。芹菜根際土采集方法參照Garcia et al.（2005），編號處理及背景值詳見表1，低污染地塊DDT質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(46.0±2.8) μg·kg-1， 高 污 染 水 平 為 (72.2±3.0)μg·kg-1。采集土壤樣品后自然風(fēng)干研磨過60目篩，進行DDT質(zhì)量分?jǐn)?shù)定量分析。植物樣品采集后反復(fù)沖洗干凈，分為地上部分（莖葉部分）和地下部分（根部），自然風(fēng)干后使用高速粉碎機粉碎過60目篩，超聲提取植物體內(nèi) DDT。每組處理設(shè)置 3次重復(fù)，根際土與植物體內(nèi)DDT質(zhì)量分?jǐn)?shù)皆以干重計算。

1.3 分析方法

參照王曉旭等（2016）的方法，使用加速溶劑萃取-磺化法對土壤DDT進行提取凈化。參照呂良禾（2017）的方法，使用超聲萃取-磺化法對植物體內(nèi)DDT進行提取和凈化采用氣相色譜-電子捕獲檢測器（GC-ECD）對土壤樣品和植株樣品中的DDT進行定量分析（王曉旭等，2016）。多酚氧化酶與轉(zhuǎn)化酶均采用比色法測定（關(guān)松蔭，1986）。

1.4 實驗材料

實驗中所使用的主要儀器包括：加速溶劑萃取儀（美國戴安公司，ASE300型）、氣相色譜（美國瓦里安公司，CP-3800型）、超聲清洗儀（昆山超聲儀器有限公司，KQ-300VDB型）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠，RE-52AA型）、萬能高速粉碎機（香港歐凱萊芙實業(yè)公司，RRHP-100型）、無油真空泵（天津市恒奧科技發(fā)展有限公司，HPD-25型）?；瘜W(xué)試劑主要包括：丙酮、二氯甲烷（分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司）、正己烷（山東禹王實業(yè)有限公司化工分公司）、DDT標(biāo)樣（百靈威科技有限公司）。

表1 處理編號及供試土壤DDT背景值Table 1 The treatments and initial concentrations of DDT in soils

1.5 數(shù)據(jù)分析

運用Excel 2016進行數(shù)據(jù)計算；運用Origin 8.5進行繪圖；運用SPSS11進行Pearson雙變量相關(guān)性分析、ANOVA方差分析與t檢驗。

2 結(jié)果分析與討論

2.1 芹菜對根際土的修復(fù)效果

3種芹菜在兩種DDT污染水平下對根際土壤的修復(fù)作用如圖 1所示，CK1、X1、H1、Z1、CK2、X2、H2、Z2 處理 DDT去除率分別為 2.1%、48.80%、33.96%、31.92%、1.7%、39.41%、35.14%、26.60%，其中西芹的修復(fù)效果最好，經(jīng)t檢驗成對分析表明，其種間差異較低，但西芹與中華藥芹的差異顯著性水平（Sig.）達(dá)到0.087，同時ANOVA方差分析表明，芹菜在不同污染水平下對根際土中DDT去除率有顯著性差異（P＜0.05），當(dāng) DDT污染水平升高時，西芹和中華藥芹對DDT的去除率有所下降，美國紅芹在DDT污染土壤修復(fù)過程中表現(xiàn)較為穩(wěn)定。

圖1 不同基因型芹菜對DDT去除率Fig. 1 The degradation rates of DDT with different celery cultivarsCK1 means no celery planted in low concentration; X1 means A.graveolens planted in low concentration; H1 means R. apium planted in low concentration; Z1means R. apium planted in low concentration; CK2 means no celery planted in high concentration; X2 means A. graveolens planted in high concentration; H2 means R. apium planted in high concentration; Z2means R. apium planted in high concentration.n=3. The same below

植物對污染物的去除機制在于植物萃取和根系分泌物氧化，此外，植物與根際微生物構(gòu)成的植物-微生物修復(fù)體系對污染物去除也有明顯的強化作用（Mansouri et al.，2017）。對于植物修復(fù)DDT污染土壤的研究，前人已經(jīng)進行過植物篩選工作，例如Lunney et al.（2004）對比了西葫蘆（Cucurbita pepo）、高羊茅（Festuca elata）、苜蓿（Medicago Sativa）等植物對DDT的去除效果，并認(rèn)為修復(fù)效果與植物本身的蒸騰能力、生物量和根際分泌物組成相關(guān)，同時對于不同基因型的蓖麻（Ricinus communis）、南瓜（Cucurbita moschata）進行研究發(fā)現(xiàn)，不同基因型的同種植物，其去除DDT的能力存在較大差異（Huang et al.，2011；朱治強，2012）。本試驗的供試植物雖同屬芹菜科，但西芹根際土壤的DDT去除率最高可達(dá)到48.80%，其他兩種芹菜的去除率低于西芹，由此可見，西芹自身具有一定的DDT修復(fù)能力。有研究表明，芹菜根系分泌的亞油酸、亞麻酸直接發(fā)揮了去除有機污染物的作用（Yi et al.，2007），而目前有機酸被認(rèn)為是污染土壤修復(fù)過程中的一項重要強化措施，其可以通過活化有機污染物、土壤微生物和土壤酶而加速有機污染物去除，許多實驗證明在使用有機酸修復(fù)有機污染土壤中都有較好效果（王亞男等，2016；Agnello et al.，2015）。因此，推測根際分泌物對根際環(huán)境的優(yōu)化行為與直接對污染物的氧化過程可能是芹菜去除DDT的原因之一。

圖2 不同基因型芹菜富集DDT情況Fig. 2 The bioconcentration of DDT by different celery cultivars

2.2 芹菜修復(fù)過程中對污染物富集情況

芹菜修復(fù)3個月后，芹菜地上部分（莖/葉，干重）和地下部分（根部，干重）中 DDT的質(zhì)量分?jǐn)?shù)如圖2所示。不同種類芹菜地上部分DDT的質(zhì)量分?jǐn)?shù)表現(xiàn)為西芹＞美國紅芹＞中華藥芹，地下部分中DDT的富集量表現(xiàn)為美國紅芹＞中華藥芹＞西芹，經(jīng)ANOVA方差分析，芹菜地上部分與地下部分（干重）中的DDT質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在顯著性差異（P＜0.05），高水平污染土壤中生長的芹菜，其體內(nèi) DDT含量顯著高于低水平污染土壤中生長的芹菜，因此，土壤中DDT質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高可能促進芹菜富集DDT。美國紅芹對DDT的富集能力最強，其根部的DDT質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為 22.2 μg·kg-1，但未達(dá)到 GB18406.1—2001農(nóng)產(chǎn)品安全質(zhì)量無公害蔬菜安全要求中規(guī)定的限值（100 μg·kg-1）。伴隨土壤中DDT污染水平提高，美國紅芹體內(nèi)污染物質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對于其他兩種芹菜有較高的提升，說明美國紅芹可能更具作為 DDT富集植物的潛力，可以在今后的研究中對美國紅芹的最大 DDT耐受程度及富集能力作進一步研究。

前人研究發(fā)現(xiàn)，植物地下部分 DDT的質(zhì)量分?jǐn)?shù)普遍高于地上部分，根/莖葉（干重）中DDT質(zhì)量分?jǐn)?shù)比甚至可達(dá)到10倍（王玉紅，2006），研究者們一般認(rèn)為其原因在于植物根部一旦吸收有機污染物就會通過木質(zhì)化作用將其儲存至植物組織中（王亞男等，2016），而葉片中的DDT主要來自于根部吸收擴散。本試驗中，雖然芹菜地下部分DDT質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，但地上部分作為可食用部分，較低的 DDT富集能力可能預(yù)示著利用芹菜修復(fù)DDT污染土壤時不影響農(nóng)田的生產(chǎn)功能，由于具備綠色經(jīng)濟的特點，可將其納入“邊修復(fù)邊生產(chǎn)”的綠色修復(fù)理念體系。此外，有學(xué)者指出可以通過施加表面活性劑和構(gòu)建植物-專性降解菌體系以阻控污染物在作物-土壤體系中的遷移（朱利中，2012），在后續(xù)研究中可以通過施加適當(dāng)調(diào)控措施阻控DDT進入芹菜根部以完善該植物修復(fù)技術(shù)。

2.3 修復(fù)后對土壤酶活性影響及與去除率相關(guān)性分析

圖3 不同基因型芹菜對土壤酶影響Fig. 3 The enzyme activities in soil grown different celery cultivars

表2 DDT去除率與酶活性的Pearson相關(guān)系數(shù)Table 2 Pearson correlation coefficient among the degradation rateof DDT and the soil enzymes activities

在芹菜種植前后，芹菜根際土壤多酚氧化酶和轉(zhuǎn)化酶活性變化如圖3所示。多酚氧化酶活性與轉(zhuǎn)化酶活性在90 d的修復(fù)期后均升高，經(jīng)ANOVA方差檢驗，芹菜根際土中的轉(zhuǎn)化酶變化達(dá)到顯著性差異（P＜0.05），芹菜根際土中多酚氧化酶變化的顯著性水平達(dá)到0.084。在多酚氧化酶的活性表現(xiàn)上，中華藥芹為最優(yōu)的芹菜品種，而美國紅芹在激活土壤多酚氧化酶的能力上表現(xiàn)較為穩(wěn)定，西芹在高水平污染的土壤中具有更高的多酚氧化酶活性。在轉(zhuǎn)化酶方面，西芹有助于提高轉(zhuǎn)化酶活性，在高水平污染脅迫時，西芹和中華藥芹根際土中轉(zhuǎn)化酶的活性更高，美國紅芹亦表現(xiàn)為較為穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化酶活性。對DDT去除率、多酚氧化酶活性、轉(zhuǎn)化酶活性進行 Pearson雙變量相關(guān)性分析，結(jié)果如表2所示，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化酶分別與DDT去除率和多酚氧化酶存在較顯著相關(guān)性（P＜0.05），DDT去除率與多酚氧化酶相關(guān)性不強，但相關(guān)系數(shù)r達(dá)到0.687。

在研究土壤修復(fù)過程中土壤酶活性變化對表征土壤修復(fù)過程具有較為實用的價值，前人研究將土壤酶作為指示土壤修復(fù)過程的微生態(tài)指標(biāo)（王洪等，2011）。本研究選取了 1種氧化酶（多酚氧化酶）和1種還原酶（轉(zhuǎn)化酶）對芹菜修復(fù)DDT污染土壤情況進行指示，多酚氧化酶是 DDT污染物去除過程中的重要參與酶（孫麗娜等，2016），在芳香烴化合物的開環(huán)繼而氧化成酚的過程中發(fā)揮了重要作用（侯梅芳等，2014）。本研究表明，3種芹菜本身都具備提高多酚氧化酶活性的能力，在污染物質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高過程中，美國紅芹的多酚氧化酶活性較為穩(wěn)定，其可能具備更大的 DDT污染耐受范圍。在Pearson雙變量相關(guān)性分析結(jié)果中，多酚氧化酶與 DDT去除率相關(guān)性較弱，但在之前的研究中多酚氧化酶活性與 DDT去除率存在顯著正相關(guān)關(guān)系（鄭學(xué)昊等，2018），其中原因可能是，在表面活性劑等多種措施強化下，土壤微生物對污染土壤進行快速修復(fù)，土壤酶是共代謝作用的主要作用物質(zhì)，而在簡單的植物修復(fù)中污染物去除更趨向于慢性的蠶食過程。因此，多酚氧化酶與去除率的相關(guān)性可能存在差異，土壤酶活性變化是一個復(fù)雜的生態(tài)過程，同時，不同種酶活性之間也存在一定相關(guān)性。這與王洪等（2011）的研究結(jié)果相似，其認(rèn)為其中原因為微生物之間的相互作用，而本研究中，由于修復(fù)條件較為簡單，則認(rèn)為兩種酶的來源相同是其具有良好相關(guān)性的主要原因。

根際微生物代謝對是植物修復(fù)有機污染土壤的重要機理之一（呂良禾等，2017），而轉(zhuǎn)化酶是表征土壤微生物活性的重要酶類（王輝等，2017），相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化酶與 DDT去除率存在一定相關(guān)性，說明在植物修復(fù) DDT污染土壤過程中，根際微生物活性是其較高去除率的原因之一且其作用可能更優(yōu)于多酚氧化酶的代謝。

3 結(jié)論與展望

（1）芹菜在不同污染水平下對 DDT的去除效果達(dá)到顯著性差異，其對 DDT的富集區(qū)域主要集中在根部，地上部分對 DDT的富集性較低，芹菜根際土中的多酚氧化酶與轉(zhuǎn)化酶活性都呈現(xiàn)持續(xù)升高的態(tài)勢且與去除率都有一定的相關(guān)性，相對于多酚氧化酶的氧化作用，轉(zhuǎn)化酶所代表的微生物活性更有助于DDT的去除。

（2）西芹對 DDT的去除效果最好，且無顯著富集性，配合污染物的土壤-根系組控技術(shù)可應(yīng)用于構(gòu)建“邊修復(fù)邊生產(chǎn)”的綠色修復(fù)體系。美國紅芹對 DDT的富集能力較高，且去除效果和酶活性激活能力對不同污染水平具有較為穩(wěn)定的響應(yīng)，可在后續(xù)研究中作為富集植物對其最大耐受程度作進一步研究。

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