穩(wěn)定同位素標記1-(3-甲氧基苯基)-[4-(4-氟-2-甲氧基-D3苯胺)甲基]-1,2,3-三氮唑的合成

徐仲杰，涂亞輝，鐘佳琪，孫 雯，汪忠華，王浩然，白少飛，吳范宏

(1.上?；ぱ芯吭河邢薰?國家同位素工程技術研究中心 上海分中心，上海 200062；2.上?；ぱ芯吭河邢薰?上海穩(wěn)定性同位素工程技術研究中心，上海 200062；3.上海應用技術大學，上海 201418)

目前，各種癌癥嚴重威脅人類生命，研發(fā)高效的抗癌藥物已刻不容緩。早期的抗腫瘤藥物，對腫瘤細胞和正常細胞缺乏選擇性，在殺死腫瘤細胞的同時也殺死正常細胞。近年來，新發(fā)現(xiàn)的分子靶向藥物，能夠針對性地作用于腫瘤細胞，療效良好，不良反應少，逐漸成為抗腫瘤藥物的發(fā)展方向。1997年，全球第一個靶向抗腫瘤藥物——利托普希單抗上市，藥物研究已進入精準醫(yī)療時代，全球每年都有多個面向不同作用靶點的抗腫瘤藥物進入全球醫(yī)藥市場。

20世紀70年代，美國科研人員在非洲灌木矮柳樹的樹皮中分離出天然產(chǎn)物——考布他汀(Combretastatin A4, CA4)。并研制出分子靶向藥物，能夠很好的抑制微管蛋白聚合和分裂[1]。由于其良好的生物活性，英國、美國等已將其引入臨床評估，同時越來越重視對CA4結構的修飾以及類似物的開發(fā)，針對CA4結構的修飾主要集中在3個部位：A環(huán)、B環(huán)和順式雙鍵，成為抗腫瘤新藥研究的熱點方向之一[2-12]。

汪忠華等[13-14]報道了一種以苯胺丙炔和疊氮衍生物反應制備1,2,3-三氮唑衍生物的方法，具有一定的抗腫瘤活性。碳氘鍵比碳氫鍵更穩(wěn)定，有利于延長藥物在體內的代謝時間，提高藥效，而氟代藥物分子小，相容性高，本課題組利用氘標記合成的優(yōu)勢，在前期分子活性結構的基礎上，引入氘標記的-OCD3基團，形成氘代和氟代的協(xié)同作用，創(chuàng)制新型氘代氟代氨甲基三氮唑類抗腫瘤新藥。

1 主要儀器與試劑

IKA C-MAG HS7加熱磁力攪拌器：德國IKA公司；RE-52A型旋轉蒸發(fā)儀：上海衛(wèi)凱儀器有限公司；BrukerSpectrospin 500 UltrashieldTM核磁共振儀：德國Bruker公司；Waters Acquity UPLC H-Class超高效液相色譜：美國Waters公司；TSQ Quantum Acess液質聯(lián)用儀：美國熱電公司。

碘甲烷-D3：豐度99.0%，上?；ぱ芯吭河邢薰?；5-氟-2-硝基苯酚：分析純(AR)，上海阿拉丁試劑有限公司；3-甲氧基苯胺、3-溴丙炔：AR，上海泰坦科技股份有限公司；濃鹽酸、亞硝酸鈉、甲醇、異丁醇、抗壞血酸、硫酸銅：均為AR，中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司。

2 實驗方法

化合物的合成采用逆合成分析，結合有機合成原理，以穩(wěn)定、廉價、易得的碘甲烷-D3為原料，經(jīng)過甲基化、硝基還原、炔基取代、疊氮化以及環(huán)化反應合成1-(3-甲氧基苯基)-[4-(4-氟-2-甲氧基-D3苯胺)甲基]-1,2,3-三氮唑。合成路線示于圖1。

2.1 5-氟-2-硝基苯甲醚-D3(2)的合成

圖1 化合物(8)的合成路線Fig.1 The synthetic route of compound (8)

在100 mL三口反應瓶中加入化合物5-氟-2-硝基苯酚3.4 g、無水碳酸鉀5.0 g和無水丙酮40 mL，氮氣置換三次，冰浴攪拌10 min后，用注射器緩慢加入碘甲烷-D33.2 g，繼續(xù)冰浴反應0.5 h，然后升溫回流6 h停止反應，水洗，用乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥，抽濾，濃縮，得到黃色固體5-氟-2-硝基苯甲醚-D3(2)，收率90.0%(以碘甲烷-D3計)。1H NMR(CDCl3，500 MHz)，δ 6.75(m,2H)，7.95(dd,J1=9.0 Hz,J2=6.0 Hz,1H)，鑒定為目標產(chǎn)物。

2.2 4-氟-2-甲氧基苯胺-D3(3)的合成

在100 mL圓底燒瓶中加入自制的5-氟-2-硝基苯甲醚-D33.5 g，加入50 mL乙醇溶解，攪拌。稱取2.0 g的五水合硫酸銅溶于30 mL水中，加入至上述體系中，冰水浴下，分批向反應體系中加入硼氫化鈉3.8 g，繼續(xù)在冰水浴條件下反應3 h，用氯仿萃取三次，水洗，無水硫酸鈉干燥，抽濾，減壓去除溶劑得到棕色液體2.8 g，收率為90.5%(5-氟-2-硝基苯甲醚-D3計)。ESI-MS：145.09(M+1)+，1H NMR(CDCl3，500 MHz)，δ 3.59(br,2H)，6.47～6.61(m,2H)，7.25(s,1H)，鑒定為目標產(chǎn)物。

2.3 4-氟-2-甲氧基-1-丙炔基苯胺-D3(5)的合成

在100 mL三口燒瓶中加入無水碳酸鉀7.0 g和5-氟-2-硝基苯胺2.8 g，加入50 mL丙酮攪拌均勻，在常溫條件下滴加溴丙炔2.0 g，滴加結束后升溫至50 ℃反應4 h，停止反應。水洗后用氯仿萃取，無水硫酸鎂干燥，抽濾，減壓除溶得黑棕色粗品。柱層析提純后得到棕色液體2.9 g，收率85.7%(以4-氟-2-甲氧基苯胺-D3計)。ESI-MS：182.1(M)+，1H NMR(CDCl3，500 MHz)，δ2.21(t,J=2.4 Hz,1H)，3.94(d,J=1.8 Hz,2H)，4.26(br,1H)，6.56～6.62(m,3H)，鑒定為目標產(chǎn)物。

2.4 間甲氧基苯疊氮化鈉(7)的合成

將10 mL水和10 mL鹽酸先后加入100 mL三口燒瓶中，冰水浴冷卻后，加入3-甲氧基苯胺2.5 g，攪拌5 min，加入含亞硝酸鈉1.6 g的水溶液，稱取疊氮化鈉1.6 g溶于水中，緩慢地滴加到反應體系中，加完后繼續(xù)攪拌1 h，薄層色譜檢測反應進行直至原料反應完全。萃取，洗滌，干燥，抽濾，負壓除溶劑后得到間甲氧基苯疊氮化鈉3.1 g，收率85.1%(以間甲氧基苯胺計)。

2.5 1-(3-甲氧基苯基)-[4-(4-氟-2-甲氧基-D3苯胺)甲基]-1,2,3-三氮唑-D3(8)的合成

在100 mL三口燒瓶中依次加入間甲氧基苯疊氮化鈉1.2 g，4-氟-2-甲氧基-1-丙炔基苯胺-D31.3 g，五水合硫酸銅0.15 g，抗壞血酸鈉1.2 g，異丁醇10 mL，水10 mL，室溫攪拌2 h，停止反應。采用4-氟-2-甲氧基-1-丙炔基苯胺-D3后處理方法得到橘色固體粗品，柱層析得到橘色固體2.9 g，收率86.3%(以4-氟-2-甲氧基-1-丙炔基苯胺-D3計)，總收率60.2%(以碘甲烷-D3計)。純度99.0%，豐度99.0%。ESI-MS：332.11(M+1)+,1H NMR(CDCl3，500 MHz)，3.86(s,3H)，4.52(d,J=1.8 Hz,2H)，4.54(br,1H)，6.57～6.62(m,3H)，6.92(s,H)，7.22～7.40(m,3H)，7.87(s,H)。

3 結果與分析

綜上分析，在化合物1-(3-甲氧基苯基)-[4-(4-氟-2-甲氧基-D3苯胺)甲基]-1,2,3-三氮唑的(8)的五步反應過程中，產(chǎn)物經(jīng)鑒定為目標產(chǎn)物。第三步合成4-氟-2-甲氧基-1-丙炔基苯胺-D3的收率初期探索時僅約50%，副產(chǎn)物多且影響下一步反應，其他幾步合成收率穩(wěn)定，基本都大于85%，故第三步反應的收率對最終產(chǎn)品(8)的收率具有較大影響，對第三步反應的溫度、時間、投料比等條件進行優(yōu)化。

3.1 合成收率影響因素

3.1.1反應溫度

反應溫度對4-氟-2-甲氧基-1-丙炔基苯胺-D3的收率影響較大，實驗中固定反應時間4 h，n(4-氟-2-甲氧基苯胺)：n1(溴丙炔)=1∶1.2，研究溫度變化對收率的影響，結果示于圖2。從圖2結果可知，當反應體系的溫度低于0 ℃時反應收率較低，其原因可能是溫度低，反應活性低，反應較難發(fā)生，收率低；當溫度高于50 ℃時，收率隨著溫度升高而降低，是因為溫度高容易發(fā)生溴丙炔的二取代反應，質譜上顯示有二取代的分子離子峰，并且液相上明顯二取代雜峰增大，造成收率低，因此優(yōu)選反應溫度為50 ℃。

圖2 反應溫度對4-氟-2-甲氧基-1-丙炔基苯胺-D3收率的影響Fig.2 Effect of temperature on synthesis of (4-Fluoro-2-methoxy-phenyl)-prop-2-ynyl-amine-D3

3.1.2反應投料比

為了提高4-氟-2-甲氧基-1-丙炔基苯胺-D3的反應收率，研究4-氟-2-甲氧基苯胺-D3和溴丙炔的物質的量比對4-氟-2-甲氧基-1-丙炔基苯胺-D3反應收率的影響，具體結果列于表1。由表1結果可知，當反應物質的量比達到1∶1.2時，4-氟-2-甲氧基-1-丙炔基苯胺-D3的收率達到最大。

表1 反應投料比對4-氟-2-甲氧基-1-丙炔基苯胺-D3收率的影響Table 1 Effect of ratio on the synthesis of (4-Fluoro-2-methoxy-phenyl)-prop-2-ynyl-amine-D3

注：反應條件：反應時間4 h，反應溫度50 ℃；n∶n1=4-氟-2-甲氧基苯胺∶溴丙炔

3.1.3反應時間

固定反應物料比為1∶1.2，反應溫度為50 ℃，考察反應時間對合成4-氟-2-甲氧基-1-丙炔基苯胺-D3的影響,實驗結果示于圖3。由圖3結果可以看出,隨著反應時間的增加，4-氟-2-甲氧基-1-丙炔基苯胺-D3收率迅速提高，到4 h后基本趨于穩(wěn)定,再延長時間，收率略有下降，其原因是反應時間過長導致溴丙炔二取代副產(chǎn)物的生成(質譜上顯示有二取代的分子離子峰，并且液相上明顯二取代雜峰增大)，綜合成本考慮，選擇較優(yōu)的反應時間為4 h。

圖3 反應時間對4-氟-2-甲氧基-1-丙炔基苯胺-D3合成收率的影響Fig.3 Effect of reaction time on synthesis of (4-Fluoro-2-methoxy-phenyl)-prop-2-ynyl-amine-D3

3.2 結構表征

化合物(8)的1H NMR核磁譜圖分析示于圖4。1H NMR(CDCl3，500 MHz)，δ3.82(s,3H)，3.84(s,3H)，4.52(d,J=1.8 Hz,2H)，4.54(br,1H)，6.57～6.62(m,3H)，6.92(s,H)，7.22～7.40(m,3H)，7.87(s,H)。譜圖積分為17個氫，結構上為17個氫，可見，合成產(chǎn)品的1H NMR與化合物(8)的結構吻合，確定產(chǎn)品是目標產(chǎn)物。

化合物(8)的LC-MS圖譜示于圖5，主峰m/z=332.11，為[M+H]峰，其質量數(shù)332.11≈331.10+1(331為化合物(8)相對分子質量)，結合核磁譜圖可以確認為目標化合物(8)，同位素豐度為99.0%。

圖4 化合物(8)的1H NMR譜圖Fig.4 1H NMR of compound (8)

3.3 活性測試

采用7sea-cell Counting Kit-8(CCK-8)染色法檢測化合物(8)的細胞活力。取活細胞比例達90%以上的細胞進行實驗。細胞增殖抑制試驗采用CCK-8細胞活力檢測試劑盒。細胞消化、計數(shù)、制成濃度為1×105個/mL的細胞懸液，96孔板中每孔加入100 μL細胞懸液(每孔1×104個細胞)；96孔板置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；每孔加入100 μL含藥物的培養(yǎng)基，設立陰性對照組，溶媒對照組，陽性對照組，每組5復孔；96孔板置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后；每孔加入10 μL CCK-8溶液,將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內孵育4 h，用酶標儀測定在450 nm處的OD值，計算化合物(8)對人肺癌細胞A549、人肝癌細胞HepG2、人胃癌細胞MGC-803、人胃癌細胞MKN45等細胞的抑制率及IC50值。劑量設置：劑量1組：100 μmol/L；劑量2組：50 μmol/L；劑量3組：25 μmol/L；劑量4組：12.5 μmol/L；劑量5組：6.25 μmol/L；劑量6組：3.125 μmol/L；劑量7組：1.562 5 μmol/L；劑量8組：0.781 25 μmol/L；劑量9組：0.390 625 μmol/L；劑量10組：0.195 312 5 μmol/L；陽性對照：10 μg/mL。

圖5 化合物(8)的LC-MS譜圖Fig.5 The LC-MS ofcompound (8)

化合物(8)對腫瘤細胞的IC50值列于表2，表2結果表明，化合物(8)對A549、MGC803、MKN45、HepG2等表現(xiàn)出廣譜的抗腫瘤活性，具有成為抗腫瘤藥物的潛力。

表2 化合物(8)對腫瘤細胞的IC50值Table 2 The IC50 values of compound (8) to tumour cell

4 結論

本研究采用碘甲烷-D3為原料，經(jīng)過甲基化、硝基還原、炔基取代、疊氮化以及環(huán)化反應合成1-(3-甲氧基苯基)-[4-(4-氟-2-甲氧基-D3苯胺)甲基]-1,2,3-三氮唑。該合成方法簡單而且穩(wěn)定性高，以碘甲烷-D3計，目標產(chǎn)物總收率為60.2%，化學純度為99.0%，同位素豐度為99.0%?；衔锞哂袕V譜抗腫瘤活性，有望成為抗腫瘤藥物。

參考文獻：

[1] It G R, Singh S B, Hamel E, et al. Isolation and structure of the strong cell growth and tubulin inhibitor combretastain A-4[J]. Experientia,1989, 45(2): 209-211.

[2] Gaukroger K, Hadfield J A, Lawrence N J, et al. Structural requirements for the interaction of combretastatins with tubulin: how important is the trimethoxy unit?[J]. Org Biomol Chem, 2003, 1(17): 3 033-3 037.

[3] Pettit G R, Minardi M D, Rosenberg H J, et al. Antineo plastic agents509:synthesis of fluorcombstat in phosphateandrelated 3-halostilbenes[J]. J Nat Prod, 2005, 68(10): 1 450-1 458.

[4] Pettit G R, Anderson C R, Herald D L, et al .Antineo plastic agents 487.synthesis and biological evaluation of the antineo-plastic agent 3,4-methylene dioxy-5,4′-dimethoxy-3′-amino-Z-stilbene and derived aminoacidamides[J]. J Med Chem, 2003, 46(4): 525-531.

[5] John J H, Madhavi S, Tracy E S, et al. Design, synthesis, biochemical, and biological evaluation of evaluation of nitrogen-containing trifluoro structural modifications of combretastain A-4[J]. Bioorg Med ChemLett, 2008, 18(18): 5 146-5 149.

[6] Maya A B S, Del Rey B, de Clairac R P L, et al. Design, synthesis and cytotoxic activities of naphthylanphthyl analogues of combretastain A-4[J]. Bioorg Med ChemLett, 2000, 10(22) : 2 549-2 551.

[7] Hu L, Li Z R,Wang Y M, et al. Novel pyridinyl and pyrimidinylcarbazole sulfonamides as antiproliferative agents[J]. Bioorg Med Chem Lett, 2007, 17(5): 1 193-1 196.

[8] Ohsumi K, Nakagawa R, Fukuda Y, et al. Novel combretastatinananlogues effective against murine solid tumors: Design and structure-activity relationships[J]. J Med Chem, 1998, 41(16): 3 022-3 032.

[9] Pinney K G, Mejia M P, Villalobos V M, et al. Synthesis and biological evaluation of aryl azide derivatives of combretastatin A-4 as molecular probes for tubulin[J]. Bioorg Med Chem, 2000, 8(10): 2 417-2 425.

[10] Monk K, Siles R, Hadimani M B, et al. Design, synthesis, and biological evaluation of combretastatin nitrogen-containing derivatives as inhibitors of tubulin assembly and vascular disrupting agents[J]. Bioorg Med Chem, 2006, 14(9): 3 231-3 244.

[11] Hatanaka T, Fujita K, Ohsumi K, et al. Novel B -ring modified combretastatin analogues: Syntheses and an tineoplasticactivity[J]. Bioorg Med Chem Lett,1998,8(23): 3 371-3 374.

[12] Rao Y K, Fang S H, Tzeng Y M. Synthesis and biological evaluation of 3′,4′,5′-trimethoxychalcone analogues as inhibitors of nitric oxide production and tumor cell proliferation[J]. Bioorg Med Chem, 2009,17(23) : 7 909-7 914.

[13] 汪忠華. 一種1-取代苯基-4-取代苯胺甲基-1,2,3-三氮唑衍生物及其制備方法和用途:中國,201410834545.2[P].2014-12-23.

[14] 巫輔龍. 二苯基取代氨甲基三氮唑類化合物的合成和活性研究[D]. 上海：上海應用技術大學,2016.