云南省部分豬場賈第蟲分子檢測與分析

石蓮琴，馮 云，吳 杰，晏云濤，楊建發(fā)，鄒豐才，趙國洪

（1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，云南省高校獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650201；2. 永善縣畜牧獸醫(yī)局，云南永善 657300；3. 玉溪農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南玉溪 653106）

賈第蟲是一種重要的人獸共患寄生蟲，可感染常見家畜及人類，主要通過糞便污染造成流行。賈第蟲作為一種機(jī)會性致病寄生蟲，當(dāng)宿主免疫功能下降或者喪失時，會出現(xiàn)異常繁殖進(jìn)而導(dǎo)致疾病發(fā)生[1]。據(jù)報(bào)道，成年動物常呈隱性感染，而幼畜則表現(xiàn)為腹瀉、精神沉郁、生長緩慢等，嚴(yán)重時導(dǎo)致死亡[2]。人感染賈第蟲后的癥狀與動物基本相同，主要為腹泄、嘔吐、腹痛；典型病癥表現(xiàn)為以腹瀉為主的吸收不良綜合征；兒童患者常因腹瀉，引起貧血、營養(yǎng)不良，從而導(dǎo)致生長緩慢[3]。

到目前為止，公認(rèn)的賈第蟲有6個有效種，其中藍(lán)氏賈第蟲是唯一一種既能感染人，又能感染其它哺乳動物的蟲種[4]。藍(lán)氏賈第蟲包括 8 個有效集聚體：A、B為宿主范圍廣泛的集聚體；C-H為有宿主特異性的集聚體，其中C、D主要感染犬科動物，E 主要發(fā)現(xiàn)于偶蹄動物，F(xiàn)、G、H分別發(fā)現(xiàn)于貓科動物、嚙齒類動物和海豹[5]。

目前，針對云南省豬場的賈第蟲感染情況還未見報(bào)道。人與豬之間接觸較為頻繁，這為賈第蟲的傳播提供了機(jī)會，因此了解云南省豬場的賈第蟲感染情況，具有重要的公共衛(wèi)生意義。

1 材料與方法

1.1 樣品

從云南省保山市和玉溪市4個養(yǎng)豬場采集了129頭豬的新鮮糞樣，共129份。

1.2 主要試劑

糞便DNA提取試劑盒：購自O(shè)MEGA公司；Taq DNA聚合酶：購自上海生工生物工程有限公司；10×Buffer、MgCl2、dNTP等：購自寶生物工程（大連）有限公司；DL 2000 Marker、核酸染料等：購自昆明豐科生物科技有限公司；瓊脂糖：購自全式金生物科技（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 取1 g左右的糞便樣品溶于50 mL水中，混勻；用60目的網(wǎng)篩過濾，除去草屑等雜質(zhì)，3 000 r/min離心3 min，取300 μL于2 mL離心管中。提取步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。提取的DNA于-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PCR 擴(kuò)增 采用Zhang等[6]報(bào)道的賈第蟲TPI基因序列引物（表1）。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)條件（總體積為 25 μL）為：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性45 s，58 ℃退火 45 s，72 ℃延伸60 s，共35個循環(huán)；最后72 ℃再延伸5 min。第2輪反應(yīng)條件與第1輪相同。預(yù)期目的片段大小為530 bp。取擴(kuò)增好的PCR產(chǎn)物4 μL，用1%瓊脂糖凝膠電泳，于紫外凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。

表1 TPI基因引物序列

1.3.3 測序分析 將電泳陽性產(chǎn)物送到華大基因公司進(jìn)行測序；測序結(jié)果經(jīng)NCBI的BLAST核酸比對系統(tǒng)（http∶//www.ncbi.nlm.nih.gov）鑒定，確定是否為賈第蟲。

2 結(jié)果

2.1 感染情況

129份樣品中，檢出陽性2份，總檢出率為1.55%。其中：保山市44份，檢出陽性1份，檢出率率為2.27%；玉溪市85份，檢出陽性1份，檢出率為1.18%。賈第蟲TPI序列電泳結(jié)果見圖1。

圖1 賈第蟲TPI序列電泳圖

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析

對陽性序列經(jīng)比對分析后，使用MEGA 6.0 構(gòu)建賈第蟲種系發(fā)育樹（圖2）。NCB I的BLAST比對分析顯示，兩個陽性樣本均為集聚體B，與人源分離株（KT948104、AB480868）以及猴源分離株（KJ888985）同源性最高，分別為99%和100%。

圖2 賈第蟲TPI rRNA基因序列的種系發(fā)育樹

3 討論

賈第蟲宿主范圍廣泛，可感染包括人在內(nèi)的多種脊椎動物，還可在人和伴侶動物之間傳播[7]。賈第蟲呈世界性分布，在歐洲、北美洲、南美洲、大洋洲和亞洲等地區(qū)均有感染存在[8]。目前，國內(nèi)關(guān)于豬賈第蟲感染情況的報(bào)道較少，更未見云南省感染情況的報(bào)道。首次報(bào)道我國豬賈第蟲感染情況的是王海燕[9]對河南省幾種豬原蟲的調(diào)查。她用盧戈氏碘顯微鏡觀察法檢出的感染率為0.5%，用PCR擴(kuò)增檢出的感染率為1.2%，檢測結(jié)果有顯著差異。糞樣鏡檢進(jìn)行的是形態(tài)學(xué)鑒定，檢出率偏低，因此本試驗(yàn)采用巢氏PCR擴(kuò)增賈第蟲TPI序列，對云南省4個豬場進(jìn)行賈第蟲分子檢測。此外，李威等[5]采用分子檢測，對四川省野豬及小香豬賈第蟲感染情況進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)總體感染率為3.99%，高于王海燕調(diào)查的河南省總體感染情況，但大大低于澳大利亞調(diào)查的豬感染率（31.1%）[10]。

賈第蟲集聚體B有廣泛的宿主范圍，屬于人獸共患集聚體。經(jīng)序列比對及構(gòu)建進(jìn)化樹分析，本次檢出兩個賈第蟲陽性樣本均屬于集聚體B，具有傳染人的潛在風(fēng)險。賈第蟲是人獸共患寄生蟲，目前被列為危害人類健康的10種主要寄生蟲之一。而宿主范圍廣泛的集聚體B，對人類的危害更嚴(yán)重。本研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)，云南省豬體內(nèi)存在賈第蟲感染。雖然其感染率不高，但有人獸共患風(fēng)險，且目前并無有效的免疫預(yù)防方法[11]，因此需引起重視。賈第蟲主要通過“糞-口”途徑傳播，其中水源污染是造成流行和暴發(fā)的主要原因。據(jù)報(bào)道，全世界132例人賈第蟲感染中，104例與飲用水有關(guān)[12]。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）估計(jì)，全世界人群中的賈第蟲感染率為2%～30%[7]。我國1997年對30個省份調(diào)查的人感染率為2.52%，約有2 850萬人感染[13]。云南省已有關(guān)于人賈第蟲感染的報(bào)道。2016年云南省對獨(dú)龍族小學(xué)生進(jìn)行腸道寄生蟲調(diào)查發(fā)現(xiàn)，賈第蟲感染率為2.51%[14]，當(dāng)?shù)卮逭l(wèi)生條件差以及喝生水的習(xí)慣是主要感染因素。

4 結(jié)論

本調(diào)查采用巢式PCR，對云南省4個豬場的129份豬糞便樣品進(jìn)行了賈第蟲分子檢測，檢出陽性樣品2份，總感染率為1.55%。雖然感染率不高，但這2個陽性樣本均為集聚體B，與人源分離株和猴源分離株的同源性很高，分別為99%和100%，存在感染人的風(fēng)險。因此，需要加強(qiáng)豬場衛(wèi)生防疫，做好豬糞便的無害化處理，避免因糞便污染而造成疫病流行。

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