白蠟屬優(yōu)良種質(zhì)資源親緣關(guān)系的AFLP分析

燕麗萍 ，吳德軍 ，王因花 ，劉翠蘭 ，王開芳 ，吳 紅 ，任 飛 ，李慶華

（1.山東省林業(yè)科學(xué)研究院，山東 濟(jì)南 250014；2.山東省林木遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014；3.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300）

白蠟屬Fraxinus為木樨亞科Oleceae，全世界70余種，我國(guó)30多種，種質(zhì)資源非常豐富，無(wú)論是實(shí)生苗還是栽培種質(zhì)，均具有豐富的遺傳多樣性，這可能與其異化授粉的生物學(xué)特性有關(guān)，對(duì)其種質(zhì)資源進(jìn)行評(píng)價(jià)是育種研究工作的重要環(huán)節(jié)之一，但其種或品種的植物學(xué)分類存在爭(zhēng)議[1-3]。傳統(tǒng)的白蠟分類鑒別主要依靠翅果、花、芽、葉及花粉粒等形態(tài)學(xué)標(biāo)記，以翅果和花性狀的差異最為明顯，其次是芽、葉緣鋸齒和果實(shí)缺刻被作為分類的依據(jù)[4]。雖然形態(tài)表型標(biāo)記研究簡(jiǎn)單直觀且較適用，但有些不同種或品種間的形態(tài)表型特征極為相似，在種間交互難以區(qū)分，造成了白蠟屬植物分類混淆問題，常出現(xiàn)同種多名稱以及同名多品種的現(xiàn)象，導(dǎo)致白蠟命名上存在一些爭(zhēng)議[5]。在白蠟種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)中，僅依靠單一的形態(tài)表型特征性狀，通常不能準(zhǔn)確的說(shuō)明不同種或品系間的遺傳差別和親緣關(guān)系，因?yàn)樾螒B(tài)表型性狀極易受到環(huán)境氣候的影響而發(fā)生變化，且同一樹種隨著地理位置的不同，產(chǎn)生連續(xù)性變異或高度可塑性，有些形態(tài)表型指標(biāo)甚至受個(gè)體發(fā)育階段的影響[6-7]，這給種源間親緣關(guān)系的確定帶來(lái)困難。

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)能從DNA水平更能有效、準(zhǔn)確的反映種質(zhì)資源間的遺傳變異及親緣關(guān)系[8-9]。分子標(biāo)記技術(shù)不受氣候環(huán)境、發(fā)育階段和植物組織的限制，僅用一個(gè)葉片、嫩芽或其它少量植物組織就可以從DNA水平上檢測(cè)基因組的變異，獲得精確的DNA指紋圖譜，快速、有效地進(jìn)行鑒定大量種或品種[10]。目前，已有十多種分子標(biāo)記技術(shù)，其中，AFLP（擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性 amplified fragment length polymorphism）分子標(biāo)記技術(shù)結(jié)合了 RFLP和 RAPD 技術(shù)的特點(diǎn)，具有高效性、重復(fù)性好、多態(tài)性效率高和穩(wěn)定性高等特點(diǎn)，已應(yīng)用于基因定位、品種鑒定、遺傳圖譜、基因庫(kù)構(gòu)建、基因克隆等方面的研究[11-14]。在白蠟屬植物僅對(duì)歐洲白蠟F.excelsior的核 DNA SSR、葉綠體 SSR、EST-SST 標(biāo)記篩選分離，以及SSR標(biāo)記在種群遺傳分析與系統(tǒng)發(fā)生地理學(xué)方面進(jìn)行了研究[15-17]。目前，尚未見到從分子水平上對(duì)白蠟屬植物進(jìn)行標(biāo)記鑒定的報(bào)道。本研究采用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)白蠟屬部分種質(zhì)資源進(jìn)行研究，并探索種質(zhì)間的遺傳差異及其親緣關(guān)系，為白蠟屬植物鑒別分類、早期鑒定、資源保護(hù)提供分子證據(jù)，也為雜交育種的親本選擇及品種改良提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為2013年在新疆、黑龍江、湖南、陜西、甘肅、北京、山東等8個(gè)省市自治區(qū)收集的資源，于2014年春天嫁接保存山東省林業(yè)科學(xué)研究院壽光試驗(yàn)站，絨毛白蠟Fraxinus velutina38份（包括新品種魯蠟1號(hào)-魯蠟4號(hào)），歐洲白蠟Fraxinus excelsior8份（包括5個(gè)新品種），美國(guó)白蠟Fraxinus americana7份（包括新品種紅葉白蠟、秋紫白蠟、秋火白蠟和秋歡白蠟），美國(guó)紅梣Fraxinus pennsylvanica6份（包括新品種魯蠟5號(hào)和魯蠟6號(hào)），中國(guó)白蠟Fraxinus chinensis6份，2個(gè)未確定種質(zhì)等， 15個(gè)樹種共計(jì)90份，樣品名稱及來(lái)源見表1。每份種質(zhì)取2～3片嫩葉裝入做好標(biāo)記的自封袋，用硅膠干燥后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總DNA制備

參照Murray和Thompson的CTAB法從試驗(yàn)材料幼葉中提取總DNA，并略作修改[18]。

1.2.2 AFLP分析

利用北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司生產(chǎn)的AFLP試劑盒（PstI /Mse I 型）及其操作指南進(jìn)行，分析90份白蠟屬種質(zhì)間的親緣關(guān)系。。

（1）限制性酶切及連接反應(yīng)。反應(yīng)體系為20 μL，在0.2 mL的離心管中依次加入DNA模板4 μL （50 ng/μL），Adapter 1 μL，PstI /Mse I 2 μL，10×Reaction buffer 2.5 μL，ATP （10 mmol/L）2.5 μL，T4 Ligase 1 μL，ddH2O 7 μL。將上述混合液混勻離心數(shù)秒，37 ℃酶切5 h，之后8 ℃酶切4 h，4 ℃連接過夜，連接產(chǎn)物稀釋20倍進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)。

（2）預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系為25 μL，在0.2 mL的離心管中依次加入（DNA 2 μL，Preampmix 1 μL，dNTPs 0.5 μL，10XPCR buffer 2.5 μL，Taq DNA polymerase 0.5 μL，ddH2O 18.5 μL）進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增。預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃變性2 min；94 ℃變性 30 s，56 ℃復(fù)性 30 s，72 ℃延伸 80 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

（3）選擇性擴(kuò)增反應(yīng)。將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋20倍作為選擇性擴(kuò)增模版，挑選9個(gè)帶型清晰且多態(tài)性帶好的選擇性核苷酸PstI /Mse IⅠ引物進(jìn)行選擇性擴(kuò)增（引物序列見表2）。PCR反應(yīng)程序?yàn)榈谝惠啍U(kuò)增參數(shù)：94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，以后每輪循環(huán)溫度遞減0.7 ℃，擴(kuò)增12輪。接著

按下列參數(shù)擴(kuò)增23輪，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，最后延伸 5 min。

表1 供試材料及來(lái)源Table 1 Experiment materials and their origin

1.2.3 電泳分離檢測(cè)與數(shù)據(jù)處理

取0.4 μL擴(kuò)增產(chǎn)物采用ABI377型自動(dòng)測(cè)序儀上樣檢測(cè)，Marker為熒光分子量標(biāo)準(zhǔn)（即GeneScan 500 Size Standard，ROX-500）， 電泳結(jié)束后，DNA測(cè)序儀將自動(dòng)保存膠圖。運(yùn)用GENESCAN 3.1分析軟件，提取原始膠圖中的數(shù)據(jù)。運(yùn)用NTSYSpc 2.1軟件，將得到的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)變?yōu)?，1，有帶的記為1，無(wú)帶的記為0。按照趙麗華等的方法[15]，使用POPGEN 32軟件計(jì)算標(biāo)記位點(diǎn)的多態(tài)性條帶比率（percentage of polymorphic bands，PPB），標(biāo)記位點(diǎn)的多態(tài)信息量（polymorphism informationcontent，PIC）和有效等位基因數(shù)（effective number of allele，Ne）。使用NTSYSpc-V.2.1計(jì)算遺傳相似系數(shù)，并根據(jù)相似性系數(shù)對(duì)90份種質(zhì)采kai用非加權(quán)配對(duì)類平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA純度檢測(cè)

由圖1瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，提取的白蠟基因組DNA主帶清晰，無(wú)RNA條帶；核酸蛋白儀檢測(cè)結(jié)果A260/A280比值1.796～1.868之間。表明采用改進(jìn)CTAB法所提取白蠟基因組DNA結(jié)構(gòu)完整，符合AFLP分子標(biāo)記分析的要求。

圖1 部分樣品基因組DNA 電泳圖像Fig.1 Electrophoresis pattern of leaves DNA from part of samples

2.2 限制性酶切及連接反應(yīng)

采用PstI/MseI對(duì)白蠟植物基因組DNA進(jìn)行雙酶切，0.8%的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2所示，酶切后，基因組DNA呈現(xiàn)連續(xù)均勻的彌散現(xiàn)象，表明DNA樣品完全酶切。酶切時(shí)間在酶切反應(yīng)中對(duì)酶切效果有重要的影響，酶切結(jié)果直接影響人工接頭的連接反應(yīng)和預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系。為了進(jìn)一步探討適合白蠟屬植物的酶切時(shí)間，本研究設(shè)置了7個(gè)不同時(shí)間酶切的梯度，圖2對(duì)比結(jié)果顯示，1～5 h酶切的帶型相近，基因組DNA呈顯連續(xù)均勻彌散狀；6～7 h后，基因組DNA條帶明顯減弱，因此圖2可以判斷出1 h即可將DNA樣品酶切充分，PstI/MseI酶切組合適合白蠟基因組DNA的AFLP標(biāo)記分析。

圖2 雙酶切時(shí)間梯度對(duì)比效果M: DL 2 000 Marker；1～7 :1、2、3、4、6、8 、10 h 時(shí)間梯度Fig.2 Effect of double enzyme time gradient.M: DL 2 000 Marker; 1-7 :1、2、3、4、6、8 、10 h time gradient

2.3 預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)

PstI和MseI接頭與PstI/MseI雙酶切片段連接后，利用預(yù)擴(kuò)增引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，圖3擴(kuò)增結(jié)果顯示，預(yù)擴(kuò)增片段主要集中在100～2 000 bp范圍內(nèi)，預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物呈連續(xù)彌散均勻亮帶，不同白蠟樣品間預(yù)擴(kuò)增帶型比較一致，表明PstI和MseI接頭與PstI/MseI雙酶切片段已連接上，預(yù)擴(kuò)增結(jié)果較好，可為選擇性擴(kuò)增提供較好地的模板，應(yīng)用于AFLP選擇性擴(kuò)增分析。

圖3 預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖像Fig.3 Electrophoresis pattern of pre-amplified product

2.4 白蠟種質(zhì)AFLP擴(kuò)增片段的多態(tài)性及遺傳分析

從64對(duì)PstI/MseⅠ引物組合中篩選出8對(duì)穩(wěn)定性好、多態(tài)性高且?guī)颓逦腁FLP引物組合，對(duì)供試90份白蠟種質(zhì)基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增與分析，結(jié)果見圖1和表2。8對(duì)引物組合擴(kuò)增出1630帶條，其中多態(tài)性條帶為1399條，平均多態(tài)位點(diǎn)百分率為85.8%。8對(duì)不同引物組合擴(kuò)增效率存在一定的差異，其中引物組合GAG/CAG 效率最高，多態(tài)位點(diǎn)百分率達(dá)95.8%，引物組合GTG/CTC 最低，多態(tài)位點(diǎn)百分率為72.1%；平均每對(duì)引物擴(kuò)增條帶203.8條，其中多態(tài)性條帶174.9條。結(jié)果表明，供試絨毛白蠟種質(zhì)間的AFLP變異大，多態(tài)性高。

本研究利用POPGENE 3.2軟件對(duì)各位點(diǎn)的遺傳多樣性參數(shù)進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果表明， 90份白蠟種質(zhì)用8對(duì)引物進(jìn)行遺傳多樣性分析，共檢測(cè)到16個(gè)等位基因，每對(duì)引物檢測(cè)到等位基因數(shù)目相等為2個(gè)；平均有效等位基因數(shù)為1.258 8，引物GTG/CTT的有效等位基因數(shù)最小為1.236 0，而引物GAG/CAA的最大為1.275 9；Nei’s 遺傳多樣性指數(shù)為0.171 7；Shannon信息指數(shù)范圍為0.286 9（見表2），說(shuō)明90份白蠟種質(zhì)間存在遺傳變異。

表2 絨毛白蠟AFLP 分析結(jié)果?Table 2 Results of AFLP analysis of Fraxinus velutina

2.5 供試種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)及聚類分析

通過AFLP檢測(cè)結(jié)果分析，90份絨毛白蠟材料的遺傳相似系數(shù)的變異范圍為0.707 2～0.888 9。由相似系數(shù)矩陣可以看出，在供試的90份白蠟材料中，B75與B77的遺傳相似系數(shù)最大，為0.888 9，其遺傳距離最小為0.111 1，說(shuō)明其兩者間的親緣關(guān)系最近；而B24與B68之間的遺傳相似系數(shù)最小，為0.7072，其遺傳距離也最大為0.212 8。由遺傳相似系數(shù)分析可知，供試材料間的遺傳相似系數(shù)變化較大， 具有較為豐富的遺傳多樣性。

基于遺傳相似系數(shù)，對(duì)90份白蠟種質(zhì)采用UPGMA聚類分析并繪制樹狀圖，結(jié)果見圖4。從聚類圖可以看出，以相似系數(shù)0.74 為標(biāo)準(zhǔn)可以將90個(gè)白蠟種質(zhì)分為如下兩大類。第1大類只有一個(gè)種質(zhì)B24，該種質(zhì)是課題組從陜西太白山收集的野生資源宿柱白蠟。第2大類包括89個(gè)種質(zhì)，劃分為兩個(gè)亞類。第1亞類也僅有一個(gè)種質(zhì)B71，甘肅天水收集的野生資源，中國(guó)白蠟。第2亞類包括88個(gè)種質(zhì)，以相似系數(shù)0.762 為標(biāo)準(zhǔn)可以將88個(gè)白蠟種質(zhì)分3組。

第1組由50個(gè)種質(zhì)組成，其中山東38個(gè)種質(zhì)，包括絨毛白蠟、美國(guó)紅梣和美國(guó)白蠟的新品種（紅葉白蠟）；北京7個(gè)種質(zhì)，包括美國(guó)紅梣、絨毛白蠟和美國(guó)白蠟的新品種（秋紫白蠟、秋火白蠟和秋歡白蠟）；陜西2個(gè)種質(zhì)，絨毛白蠟和美國(guó)紅梣；新疆3個(gè)種質(zhì)，包括美國(guó)白蠟和美國(guó)白蠟的新品種（紅葉白蠟、、秋紫白蠟、秋火白蠟和秋歡白蠟）。

第2組由21個(gè)種質(zhì)組成，其中山東6個(gè)種質(zhì)，包括新疆小葉白蠟、水曲柳、狹葉白蠟和狹葉白蠟的新品種（冬紅白蠟）、歐洲白蠟；北京6個(gè)種質(zhì)，包括歐洲白蠟的新品種（金葉白蠟、賈斯白蠟、地圖白蠟、垂枝白蠟、柱形白蠟）和水曲柳，陜西3個(gè)種質(zhì)，包括歐洲白蠟和水曲柳；新疆2個(gè)種質(zhì)為新疆小葉白蠟；甘肅2個(gè)種質(zhì)為象蠟樹；湖南1個(gè)種質(zhì)為對(duì)節(jié)白蠟；黑龍江1個(gè)種質(zhì)為水曲柳。B3山東東營(yíng)的新疆小葉白蠟和B4新疆烏魯木齊的新疆小葉白蠟親緣關(guān)系較近，而與B7的較遠(yuǎn)，B3的種質(zhì)可能來(lái)源于新疆烏魯木齊；象蠟樹與水曲柳的親緣關(guān)系較近，B2與其它三個(gè)水曲柳的關(guān)系較遠(yuǎn)；歐洲白蠟與狹葉白蠟親緣關(guān)系較近，狹葉白蠟新品種冬紅白蠟與B85狹葉白蠟距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明新品種變異較大。B48對(duì)節(jié)白蠟單獨(dú)為一支。

第3組由17個(gè)種質(zhì)組成，其中山東4個(gè)種質(zhì)包括花曲柳和中國(guó)白蠟；北京2個(gè)種質(zhì)為中國(guó)白蠟；湖南1個(gè)種質(zhì)為中國(guó)白蠟；陜西10個(gè)種質(zhì)，包括秦嶺梣、窄葉白蠟、廬山白蠟和2個(gè)未命名種質(zhì)分別為B1和B13。未命名種質(zhì)B1與B65、B66和B67秦嶺梣聚為一支；未命名種質(zhì)B13和B15中國(guó)白蠟聚為一支。廬山白蠟、花曲柳和窄葉白蠟聚為一支。

3 結(jié)論與討論

多態(tài)帶百分率（P）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Nei’s基因多樣性（H）與Shannon信息指數(shù)（I）是衡量植物遺傳多樣性常用指標(biāo)[19]。本試驗(yàn)中多態(tài)位點(diǎn)指數(shù)范圍為72.1%～95.8%，平均值為85.8%，位點(diǎn)多態(tài)性良好；有效等位基因數(shù)為1.258 8，Nei’s基因多樣性為 0.171 7，Shannon 信息指數(shù)為0.286 9，在分子水平上顯示了白蠟種質(zhì)資源具有較高的遺傳多樣性。這與胡春龍[20]用11對(duì)SSR引物對(duì)46 份白蠟種質(zhì)擴(kuò)增所得82.93%的多態(tài)性比率較接近，低于王建兵[21]用10 對(duì)SSR引物對(duì)12 份白蠟種質(zhì)親本擴(kuò)增所得100%的多態(tài)性比率。采用不同的分子標(biāo)記方法獲得多態(tài)性有明顯差異，遺傳多樣性越高，其遺傳背景越復(fù)雜，表明該物種存在的歷史越悠久[22]。

至今對(duì)白蠟品種資源的分類還沒有統(tǒng)一的方法，本試驗(yàn)根據(jù)樹狀分類圖和樣品間的遺傳相似系數(shù)，將90個(gè)種質(zhì)分成2大類，第2大類包括89個(gè)種質(zhì)，劃分為兩個(gè)亞類。第1亞類僅有一個(gè)種質(zhì)。第2亞類包括88個(gè)種質(zhì)，以相似系數(shù)0.762 為標(biāo)準(zhǔn)可以將88個(gè)白蠟種質(zhì)分3組。從本研究的聚類圖中第1組可以看出，絨毛白蠟、美國(guó)紅梣和的美國(guó)白蠟聚為一類，這說(shuō)明3個(gè)種的親緣關(guān)系很近，有共同的系統(tǒng)來(lái)源，這與中國(guó)樹木志[23]、山東木本植物志[24]和山東木本植物精要[25]的分類一致。第2組象蠟樹、新疆小葉白蠟、歐洲白蠟、水曲柳、狹葉白蠟和對(duì)節(jié)白蠟6個(gè)種聚為一類；山東木本植物精要中將歐洲白蠟、水曲柳和狹葉白蠟聚為一組，對(duì)節(jié)白蠟單獨(dú)為一支；而中國(guó)樹木志中將象蠟樹、對(duì)節(jié)白蠟、新疆小葉白蠟和水曲柳聚為一類，花有花萼的對(duì)節(jié)白蠟和象蠟樹聚為一支，花無(wú)花萼的新疆小葉白蠟和水曲柳聚為一支，關(guān)于對(duì)節(jié)白蠟和象蠟樹的分類地位還需進(jìn)一步研究。第3組秦嶺梣、廬山白蠟、花曲柳、中國(guó)白蠟、和窄葉白蠟5個(gè)種聚為一類，這與中國(guó)植物志中分類一致，秦嶺梣和廬山白蠟親緣關(guān)系較近，花曲柳、中國(guó)白蠟、和窄葉白蠟親緣關(guān)系較近；其中未命名種質(zhì)B1與B65、B66和B67秦嶺梣親緣關(guān)系較近；未命名種質(zhì)B13和B15中國(guó)白蠟聚為一支，結(jié)合形態(tài)特征推測(cè)B1為秦嶺梣，B13為中國(guó)白蠟。

總體來(lái)看，本研究中聚類分析結(jié)果與植物形態(tài)學(xué)分類基本上一致，進(jìn)一步說(shuō)明了AFLP分子標(biāo)記的多態(tài)性與形態(tài)表型的多樣性一致；而在少數(shù)白蠟種上的差異，造成這種現(xiàn)象的原因，可能為同名異物，或是白蠟品種的起源和親緣關(guān)系較為復(fù)雜所致，也可能是因?yàn)榈貐^(qū)之間白蠟品種的廣泛交流導(dǎo)致了某些基因在不同地區(qū)種質(zhì)間的滲入，或者引種過程中對(duì)種質(zhì)的來(lái)源地沒有調(diào)查清楚，反映出不同分類或聚類指標(biāo)可能會(huì)產(chǎn)生不同的結(jié)果[26-28]。而分子標(biāo)記能反映遺傳上的差異，本研究利用AFLP標(biāo)記技術(shù)初步揭示了白蠟種源的親緣關(guān)系和遺傳多樣性，為進(jìn)一步對(duì)白蠟種源進(jìn)行遺傳多樣性分析和白蠟育種奠定了基礎(chǔ)，更適合為育種服務(wù)。

目前，針對(duì)可應(yīng)用于白蠟種質(zhì)分子方面研究較少，還有2個(gè)未命名的種質(zhì)，需要進(jìn)一步通過表性特征和分子水平相結(jié)合進(jìn)行鑒定。因而還需加大開發(fā)白蠟其它分子標(biāo)記研究，因?yàn)榉肿訕?biāo)記技術(shù)具有擴(kuò)增條帶統(tǒng)計(jì)誤差較大等缺點(diǎn)，不能真實(shí)地反映植物樣本遺傳多態(tài)性，所以在今后研究中，需繼續(xù)開展不同種質(zhì)間分子標(biāo)記技術(shù)比較，再結(jié)合其它鑒定方法，才能更加全面、準(zhǔn)確地反映白蠟遺傳多樣性。

[1]胡春龍,張 晨,劉翠蘭,等.基于SSR標(biāo)記構(gòu)建白蠟種質(zhì)資源分子身份證[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué),2015(5):6-9,22.

[2]燕麗萍,劉翠蘭,李 麗,等.耐鹽絨毛白蠟特異性SCAR分子標(biāo)記的鑒定[J].西北植物學(xué)報(bào),2014,34(4):671-675.

[3]孟昭和,劉德璽.絨毛白蠟引種研究現(xiàn)狀[J].林業(yè)科技通訊,2001(1):17-21.

[4]劉 歡,張新全,馬 嘯,等.基于熒光檢測(cè)技術(shù)的多花黑麥草EST-SSR指紋圖譜的構(gòu)建[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2017,50(3):437-450.

[5]洪亞平,代子聞,陳之端,等.木犀科梣屬(Fraxinus)三心皮子房的確證及其系統(tǒng)學(xué)意義[J].河南林業(yè)科技, 2004,24(1):43-40.

[6]BOLARIC S, BARTH S, MELCHINGER A E,et al.Genetic diversity in European perennial ryegrass cultivars investigated with RAPD makers[J].Plant Breeding, 2005, 124(2):161-166.

[7]ROLDAN-RUIZ I, VAN EUWIJK F A, GILLILAND T J,et al.A comparative study of molecular and morphological methods of describing relationships between perennial ryegrass (Lolium perenneL.) varieties[J].Theoretical and Applied Genetics, 2001,103(8):1138-1150.

[8]Zabeau M, Vos P.Selective restriction fragment amplification:a general method for DNA fingerprinting.Euro-pean Patent Application, 1993,No.92402629, Publication No.534- 858.

[9]Vos P, Hogers V P, Bleeker R,et al.AFLP: A new technique for DNA finger printing[J].Nucleic Acids Research, 1995, 23:4407-4414.

[10]Tosto D S, Hopp H E.Suitability of AFLP markers for the study of genomic relationships within theOxalis tuberosaalliance[J].Plant Systematics and Evolution, 2000, 223:201-209.

[11]梁國(guó)校,劉 凱,馬錦林,等.香花油茶分子分類與鑒定[J].經(jīng)濟(jì)林研究,2017,35(1):26-29.

[12]李善文,張有慧,張志毅,等.楊屬部分種及雜種的AFLP分析[J].林業(yè)科學(xué),2007,43(1):35-41.

[13]楊朝東,王 健,張俊衛(wèi),等.梅花不同樣本間親緣關(guān)系的AFLP初步分析[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2005,38(10): 2084-2089.

[14]Beedanagari S R, Dove S K, Wood B W,et al.A first linkage map of pecan cultivars based on RAPD and AFLP markers[J].Theoretical and Applied Genetics, 2005, 110: 1127-1137.

[15]HEUERTZ M S.FINESRHI, M.ANZIDEI,et al.Chloroplast DNA variation and postglacial recolonization of common ash(Fraxinus excelsiorL.) in Europe[J].Molecular Ecology,2004,13(11): 3437-3452.

[16]Bacles C F, Ennos R A.Paternity analysis of pollen-mediated gene flow forFraxinus excelsiorL.in a chronically fragmented landscape[J].Heredity,2008,101:368-380.

[17]Goto S K, Shimatani H, YoshimaruY,et al.Fat-tailed gene flow in the dioecious canopy tree speciesFraxinus mandshuricavar.japonica revealed by microsatellites[J].Molecular Ecology,2006,15(10):2985-2996.

[18]Murray M G, Thompson W F.Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J].Nucleic Acids Research,1980,8(19): 4321-4325.

[19]李春僑,周 龍,陸 彪,等.天山櫻桃野生居群遺傳多樣性SSR 分析[J].經(jīng)濟(jì)林研究,2017,35(3):44-49.

[20]胡春龍.基于SSR標(biāo)記構(gòu)建白蠟種質(zhì)資源分子身份證及其遺傳多樣性分析[D].泰安:山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2015.

[21]王健兵.白蠟核心種質(zhì)及絨毛白蠟無(wú)性系SSR評(píng)價(jià)體系建立[D].蘭州:甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué),2014.

[22]李俊麗,向長(zhǎng)萍,張宏榮,等.南瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性的RAPD分析[J].園藝學(xué)報(bào),2005,32(5):834-839.

[23]鄭萬(wàn)鈞.中國(guó)樹木志[M].北京:中國(guó)林業(yè)出版社,2004:4389-4390.

[24]李法曾,李文清,樊守金.山東木本植物志(下卷)[M].北京:科學(xué)出版社,2016:251-252.

[25]臧德奎.山東木本植物精要[M].北京:中國(guó)林業(yè)出版社,2015: 51-252.

[26]謝 薈,祝文娟,張應(yīng)中,等.基于SRAP 分子標(biāo)記的廣寧紅花油茶種質(zhì)資源遺傳多樣性研究[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2017,37(8):93-97.

[27]沈 鏑,朱德蔚,李錫香.云南竽種質(zhì)資源遺傳多樣性的RAPD分析[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào),2005,4(3):449-453

[28]Hao Q, Liu Z A, Shu Q Y,et al.Studies on paeonia cultivars and hybrids identification based on SRAP analysis[J].Hereditas,2008,145(1):38-47.