鑒別鮑曼不動(dòng)桿菌定植與感染的臨床指標(biāo)研究

宋 駿，黃升海，鐘 民

鮑曼不動(dòng)桿菌是一種非發(fā)酵性的革蘭陰性桿菌，廣泛存在于自然環(huán)境中，可定植于人體皮膚、與外界相通的腔道中。文獻(xiàn)[1]報(bào)道，在入院48 h內(nèi)，約40%的普通患者可出現(xiàn)鮑曼不動(dòng)桿菌定植，而重癥患者可高達(dá)75%。鮑曼不動(dòng)桿菌定植是引起醫(yī)院院內(nèi)感染的高危因素，也是住院患者呼吸系統(tǒng)獲得性感染的重要來源。由于其對(duì)多數(shù)常用的抗菌藥物耐藥，發(fā)生感染后的及時(shí)治療非常關(guān)鍵，因此鑒別定植或感染，對(duì)于避免抗菌藥物的濫用和及時(shí)的抗菌治療具有重要意義。但是，針對(duì)住院患者痰等標(biāo)本培養(yǎng)出來的鮑曼不動(dòng)桿菌，目前國內(nèi)外尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)來判斷分離的是定植還是感染。研究[2-3]表明，鮑曼不動(dòng)桿菌感染可引起細(xì)胞免疫功能的改變，并導(dǎo)致多種細(xì)胞因子的表達(dá)水平發(fā)生顯著變化。因此，該研究通過檢測鮑曼不動(dòng)桿菌定植、感染患者的T淋巴細(xì)胞亞群、血清細(xì)胞因子水平，探討上述指標(biāo)在鑒別鮑曼不動(dòng)桿菌下呼吸道定植與感染中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1病例資料收集2016年1月～11月在皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院住院治療，且連續(xù)痰培養(yǎng)2次以上為鮑曼不動(dòng)桿菌優(yōu)勢(shì)生長的患者。根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)醫(yī)院獲得性肺炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)，分為定植組(觀察期間未出現(xiàn)醫(yī)院獲得性肺炎)和感染組(發(fā)生醫(yī)院獲得性肺炎)。排除標(biāo)準(zhǔn)如下：① 下呼吸道分泌物培養(yǎng)出現(xiàn)其他病原菌或在其他部位有感染的患者；② 使用激素類及免疫抑制類藥物治療期內(nèi)的患者；③ 病程小于2周患者。收集來源于同一醫(yī)院健康管理中心的體檢正常者50例作為對(duì)照。

1.2方法

1.2.1痰培養(yǎng) 取患者合格痰標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)，采用VITEK-2自動(dòng)微生物分析儀(法國生物梅里埃)，按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》中華人民共和國衛(wèi)生部醫(yī)政司(第3版)的檢驗(yàn)程序進(jìn)行細(xì)菌鑒定。

1.2.2標(biāo)本采集 清晨采用EDTA-K2抗凝的真空采血管和普通真空采血管，分別抽取空腹的住院患者與體檢者肘部靜脈血2、3 ml。

1.2.3T淋巴細(xì)胞亞群檢測 取5只流式管，編號(hào)為1、2、3、4、5，分別將100 μl抗凝全血或Immunotrol質(zhì)控血加入1～5號(hào)試管后，依次各加入20 μl的IgG1-FITC/IgG1-PE/IgG1-PC5于試管1；CD4-FITC于試管2；CD8-PE于試管3；CD3-PC5于試管4；CD4FITC/CD8PE/CD3PC5三種抗體混合加于試管5。振蕩混勻后，室溫避光反應(yīng)20 min；取出試管，每管加入500 μl Optilyse C，即刻震蕩混勻后，室溫避光反應(yīng)10～15 min，管內(nèi)液體透亮；每管加500 μl的PBS，震蕩混勻后，室溫避光反應(yīng)10 min后，即可上機(jī)檢測(若不能及時(shí)上機(jī)，4 ℃冰箱保存，24 h內(nèi)上機(jī)檢測)。采用流式細(xì)胞儀(FC-500，貝克曼，美國)分析和檢測。

1.2.4細(xì)胞因子檢測 按照試劑盒(Abnova公司)說明書操作，分別測定血清腫瘤壞死因子α(TNF-α)、γ干擾素(IFN-γ)、白細(xì)胞介素2(IL-2)、白細(xì)胞介素4(IL-4)和白細(xì)胞介素17(IL-17)水平。

2 結(jié)果

2.1對(duì)照組、鮑曼不動(dòng)桿菌定植組和感染組各項(xiàng)指標(biāo)的比較計(jì)量資料三組間兩兩比較結(jié)果顯示，感染組、定植組和對(duì)照組在年齡、性別上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。感染組CD3+、CD4+水平均低于定植組和對(duì)照組(P<0.05)，而定植組和對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；感染組CD4+/CD8+比值低于定植組和對(duì)照組(P<0.05);感染組TNF-α、IFN-γ和IL-17水平均高于定植組和對(duì)照組(P<0.05)，且定植組也高于對(duì)照組(P>0.05)；感染組和定植組IL-2、IL-4水平均高于對(duì)照組(P<0.05)，而感染組和定植組間差異無顯著性。見表1。

2.2鮑曼不動(dòng)桿菌感染與T淋巴細(xì)胞亞群、血清細(xì)胞因子水平的相關(guān)性Spearson相關(guān)分析表明，鮑曼不動(dòng)桿菌感染與TNF-α (rs=0.241，P=0.012)、IFN-γ (rs=0.235，P=0.014)、IL-2(rs=0.249，P=0.009)、IL-4 (rs=0.268，P=0.005)、IL-17 (rs=0.538，P=0.000)呈正相關(guān)性，與CD3+(rs=-0.193，P=0.045)、CD4+/CD8+(rs=-0.302，P=0.001))呈負(fù)相關(guān)性。

2.3鮑曼不動(dòng)桿菌感染的多因素Logistic回歸分析單因素Logistic回歸分析顯示，CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、TNF-α、IFN-γ和IL-17是鮑曼不動(dòng)桿菌的感染的因素(P<0.05)，而IL-2和IL-4對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的感染無影響(P>0.05)。根據(jù)納入(α=0.05)與排除(β=0.10)標(biāo)準(zhǔn)，CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、TNF-α、IFN-γ和IL-17 6個(gè)因素進(jìn)入多因素Logistic回歸分析(逐步回歸法)顯示，IL-17(OR=1.511)和IFN-γ(OR=1.420)是鮑曼不動(dòng)桿菌的感染的危險(xiǎn)因素(P<0.05)；CD4+/CD8+(OR=0.025)、CD4+(OR=0.854)和CD3+(OR=0.885)是鮑曼不動(dòng)桿菌的感染的保護(hù)因素(P<0.05)。見表2。

表1 對(duì)照組、鮑曼不動(dòng)桿菌定植組和感染組多項(xiàng)指標(biāo)的比較

與對(duì)照組比較：*P<0.05；與定植組比較：*P<0.05

表2 鮑曼不動(dòng)桿菌感染的多因素Logistic回歸分析

3 討論

鮑曼不動(dòng)桿菌在各種環(huán)境中均易于生存和繁殖。隨著各類抗菌藥物的廣泛使用，多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的感染發(fā)生率也出現(xiàn)顯著增加[4]。尤其在免疫力低下的患者中，由于缺乏有效的藥物治療，其安全和醫(yī)療質(zhì)量受到極大的影響[5-6]。細(xì)菌定植是發(fā)生醫(yī)院院內(nèi)感染的先兆，及時(shí)發(fā)現(xiàn)鮑曼不動(dòng)桿菌的定植并采取相應(yīng)措施控制其感染意義重大，但根據(jù)患者的初期臨床表現(xiàn)或者細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果無法確定為感染菌或定植菌[7-8]。本研究期望從免疫水平方向?qū)ふ乙恍┯辛Φ淖C據(jù)。

研究[9]表明鮑曼不動(dòng)桿菌的感染往往可引起患者局部和全身的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子水平的改變。在機(jī)體免疫系統(tǒng)中，T淋巴細(xì)胞具有重要功能的一個(gè)細(xì)胞群，依據(jù)其細(xì)胞表面抗原可分為不同的亞群。當(dāng)機(jī)體免疫功能異常，例如細(xì)菌感染時(shí)，T淋巴細(xì)胞亞群可發(fā)生數(shù)量的改變[10]。CD3+代表的是成熟的活性T淋巴細(xì)胞，是細(xì)胞免疫中主要的活性細(xì)胞，CD3+細(xì)胞又可進(jìn)一步被分為輔助性T淋巴細(xì)胞(CD3+CD4+)和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CD3+CD8+)。研究[10]表明CD4+/CD8+的比值是評(píng)估機(jī)體內(nèi)免疫平衡的敏感指標(biāo)，該比值的下降往往提示機(jī)體免疫功能的降低。Jeong et al[11]發(fā)現(xiàn)，在機(jī)會(huì)致病菌(包括鮑曼不動(dòng)桿菌)引起院內(nèi)感染的高齡患者中，死亡患者的CD4+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量及CD4+/CD8+的比值均呈現(xiàn)顯著下降。本研究的結(jié)果顯示，鮑曼不動(dòng)桿菌感染患者的CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量及CD4+/CD8+比值顯著低于鮑曼不動(dòng)桿菌定植患者和正常對(duì)照，并且鮑曼不動(dòng)桿菌感染與CD4+/CD8+比值存在負(fù)相關(guān)。

在小鼠模型中，經(jīng)氣管接種鮑曼不動(dòng)桿菌后，小鼠肺部可出現(xiàn)多種病理改變，并刺激產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，例如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12、IL-23等[12]。正常情況下CD4+T淋巴細(xì)胞通常處于前體狀態(tài)，在特異性抗原的刺激和不同細(xì)胞因子作用下可進(jìn)一步分化為Th1、Th2細(xì)胞。Th1型免疫反應(yīng)可增強(qiáng)機(jī)體對(duì)微生物感染的免疫能力和防御功能，而Th2型免疫反應(yīng)主要與感染的進(jìn)展、持續(xù)化和慢性化有關(guān)[13]。有研究[14]表明在鮑曼不動(dòng)桿菌感染可通過激活樹突狀細(xì)胞，刺激CD4+T淋巴細(xì)胞向Th1分化，引起Th1/Th2比值的升高。TNF-α、IFN-γ、主要由Th1細(xì)胞分泌產(chǎn)生，本研究觀察到鮑曼不動(dòng)桿菌感染組患者的血清TNF-α、IFN-γ水平顯著高于定植組以及對(duì)照組。IL-2、IL-4主要由Th2細(xì)胞分泌產(chǎn)生，所以在鮑曼不動(dòng)桿菌感染組和定植組之間，本研究未發(fā)現(xiàn)血清IL-2和IL-4水平存在顯著性差異。Spearson相關(guān)分析證實(shí)鮑曼不動(dòng)桿菌感染與血清TNF-α(rs= 0.241，P=0.012)、IFN-γ(rs= 0.235，P=0.014)水平存在正相關(guān)，與上述報(bào)道結(jié)果相一致。多因素Logistic回歸分析篩選出血清IFN-γ水平升高是鮑曼不動(dòng)桿菌感染的危險(xiǎn)因素。

Breslow et al[2]在鮑曼不動(dòng)桿菌肺部感染的小鼠模型中，可觀察到肺部組織中性粒細(xì)胞的大量募集，并且證實(shí)中性粒細(xì)胞是免疫應(yīng)答過程中主要的免疫細(xì)胞。鮑曼不動(dòng)桿菌感染后，IL-17通過誘導(dǎo)趨化因子的大量產(chǎn)生在中性粒細(xì)胞募集并最終清除細(xì)菌的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[15]。本研究顯示鮑曼不動(dòng)桿菌感染組患者血清IL-17(rs=0.538，P=0.000)水平顯著升高，并且與鮑曼不動(dòng)桿菌的感染存在正相關(guān)。多因素Logistic回歸分析篩選出血清IL-17水平升高是鮑曼不動(dòng)桿菌感染的危險(xiǎn)因素。

本研究還存在一定的不足。首先，在嚴(yán)格控制入選標(biāo)準(zhǔn)下納入的樣本量較?。黄浯?，來源于不同報(bào)道的血清細(xì)胞因子測定值差異較大，血清細(xì)胞因子的臨床檢測還有待進(jìn)一步的標(biāo)準(zhǔn)化；再次，由于鮑曼不動(dòng)桿菌定植與感染的判斷需要回顧性分析，目前尚無法進(jìn)行前瞻性隨訪研究。因此，T淋巴細(xì)胞亞群、血清細(xì)胞因子對(duì)鑒別鮑曼不動(dòng)桿菌定植與感染的臨床價(jià)值有待大樣本、多中心研究的進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，鮑曼不動(dòng)桿菌感染導(dǎo)致患者免疫系統(tǒng)功能發(fā)生明顯變化，與定植患者存在顯著差異，表現(xiàn)為CD4+/CD8+比值降低、血清TNF-α、IFN-γ及 IL-17顯著升高。血清IFN-γ、IL-17可作為鑒別鮑曼不動(dòng)桿菌感染與定植的指標(biāo)，并且可為抗菌藥物的合理使用以及醫(yī)院感染的預(yù)防、控制提供依據(jù)。

[1] Apisarnthanarak A, Pinitchai U, Thongphubeth K, et al. A multifaceted intervention to reduce pandrug-resistantAcinetobacterbaumanniicolonization and infection in 3 intensive care units in a Thai tertiary care center: a 3-year study[J]. Clin Infect Dis, 2008,47(6):760-7.

[2] Breslow J M, Meissler J J Jr, Hartzell R R, et al. Innate immune responses to systemicAcinetobacterbaumanniiinfection in mice: neutrophils, but not interleukin-17, mediate host resistance[J]. Infect Immun, 2011,79(8):3317-27.

[3] Jun S H, Lee J H, Kim B R, et al.Acinetobacterbaumanniiouter membrane vesicles elicit a potent innate immune responseviamembrane proteins[J]. PLoS One, 2013,8(8):e71751.

[4] 胡 偉, 張 婷, 孫 成, 等. 某三甲醫(yī)院2012-2015年抗菌藥物使用強(qiáng)度與鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性的相關(guān)性分析[J]. 安徽醫(yī)藥, 2017, 21(7):653-5.

[5] 宋曉萍, 陳佳紅, 翟軍清, 等. 青島地區(qū)重癥監(jiān)護(hù)病房分離的鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥特征及碳青霉烯酶基因型的研究[J]. 中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2017, 40(3):216-20.

[6] 趙洪峰, 任淑華, 蔡藝飛. ICU患者鮑氏不動(dòng)桿菌定植感染的調(diào)查分析[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志, 2012, 22(4):693-5.

[7] 白國強(qiáng), 董 磊, 李 昂, 等. 鮑曼不動(dòng)桿菌定植與感染鑒定方法的對(duì)照研究[J]. 臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 12(21):1705-8.

[8] 韓忠學(xué), 劉 靜, 鞏 靜. 降鈣素原在鮑曼不動(dòng)桿菌定植與感染鑒別中的應(yīng)用[J]. 國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2017, 38(3):407-8.

[9] 陳 淼, 鄒志玲, 陳雪梅. 鮑曼不動(dòng)桿菌感染和IL-17介導(dǎo)的免疫過程[J]. 國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2017, 38(4):514-6.

[10] 陳少艷, 劉基鐸, 肖明鋒, 等. 淋巴細(xì)胞亞群檢測在感染性疾病中的應(yīng)用[J].國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2017, 38(2):206-8.

[11] Jeong S J, Yoon S S, Han S H, et al.Evaluation of humoral immune response to nosocomial pathogen and functional status in elderly patients with sepsis[J]. Arch Gerontol Geriatr, 2014,58(1):10-4.

[12] 張瑞凌，冼 盈，張扣興. 鮑曼不動(dòng)桿菌感染與免疫研究進(jìn)展[J].中國感染與化療雜志,2017, 17(2):224-8.

[13] de Breij A, Dijkshoorn L, Lagendijk E, et al.Do biofilm formation and interactions with human cells explain the clinical success ofAcinetobacterbaumannii[J], PLoS One, 2010,5(5):e10732.

[14] Lee J S, Lee J C, Lee C M, et al. Outer membrane protein A ofAcinetobacterbaumanniiinduces differentiation of CD4+T cells toward a Th1 polarizing phenotype through the activation of dendritic cells[J]. Biochem Pharmacol, 2007,74(1):86-97.

[15] Yan Z, Yang J, Hu R, et al.Acinetobacterbaumanniiinfection and IL-17 mediated immunity[J]. Mediators Inflamm,2016,2016:9834020.