腮腺阻塞性萎縮動(dòng)物模型細(xì)胞凋亡及再生的研究

魏月端 左金華 唐學(xué)敏 王晶 朱玉紅 王麗芳 丁長(zhǎng)玲 毛玉龍

涎腺萎縮以腺泡萎縮最為明顯，造成唾液腺分泌功能障礙，可引起口腔粘膜炎癥，影響語(yǔ)音、吞咽、味覺(jué)等，嚴(yán)重時(shí)可發(fā)生齲病、牙周病等［1］器質(zhì)性損傷。如何促進(jìn)萎縮的腺體組織恢復(fù)，是目前口腔醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)之一。本文就結(jié)扎腮腺主導(dǎo)管后實(shí)現(xiàn)再通，誘導(dǎo)腮腺組織萎縮后再生的大鼠腮腺模型，探究腺體萎縮后腮腺實(shí)質(zhì)細(xì)胞再生的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

一抗:PCNA單克隆抗體(ab92552)、P53多克隆抗體(ab131442)(Abcam公司，英國(guó));HE染色試劑盒(上海諾倫生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司);一步法Tunel細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(綠色FITC標(biāo)記熒光檢測(cè)法，通用型，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司);Fluorescent Mounting Medium with DAPI(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);激光共聚焦顯微鏡(Leica，SP5Ⅱ，德國(guó))。

1.2 建立動(dòng)物模型

成年雄性Wistar大鼠204只，體重約(200±20)g(濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司)，隨機(jī)分實(shí)驗(yàn)組(198)、對(duì)照組(6只)。結(jié)扎實(shí)驗(yàn)組大鼠右側(cè)腮腺主導(dǎo)管，于結(jié)扎7 d(A組)、14 d(B組)、21 d(C組)后(n=66)，實(shí)現(xiàn)腮腺導(dǎo)管再通，并分別于再通后第0、1、3、5、7、10、14、21、28、60、90 天處死大鼠(n=6)，獲取新鮮腮腺組織，標(biāo)本于4%多聚甲醛溶液中固定后制備石蠟塊;對(duì)照組只解剖分離出腮腺主導(dǎo)管，然后關(guān)閉創(chuàng)口。

1.3 HE 染色

制備4μm厚石蠟切片，按照HE染色試劑盒要求進(jìn)行操作，其中蘇木素染色6 min，1%鹽酸酒精分化12 s，返藍(lán)15 min，尹紅染色30 s，封片后置于顯微鏡下觀察、拍照。

1.4 免疫組化染色

制備4μm厚石蠟切片，按照兩步法免疫組化說(shuō)明書(shū)操作，一抗?jié)舛认♂?∶100，4℃過(guò)夜，DAB顯色，陰性對(duì)照片采用一抗稀釋液PBS。封片后，顯微鏡下觀察染色結(jié)果，每張片子選取5個(gè)不重疊視野拍照，計(jì)算PCNA、P53平均灰度值。

1.5 Tunel細(xì)胞凋亡檢測(cè)

制備4μm厚石蠟切片，按照一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒要求脫蠟、脫水，TdT酶反應(yīng)液、熒光標(biāo)記液現(xiàn)用現(xiàn)配，37℃避光反應(yīng)。含DAPI防熒光淬滅封片劑封片后使用激光共聚焦顯微鏡觀察、拍照。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)值均被表達(dá)為珋x±s。各組組內(nèi)差異的比較采用LSD法單因素方差分析，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織學(xué)觀察結(jié)果

腮腺主導(dǎo)管結(jié)扎7 d后(A組)，腺泡萎縮、導(dǎo)管擴(kuò)張，腺泡/導(dǎo)管比例、腺小葉體積較正常組織降低，再通后第3天，腺泡數(shù)量明顯增多，主要由未成熟的腺泡和剩余腺泡組成，再通后第10天，腺泡/導(dǎo)管比例幾乎與正常組織無(wú)差別，再通14 d后，腮腺組織基本完全恢復(fù)正常;腮腺主導(dǎo)管結(jié)扎14 d時(shí)(B組)，以大量擴(kuò)張的導(dǎo)管結(jié)構(gòu)為主，腺泡結(jié)構(gòu)明顯減少，再通第5天，擴(kuò)張的導(dǎo)管明顯縮小，腺泡細(xì)胞大量增殖，再通第14天，腺泡細(xì)胞填滿閏管和紋狀管之間的間隙，但是腺泡細(xì)之間的連接較為疏松，再通第21天時(shí)，腺泡與導(dǎo)管比例合適，腺小葉結(jié)構(gòu)較緊密，與正常腺體組織基本相似;腮腺主導(dǎo)管結(jié)扎21 d時(shí)(C組)，導(dǎo)管增殖、擴(kuò)張更加明顯，腺泡細(xì)胞很少，僅在腺小葉邊緣可見(jiàn)剩余腺泡，隨著再通時(shí)間延長(zhǎng)，未出現(xiàn)上訴A、B兩組腮腺組織明顯逐漸恢復(fù)的現(xiàn)象，部分組腮腺組織甚至逐漸被脂肪等結(jié)締組織取代(圖1)。

2.2 免疫組化學(xué)觀察結(jié)果

PCNA及P53蛋白在腮腺內(nèi)的表達(dá)見(jiàn)圖 2～3(PCNA蛋白主要表達(dá)于腮腺腺泡細(xì)胞核，P53蛋白主要表達(dá)于腮腺腺泡細(xì)胞質(zhì))。腮腺主導(dǎo)管結(jié)扎7 d后，導(dǎo)管擴(kuò)張?jiān)鲋?，腺泡?xì)胞萎縮凋亡，PCNA及P53陽(yáng)性表達(dá)率較低，再通后第3天，腺泡細(xì)胞大量增生，可見(jiàn)腺泡細(xì)胞核內(nèi)大量陽(yáng)性表達(dá)的PCNA，導(dǎo)管凋亡逐漸增多，P53陽(yáng)性表達(dá)，再通第10天，PCNA、P53趨于穩(wěn)定，再通第14天，免疫指標(biāo)與正常對(duì)照組無(wú)異;腮腺主導(dǎo)管結(jié)扎14 d后，導(dǎo)管及腺泡均可見(jiàn)P53陽(yáng)性表達(dá)，PCNA陽(yáng)性表達(dá)主要在導(dǎo)管細(xì)胞，再通后第5天，未成熟腺泡及剩余腺泡大量增殖，PCNA高表達(dá)，導(dǎo)管細(xì)胞凋亡為主，P53陽(yáng)性表達(dá)，再通后第14天，PCNA、P53表達(dá)趨于穩(wěn)定，再通后第21天，PCNA、P53表達(dá)指標(biāo)與正常對(duì)照組無(wú)差別;腮腺主導(dǎo)管結(jié)扎21 d后，PCNA在導(dǎo)管細(xì)胞高表達(dá)，導(dǎo)管之間的纖維結(jié)締組織可見(jiàn)P53陽(yáng)性表達(dá)，隨再通時(shí)間延長(zhǎng)，PCNA、P53表達(dá)量無(wú)明顯的曲線規(guī)律變化，且觀察至再通后90 d，未發(fā)現(xiàn)萎縮的腮腺恢復(fù)至正常。

2.3 細(xì)胞凋亡率

正常腮腺中，凋亡細(xì)胞(綠色熒光信號(hào)標(biāo)記)較少，導(dǎo)管結(jié)扎后，凋亡細(xì)胞明顯增多，主要表達(dá)在腺泡區(qū)域，且隨導(dǎo)管結(jié)扎延長(zhǎng)，凋亡的細(xì)胞相應(yīng)的增多(P＜0.01)，導(dǎo)管再通后，凋亡細(xì)胞比例逐漸降低，A組再通第14天、B組再通第21天的凋亡細(xì)胞數(shù)量與正常組織接近，隨著再通時(shí)間繼續(xù)增加，凋亡細(xì)胞數(shù)量未見(jiàn)明顯的波動(dòng)。C組凋亡細(xì)胞隨再通時(shí)間延長(zhǎng)，數(shù)量變化高低不穩(wěn)定，整體呈下降趨勢(shì)，但是再通第28～90 d，凋亡細(xì)胞數(shù)量始終未達(dá)到正常對(duì)照組水平(圖4)。

3 討論

慢性阻塞性涎腺疾病是一種較為常見(jiàn)的涎腺慢性炎癥，常見(jiàn)病因有導(dǎo)管結(jié)石、導(dǎo)管狹窄、腫瘤壓迫等。由于唾液排出障礙及口腔內(nèi)致病菌逆行感染等，腺體常常反復(fù)腫脹、流膿。針對(duì)較為嚴(yán)重的慢性阻塞性涎腺疾病的治療，目前普遍傾向于手術(shù)摘除腺體。但是，摘除腺體后所帶來(lái)的口干等并發(fā)癥嚴(yán)重影響患者日常生活。當(dāng)下還沒(méi)有一種被廣泛認(rèn)可的治療方式逆轉(zhuǎn)腺體損傷，不能從根本上治愈該疾病。

圖1 組織學(xué)觀察 (HE，×400)Fig 1 Histological observation (HE，×400)

圖2 PCNA表達(dá) (IHC，×400)Fig 2 PCNA expression (IHC，×400)

圖3 P53表達(dá) (IHC，×400)Fig 3 P53 expression (IHC，×400)

圖4 細(xì)胞凋亡率Fig 4 Cell apoptosis(Tunel fluorescence detection)

正常腮腺細(xì)胞是分支形態(tài)、高分化的終末細(xì)胞，雖然分化能力較低，但是因腮腺內(nèi)含有成體干細(xì)胞［2］(salivary gland adult stem cell，SGASC)，賦予腮腺組織自我修復(fù)的潛能。SGASC主要分布于較大的排泄管［3］，其分布的不均勻性決定了腮腺組織損傷后恢復(fù)的速度和程度。正常情況下，腮腺組織保持凋亡與增殖的平衡，干細(xì)胞處于相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)，只有當(dāng)損傷發(fā)生時(shí)，機(jī)體內(nèi)信號(hào)分子才廣泛活躍，激活干細(xì)胞參與修復(fù)機(jī)體損傷。PCNA是一種僅在增殖細(xì)胞中合成和表達(dá)的核蛋白，分為可溶性和不溶性2種，其中不溶性PCNA表達(dá)量的變化與DNA合成一致。大鼠肝部分切除誘導(dǎo)肝再生實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，PCNA可作為分析細(xì)胞增殖測(cè)試的精確指標(biāo)，是一個(gè)分析組織再生的有效參數(shù)［4］。隨著分子醫(yī)學(xué)的進(jìn)展，PCNA有可能成為癌癥患者隨訪、預(yù)后、治療等的分子靶點(diǎn)。Xiang等［5］的研究證實(shí)，頜下腺經(jīng)放射損傷后，去氧腎上腺素活化α1受體，可有效提高提高細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。該研究為治療唾液腺疾病提供另一個(gè)新的靶點(diǎn)。

凋亡存在于很多生物學(xué)現(xiàn)象，并起到非常重要的作用，與有絲分裂增殖互補(bǔ)相對(duì)，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞群。P53和Fasl過(guò)表達(dá)是凋亡活躍性的標(biāo)志［6］。(murine double minute gene 2，MDM2)通過(guò)結(jié)合P53基因啟動(dòng)子，抑制P53轉(zhuǎn)錄，MDM2表達(dá)下調(diào)，P53表達(dá)增加;前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)通過(guò)增加P53基因轉(zhuǎn)錄活性和表達(dá)Fasl誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;P53也可以誘導(dǎo)Fasl表達(dá)激活外源性凋亡途徑刺激凋亡;P53表達(dá)增加，可上調(diào)Bax的表達(dá)水平，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)共同完成促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用。

本研究觀察到:腮腺主導(dǎo)管結(jié)扎可誘導(dǎo)腮腺萎縮，此點(diǎn)在高紅等［7］的研究已報(bào)道過(guò)，腺體萎縮從腺小葉中心開(kāi)始，逐漸向周圍延展，并且隨著結(jié)扎時(shí)間延長(zhǎng)，P53表達(dá)量越高，誘導(dǎo)腺體萎縮越嚴(yán)重?？赡苁怯捎谌僦鲗?dǎo)管結(jié)扎后，導(dǎo)管內(nèi)壓力持續(xù)性增大所致。再通后，腺體萎縮可在一定時(shí)間內(nèi)逆轉(zhuǎn)。腮腺主導(dǎo)管結(jié)扎7 d組與14 d組再通后，可明顯觀察到腺體逐漸恢復(fù)現(xiàn)象，表現(xiàn)為腺泡內(nèi)PCNA表達(dá)量逐漸升高，促進(jìn)腺泡細(xì)胞增殖，擴(kuò)張的導(dǎo)管逐漸減少并恢復(fù)正常，腺小葉排列由紊亂恢復(fù)正常，腺泡/導(dǎo)管比例逐漸接近對(duì)照組，且主導(dǎo)管結(jié)扎7 d組比14 d組恢復(fù)時(shí)間短，速度快;腮腺主導(dǎo)管結(jié)扎21 d組再通后，腺泡細(xì)胞數(shù)量非常少，擴(kuò)張的導(dǎo)管幾乎占據(jù)全部腺小葉，隨著再通時(shí)間延長(zhǎng)，未出現(xiàn)明顯的、規(guī)律性的腺小葉恢復(fù)情況，甚至有的分組觀察到涎腺組織結(jié)構(gòu)被脂肪組織、纖維結(jié)締組織替代。潘光華等［8］誘導(dǎo)頜下腺損傷后再生的模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:涎腺增殖部位的細(xì)胞具有干細(xì)胞/祖細(xì)胞特性。針對(duì)本實(shí)驗(yàn)，A、B組可實(shí)現(xiàn)腮腺再生，而C組失敗，可能是由于A、B組結(jié)扎時(shí)間較短，腮腺內(nèi)有足夠的干細(xì)胞分化、增殖，彌補(bǔ)因凋亡引起的細(xì)胞損失，但是，C組結(jié)扎時(shí)間較久，腺體內(nèi)大多數(shù)甚至全部的干細(xì)胞遭到破壞，無(wú)法分化形成新的細(xì)胞，導(dǎo)致腺體萎縮?？傊僦鲗?dǎo)管結(jié)扎后，P53表達(dá)水平增高，可促進(jìn)腺體的萎縮;導(dǎo)管再通后，PCNA表達(dá)水平增高，促進(jìn)萎縮的腺泡細(xì)胞再生。PCNA、P53可作為評(píng)價(jià)慢性萎縮性腮腺炎治療時(shí)機(jī)的分子依據(jù)，并有可能作為評(píng)價(jià)腮腺再生手術(shù)可行性及效果的觀測(cè)指標(biāo)。Takahashi等［9］的研究也證實(shí):腺體萎縮后，導(dǎo)管細(xì)胞增殖分化形成新的細(xì)胞彌補(bǔ)因凋亡消失的腺泡。腮腺萎縮后再生的速率較快，除干細(xì)胞的分化作用外，還有剩余腺泡細(xì)胞的自身增殖分裂補(bǔ)充。另外，研究顯示，動(dòng)物腮腺再生的模型與唾液腺胚胎發(fā)育的進(jìn)程相似［10］，特別是分泌蛋白，在兩者中的表達(dá)幾乎無(wú)差別。動(dòng)物腮腺組織經(jīng)試驗(yàn)誘導(dǎo)凋亡后可以恢復(fù)的能力，給人類治療腮腺損傷提供希望。

綜上，大鼠腮腺主導(dǎo)管結(jié)扎后在一定時(shí)間內(nèi)腮腺組織有再生的能力，這段期間腮腺組織的再通機(jī)制研究為臨床治療腮腺萎縮性疾病提供理論基礎(chǔ)，未來(lái)有可能發(fā)展為組織再生研究的重點(diǎn)。但是，腮腺主導(dǎo)管結(jié)扎時(shí)間超過(guò)組織干細(xì)胞分化的最低時(shí)限，則組織不能再生，需要考慮其他治療方式，如干細(xì)胞移植［11］、組織工程技術(shù)［12］等。

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