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    不同基質(zhì)溶液與滲透壓對(duì)PEG沉淀血清循環(huán)免疫復(fù)合物的影響*

    2018-07-03 02:42:08徐國(guó)萍孫長(zhǎng)貴戴玉柱
    關(guān)鍵詞:改良法滲透壓沉淀法

    徐國(guó)萍,成 軍,孫長(zhǎng)貴,戴玉柱

    (1.杭州江干區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,杭州 310016;2.解放軍第一一七醫(yī)院檢驗(yàn)科,杭州 310013)

    血清循環(huán)免疫復(fù)合物(circulating immune complex,CIC)在多種疾病的發(fā)生、發(fā)展中起到了非常關(guān)鍵的作用,因此臨床實(shí)驗(yàn)室出現(xiàn)了大批關(guān)于CIC檢測(cè)的方法[1~3]。依據(jù)檢測(cè)方法的特異性,將CIC檢測(cè)方法分為特異性方法和非特異性方法兩大類[4~6]。而聚乙二醇(PEG)沉淀法既可用于非特異性的方法檢測(cè)(分光光度計(jì)檢測(cè)吸光度),也可用于特異性方法的前處理(CIC濃縮或CIC與血清基質(zhì)分離)。PEG為一種不帶電荷的直鏈大分子多糖,主要通過(guò)促進(jìn)CIC聚合成更大的凝聚物而使之被沉淀,PEG沉淀法因方法簡(jiǎn)便、快速、重復(fù)性好,在臨床實(shí)驗(yàn)室被廣泛用于病原體及血清CIC的分離與濃縮。國(guó)內(nèi)外的文獻(xiàn)均對(duì)PEG沉淀法的溫度、離心力、時(shí)間等要素進(jìn)行了優(yōu)化和明確[5,7],但PEG沉淀法所用溶液基質(zhì)、離子強(qiáng)度以及滲透壓的選擇對(duì)沉淀效果的影響,則未見相關(guān)報(bào)道。本文在PEG沉淀法常見的影響因素下,結(jié)合我們自主研發(fā)的特異性免疫復(fù)合物緩沖解離技術(shù),提出了溶液基質(zhì)、離子強(qiáng)度及滲透壓對(duì)PEG沉淀法分離血清CIC的影響。具體如下:

    1材料與方法

    1.1 標(biāo)本來(lái)源 335份五種乙肝血清標(biāo)志物模式(HBV-M)標(biāo)本來(lái)自于健康體檢者、本院住院傳染病科、浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院傳染病中心住院病人,其中100份HBV-M-1標(biāo)本(健康體檢者,陰性對(duì)照組):HBsAg,anti-HBs,HBeAg,anti-HBe,anti-HBc均陰性;42份HBV-M-2標(biāo)本:HBsAg,HBeAg和anti-HBc陽(yáng)性,117份HBV-M-3標(biāo)本:HBsAg,anti-HBe和anti-HBc陽(yáng)性;30份HBV-M-4標(biāo)本:HBsAg,anti-HBc陽(yáng)性;46份HBV-M-5標(biāo)本:anti-HBs,anti-HBe,anti-HBc陽(yáng)性。

    1.2 試劑和儀器 制備HBsAg-anti-HBsAg免疫復(fù)合物(HBsAg-CIC),其中HBsAg純化抗原(3.0 mg/ml)購(gòu)于以色列Prospec公司;羊-抗HBsAg多克隆抗體(3.0 mg/ml)購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司;聚乙二醇(PEG 6000)、硼酸(H3BO3)、硼砂(Na2B4O7)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)、氯化鈉(NaCl)、氟化鈉(NaF)購(gòu)置于成都科龍化工;巴比妥鈉(C8H11N2NaO3)購(gòu)于華中海威基因有限公司;濃鹽酸(HCl)購(gòu)于蘭溪六洞山化工。上海精宏DK-8D型水浴箱,上海精科UV-721型分光光度計(jì),德國(guó)原裝賽多利PP-50型pH計(jì),德國(guó)艾卡C-MAG HS型磁力混勻器,德國(guó)艾本德5804 R型高速離心機(jī),德國(guó)高能泰克osmomat 030型冰點(diǎn)滲透壓儀,美國(guó)雅培診斷i2000型化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套HBsAg檢測(cè)試劑盒。

    1.3 方法

    1.3.1 HBsAg-抗HBsAg免疫復(fù)合物制備:在美國(guó)雅培公司i2000化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套HBsAg試劑檢測(cè)在線性范圍內(nèi)按照合適的比例配制HBsAg-CIC,用HBV-M均陰性的混合人獻(xiàn)血員血清作為稀釋劑稀釋純化的人血HBsAg至200 IU/ml(制備的HBsAg量),然后加入羊抗-HBsAg多克隆抗體直至游離HBsAg檢測(cè)結(jié)果<1.5 IU/ml,游離抗體<15 IU/ml為止,37℃水箱放置2 h,然后放4℃冰箱過(guò)夜,即形成穩(wěn)定的HBsAg-CIC,精確計(jì)算HBsAg終濃度為193.6 IU/ml,每升復(fù)合物制備溶液中加入0.2 ml proclin 300生物防腐劑后分裝4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3.2 免疫復(fù)合物分離:依據(jù)參考文獻(xiàn)[5]選擇70 g/L PEG 6000沉淀劑,4℃沉淀24 h,離心力為18 009×g離心10 min,對(duì)不同基質(zhì)溶液、離子強(qiáng)度及滲透壓進(jìn)行多因素正交設(shè)計(jì)分組,各基質(zhì)溶液的配置依據(jù)專利及參考文獻(xiàn)[5,8,9]。①基質(zhì)溶液濃度:0.10 mol/L,0.15 mol/L,0.20 mol/L;②不同基質(zhì)溶液:硼酸鹽緩沖液(BB)、磷酸鹽緩沖液(PBS)、巴比妥鈉-HCl緩沖液(Barbital -HCl),Tris-HCl緩沖液;③基質(zhì)溶液滲透壓:400 mOsm/kg,500 mOsm/kg,600 mOsm/kg,700 mOsm/kg;④基質(zhì)溶液pH值:7.8,8.0,8.2,8.4。

    1.3.3 免疫復(fù)合物傳統(tǒng)法(傳統(tǒng)PEG沉淀法)[10]與改良法[5](優(yōu)化后的PEG沉淀分離法)的分離結(jié)果比較:傳統(tǒng)法和改良法分離待測(cè)樣本HBsAg-CIC沉淀各兩份分別設(shè)空白管(未解離HBsAg測(cè)定值)和測(cè)定管(解離后HBsAg測(cè)定值)。分離后沉淀,按照我們自主研發(fā)的專利技術(shù)[8,9](專利號(hào):ZL201410034039.5,ZL201410033277.4)對(duì)分離出的CIC進(jìn)行解離,解離后使用化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)游離HBsAg量,來(lái)計(jì)算免疫復(fù)合物量即解離率??瞻讓?duì)照管未解離的游離HBsAg測(cè)定:向空白對(duì)照管中同時(shí)加入CIC抗原緩沖解離劑和CIC抗原緩沖解離中和劑,混勻后采用Abbott i2000分析儀及配套試劑檢測(cè)HBsAg,其結(jié)果作為空白值;測(cè)定管解離后的總游離HBsAg測(cè)定:向測(cè)定管中加入抗原緩沖解離劑,置42℃水浴振蕩30 min(振蕩頻率60次/min);抗原緩沖解離中和劑,混勻后采用Abbott i2000分析儀及配套試劑2 h內(nèi)檢測(cè)HBsAg,其結(jié)果作為測(cè)定值(HBsAg-CIC=測(cè)定管HBsAg測(cè)定值-空白管HBsAg空白值)。

    1.4 結(jié)果判斷 HBsAg-CIC結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)見表1。

    表1 解離測(cè)定CIC中抗原結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

    注:*Abbott i2000免疫分析儀的HBsAg Cutoff=0.05 IU/ml。

    2結(jié)果

    2.1 PEG沉淀法中不同基質(zhì)、濃度、pH值、滲透壓條件優(yōu)化 見表2。通過(guò)采用正交設(shè)計(jì)對(duì)PEG各影響因素的優(yōu)化比較發(fā)現(xiàn):在這已知四個(gè)影響因素中,按照其對(duì)沉淀效果的影響大小依次為:溶液滲透壓>基質(zhì)溶液種類>溶液pH值>溶液濃度,通過(guò)四因素四水平的比較,得到PEG優(yōu)化后改良法的最佳分離溶液體系:0.15 mol/L,pH 8.2,500 mOsm/kg的硼酸鹽緩沖液含70 g/L PEG6000。

    表2 不同基質(zhì)、濃度、pH值、滲透壓條件優(yōu)化正交設(shè)計(jì)結(jié)果

    注:表中加下劃線數(shù)據(jù)為該因素中分離效果最佳的水平。

    2.2 傳統(tǒng)法與改良法分離結(jié)果比較 見圖1。通過(guò)將傳統(tǒng)法與改良法的前處理結(jié)果進(jìn)行比較可知:在乙肝感染不同的HBV-M中,HBV-M2模式中的HBsAg-CIC陽(yáng)性率最高,其次為HBV-M3模式,HBV-M1的HBsAg-CIC陽(yáng)性率最低;圖中乙肝各模式下經(jīng)改良法前處理的HBsAg-CIC檢出率明顯高于傳統(tǒng)法,其中HBV-M1為不存在HBsAg-CIC,所以兩者無(wú)可比性。

    由表3可知:改良法和傳統(tǒng)法同時(shí)運(yùn)用在乙肝不同模式下,改良法沉淀的HBsAg-CIC的量高于傳統(tǒng)法,且在HBV-M 2,3,4中差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-5.66,-12.60,均P<0.05),另外在HBV-M 1,5模式中,兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.775~-1.77,均P>0.05)。

    表3 不同HBV-M模式采用傳統(tǒng)法與改良法的分離HBsAg含量比較

    注:HBV-M-1:HBsAg,anti-HBs,HBeAg,anti-HBe,anti-HBc均陰性;HBV-M-2:HBsAg,HbeAg,anti-HBc陽(yáng)性;HBV-M-3:HBsAg,anti-HBe,anti-HBc陽(yáng)性;HBV-M-4:HBsAg,anti-HBc陽(yáng)性;HBV-M-5:anti-HBs,anti-HBe,anti-HBc陽(yáng)性。

    圖1 不同HBV-M模式采用傳統(tǒng)法與改良法HBsAg-CIC陽(yáng)性率(%)

    3討論抗原進(jìn)入機(jī)體或自身抗原刺激(抗原變性、隱蔽性抗原釋放),能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞及體液免疫應(yīng)答,產(chǎn)生大量針對(duì)相關(guān)抗原的抗體,致使抗原與抗體形成免疫復(fù)合物[1~3]。部分抗原形成免疫復(fù)合物被清除,但在某些情況下,當(dāng)抗原在體內(nèi)持續(xù)存在或者機(jī)體清除抗原抗體復(fù)合物的功能受損時(shí),免疫復(fù)合物可在機(jī)體的特定部位引起損害,導(dǎo)致急性炎癥、慢性炎癥、甚至變性壞死[11]。乙型肝炎在我國(guó)病毒性肝病中,患病比例最高,而且多數(shù)處于慢性化,病毒長(zhǎng)期與宿主共存,難以完全清除,其中HBsAg-CIC在乙型肝炎引起肝病發(fā)生、發(fā)展中具有重要的作用[12,13]。PEG沉淀法檢測(cè)免疫復(fù)合物,因其敏感度及特異度問(wèn)題,在目前實(shí)驗(yàn)室逐漸被抗抗體法、補(bǔ)體法等相對(duì)特異的方法所取代。而PEG沉淀CIC法,在臨床及基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室仍然被廣泛用于各類CIC的分離及病原體核酸濃縮。本文圍繞PEG沉淀法分離血清HBsAg-CIC這一主題,對(duì)該分離方法的實(shí)驗(yàn)過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化,以提高分離效果。

    由表2可知,除了PEG的濃度、沉淀時(shí)間以及離心力外,本文討論的沉淀分離所受影響因素,其重要性依次為:滲透壓>基質(zhì)溶液>pH值>濃度,其中滲透壓為主要因素,提示適當(dāng)?shù)奶岣邼B透壓有助于免疫復(fù)合物的有效分離,過(guò)高或者過(guò)低則影響CIC的分離。分析原因:適當(dāng)?shù)母邏簻p少CIC處于懸浮狀態(tài),并且可使CIC的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變有利于CIC分離。當(dāng)滲透壓過(guò)低時(shí),懸浮狀態(tài)CIC過(guò)多導(dǎo)致最后的沉淀離心,無(wú)法將CIC沉淀完全。當(dāng)滲透壓過(guò)高時(shí),CIC及其內(nèi)部的抗體空間結(jié)構(gòu)發(fā)生嚴(yán)重的改變,致使用其他特異性方法去檢測(cè)時(shí),CIC中的檢測(cè)位點(diǎn)無(wú)法充分暴露,反而降低了檢測(cè)效果致使檢測(cè)能力下降。其次是基質(zhì)溶液,我們?cè)谶x擇不同的基質(zhì)時(shí)存在明顯的差異,其中BB緩沖液與PBS緩沖液差異小,而使用巴比妥緩沖液與Tris-HCl作為基質(zhì)溶液分離效果明顯下降,這可能是不同的基質(zhì)體系,即使是pH值一致,可其內(nèi)部的緩沖離子量不同,導(dǎo)致分離效果存在差異。pH值單獨(dú)作為影響因素和不同基質(zhì)溶液是分不開的,不同的pH值在某種程度上也就決定了其緩沖能力的大小。溶液濃度影響最小,本文研究的均為緩沖體系,所以在一定的濃度范圍內(nèi)變化,基質(zhì)溶液仍然呈現(xiàn)緩沖體系。

    由表3和圖1可知在乙肝不同模式下,HBsAg-CIC的陽(yáng)性率不同,其中陽(yáng)性率最高的是HBV-M2(HBsAg,HbeAg,anti-HBc陽(yáng)性),最低的是HBV-M1 (HBsAg,anti-HBs,HBeAg,anti-HBe,anti-HBc均陰性),改良法的陽(yáng)性率要高于傳統(tǒng)法,另外改良法(HBV-M 2,3,4)分離的HBsAg-CIC量要高于傳統(tǒng)法,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),在HBV-M5中因?yàn)楸狙芯渴占臉颖纠龜?shù)少,所以差異未能比較出統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),由此說(shuō)明在HBV疾病發(fā)生發(fā)展的不同階段其HBsAg-CIC含量不盡相同,其形成機(jī)制和致病機(jī)理還不十分明確,有待下一步研究證明。

    綜上所述,PEG沉淀免疫復(fù)合物法,不僅要考慮到PEG濃度、離心力以及放置時(shí)間的因素,同時(shí)要考慮基質(zhì)溶液滲透壓、基質(zhì)溶液種類、不同pH值和基質(zhì)溶液濃度等因素。改良法PEG沉淀效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)方法,為進(jìn)一步研究HBsAg-CIC在HBV感染不同階段的致病機(jī)理提供了一個(gè)可靠的技術(shù)手段,同時(shí)對(duì)于各類病原體或自身抗原所致疾病中形成的CIC研究工作提供了新思路。

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