雙孢菇多糖的提取及抗氧化活性研究

劉楊，趙立，蔣長興，陳軍，白青云，畢艷紅，陳文

（淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江蘇淮安223003）

食用菌是已知最早的、人類實踐中發(fā)現(xiàn)并利用的一類微生物，其醫(yī)學(xué)價值在我國東漢時期已有記錄。食用菌素有“植物肉”之稱，蛋白質(zhì)含量豐富，有18種L-氨基酸，氨基酸組成合理。雙孢菇（Agaricus bisporus），是一種常見的食用菌，又稱白色蘑菇、洋蘑菇、圓蘑菇、銀白色菌絲菇，是中低溫性真菌，生長速度快，不容易結(jié)菌被，實體多單生，形狀圓正，呈白色、外周沒有鱗片，菌蓋較厚，菇體肉質(zhì)肥厚。在雙孢菇的擔子上面，一般都會有兩個擔孢子長在上面，得名雙孢菇[1,2]。

真菌多糖是多數(shù)食用菌含有的一種非常重要的活性成分，具有廣闊的發(fā)展前景，近年來受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[3-5]。真菌多糖具有很好的抗氧化性，是一款天然存在的大眾消費品，方便易得。作為天然綠色防腐劑，在食品中的應(yīng)用已被大眾所接受和認可[6-9]。目前也被應(yīng)用到化妝品的開發(fā)與成分添加中，本文應(yīng)用真菌多糖來優(yōu)化雙孢菇多糖的提取工藝，并分析了它的抗氧化活性，為雙孢菇多糖的充分應(yīng)用，發(fā)揮多糖的醫(yī)藥價值提供參考。

1 材料與設(shè)備

1.1 試驗材料

新鮮雙孢菇選自淮安市城南市場，市售。菌體肉質(zhì)飽滿，沒有劃痕，顏色白凈，無褐色或黑色斑點，菌體上的菌桿未脫落。

1.2 試劑

苯酚、濃硫酸、無水乙醇、氯化鐵、三氯乙酸、鐵氰化鉀、EDTA、VC、Ferrozine（菲洛嗪）等，均為分析純。BHT（2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚）為食品級。

1.3 設(shè)備

PHS-3C型pH計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；723-UV-5800型紫外可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司。

2 試驗方法

2.1 操作流程及主要步驟

2.1.1 粉碎、浸提、濃縮

將雙孢菇切片置于粉碎機中粉碎后，置于勻漿機中加水勻漿，采用熱水浸提。過濾，得浸提液。將浸提液在8000r/min條件下離心15min，得到上層清液。將得到的上層清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮，減壓濃縮至原體積的1/3～1/2。

2.1.2 醇沉、離心、干燥

將濃縮液加3倍體積乙醇，攪拌，放置一夜，然后8000r/min離心15min，得沉淀物。將沉淀物置于烘箱中，（105±2）℃條件下烘至恒重，搗成粉末備用。

2.2 雙孢菇多糖提取優(yōu)化工藝試驗

2.2.1 單因素試驗

（1）提取溫度對多糖提取率的影響

選擇不同溫度（50、60、70、80、90℃）作為變量，液料比30:1，提取時間180min，提取1次，研究提取溫度對多糖提取率的影響。

（2）提取時間對多糖提取率的影響

選擇不同的時間（60、90、120、150、180min） 作為變量，液料比30:1，提取溫度70℃，提取 1次，研究提取時間對多糖提取率的影響。

（3）液料比對多糖提取率的影響

選擇不同的液料比（10:1、20:1、30:1、40:1、50:1）作為變量，提取時間180min，提取溫度70℃，提取 1次，研究液料比對多糖提取率的影響。

2.2.2 多糖提取率的計算

式中，質(zhì)量的單位均為g。

2.3 多糖抗氧化活性的測定

2.3.1 還原力

在試管中加入一定體積0.1mg/mL的樣品，用磷酸鹽緩沖溶液（0.2mol/L、pH 6.6）定容到 2.5mL，加質(zhì)量分數(shù)為1%的鐵氰化鉀溶液5mL，隨后將試管放入50℃水浴鍋中加熱20min，反應(yīng)后取出試管，隨即加入10%的三氯乙酸溶液5mL，將試液充分搖勻后靜置5min。取上清液2.5mL，添加2.5mL的蒸餾水和0.5mL1%的氯化鐵溶液。將搖勻后得到的試液置于700nm條件下測定吸光度值。同時采用相同體積質(zhì)量分數(shù)為0.1mg/mL的BHT為陽性對照。

2.3.2 對Fe2+離子螯合能力

加入一定體積的濃度為0.1mg/mL樣品于試管中，然后依次添加2mol/L的氯化鐵溶液0.1mL，5mmol/L的Ferrozine溶液0.2mL，充分搖勻，之后加入蒸餾水定容到5mL，于室溫放置20min，在560nm波長下測定吸光度，根據(jù)吸光度計算螯合率。該試驗中的陽性對照是0.1mg/mL的EDTA。

2.3.3 對DPPH自由基的清除能力

在試管中添加少量的樣品，濃度為0.1mg/mL，然后添加6.5×10-5mol/L DPPH 2.5mL，充分搖勻后，用70%的乙醇溶液定容到4mL，再次搖勻，在避光處放置20min，之后將溶液搖勻，避光20min后在500nm測量吸光度，并由此計算自由基的清除率。在該試驗中的對照樣品是0.1mg/mL的BHT。

2.3.4 對羥基自由基的清除能力

取兩個干凈的試管，并標號1、2。兩個試管中分別加入少量的0.1mg/mL的樣品，然后分別再加入9mmol/L的四氯化鐵EDTA溶液1mL，在1號試管中再加入9mmol/L的水楊酸乙醇溶液1mL，2號試管不加，然后將濃度為8.8mmol/L過氧化氫溶液1mL加入試管中，并將1、2號試管用蒸餾水定容到5mL。充分將兩個試管搖勻后，于500nm下測定吸光度，計算出清除率，判斷清除羥基自由基的能力。本次試驗用等體積的抗壞血酸作為對照組。

3 結(jié)果與分析

3.1 雙孢菇多糖提取的優(yōu)化試驗

3.1.1 多糖提取的單因素試驗

（1）提取溫度對多糖提取率的影響

圖1 不同提取溫度下的多糖提取率Fig.1 Extraction rate of polysaccharide with different temperature

從圖1可知，溫度在50～70℃之間時，雙孢菇多糖的提取率隨著溫度的升高逐漸增加，但溫度超過70℃以后，多糖的提取率呈現(xiàn)略下降趨勢。因此，選擇70℃為雙孢菇多糖提取的最佳溫度。

（2）提取時間對多糖提取率的影響

從圖2可知，提取時間為60～120min時，雙孢菇多糖的提取率隨著時間延長存在明顯的上升趨勢（P＜0.05）。當提取時間達到120min以上時，雙孢菇多糖提取率上升非常緩慢（P＞0.05）。因此，120min為提取雙孢菇多糖的最佳溫度。

圖2 不同提取時間下的多糖提取率Fig.2 Extraction rate of polysaccharide with different time

（3）液料比對多糖提取率的影響

由圖3可見，多糖的提取率隨著液料比的增加呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，在液料比為30:1時的多糖提取率較20:1時顯著增加（P＜0.05），隨著液料比的持續(xù)增加，多糖提取率并未有顯著上升（P＞0.05）。因此，30:1時為提取雙孢菇多糖的最佳液料比。

圖3 不同液料比下的多糖提取率Fig.3 Extraction rate of polysaccharide with different ratio of liquid to material

3.1.2 雙孢菇多糖提取的正交試驗

在單因素的基礎(chǔ)上，選取對結(jié)果影響顯著的單因素設(shè)計正交試驗，試驗設(shè)計見表1，結(jié)果見表2。

表1 雙孢菇多糖提取正交試驗設(shè)計Table 1 Orthogonal test design of polysaccharide extraction fromAgaricus bisporus

表2 雙孢菇多糖提取正交試驗結(jié)果Table 2 Orthogonal test result of polysaccharide from Agaricus bisporus

從表2可以看出，RC＞RA＞RB，所以各因素對多糖提取率影響由大到小依次為：液料比＞提取溫度＞提取時間。多糖最佳提取方案為A3B2C3，即提取溫度為80℃，提取時間為120min，液料比為40:1。經(jīng)驗證最優(yōu)方案多糖提取率為1.53%，均優(yōu)于其他試驗組。

3.2 多糖抗氧化活性分析

3.2.1 多糖的還原力

物質(zhì)還原力的大小和抗氧化活性有一定關(guān)系，因此，可通過測定還原力的大小來判斷物質(zhì)抗氧化性的高低[10]。由圖4可以看出，雙孢菇多糖的還原力與BHT的還原能力相當（P＞0.05），可見，雙孢菇多糖具有很好的還原力，并在一定的范圍內(nèi)與濃度呈正比。

圖4 雙孢菇多糖的還原力Fig.4 Reducing capacity of polysaccharides from Agaricus bisporus

3.2.2 多糖對Fe2+的螯合能力

生物體內(nèi)·OH可由H2O2與金屬離子反應(yīng)產(chǎn)生，兩者具有相同的作用趨勢，推測多糖能夠通過螯合金屬離子（如Fe2+等）來降低機體產(chǎn)生·OH的速度，兩者的存在是呈正比關(guān)系，螯合力大的抗氧化劑，抗氧化性也較強[11]。圖5表明，雙孢菇多糖的螯合能力一直高于EDTA，在溶液濃度為0.4mg/mL之前，差異顯著（P＜0.05），隨著濃度的增加，兩者的螯合能力差異變?。≒＞0.05）。

圖5 雙孢菇多糖對Fe2+的螯合能力Fig.5 The chelation ability of polysaccharides with Fe2+fromAgaricus bisporus

3.2.3 多糖對DPPH自由基的清除能力

由圖6可見，雙孢菇多糖對DPPH自由基的清除能力稍高于BHT，二者變化趨勢大致相近，這表明雙孢菇多糖對DPPH自由基的清除能力較強。

圖6 雙孢菇多糖對DPPH自由基的清除能力Fig.6 Scavenging ability on DPPH free radicals of polysaccharides fromAgaricus bisporus

3.2.4 雙孢菇多糖對羥基自由基的清除作用

由圖7可見，雙孢菇多糖的清除羥基自由基的能力明顯要比VC強（P＜0.05），隨著濃度的增加，清除率趨于平緩，接近最大值80%左右。

圖7 雙孢菇多糖對羥基自由基的清除作用Fig.7 Scavenging ability on Hydroxyl radical of polysaccharides fromAgaricus bisporus

4 結(jié)論

本試驗采用新鮮雙孢菇作為材料，優(yōu)化雙孢菇多糖的提取工藝參數(shù)為：提取溫度80℃，提取時間120min，液料比40:1，在此條件下雙孢菇多糖的提取率可達1.53%，烘干后雙孢菇多糖含量可達10.2%。雙孢菇的含水率約在90%左右，提取率與松乳菇多糖的提取[12]、海鮮菇多糖的提取[13]等的結(jié)果相近。

雙孢菇多糖對金屬離子具有較強的螯合能力和還原力，它能夠清除羥基自由基和DPPH自由基，是一種純天然的抗氧化劑，可以應(yīng)用于多種領(lǐng)域，具有很好的發(fā)展?jié)摿?，開發(fā)前景非常廣闊。

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