動脈粥樣硬化患者NLRP3炎性體分子表達及臨床意義

陳國偉 吳小蘭 陳冬梅 沈榮興 陳建忠

動脈粥樣硬化多由脂肪代謝紊亂、神經(jīng)血管功能失調(diào)引起，常導(dǎo)致血栓形成、供血障礙等，為老年人主要病死原因之一。局部及全身炎癥反應(yīng)在動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[1]，尤其是免疫應(yīng)答介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[2-3]。炎性體是由模式識別受體如核苷酸結(jié)合寡聚化樣受體（NLRs）識別配體如病原體相關(guān)模式分子（PAMPs）或危險相關(guān)模式分子（DAMPs）后與斑點樣蛋白（ASC）、半胱天冬酶-1（caspase-1）等形成的大分子的復(fù)合物[4-5]，炎性體形成后能激活caspase-1，活化的caspase-1繼而通過酶切IL-1β和IL-18前體分子而生成具有生物學(xué)活性的IL-1β和IL-18，進而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。近年來有學(xué)者提出含熱蛋白結(jié)構(gòu)域3的核苷酸結(jié)合寡聚化樣受體（NLRP3）介導(dǎo)的炎性體激活途徑在動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用[6-13]。本研究通過觀察動脈粥樣硬化患者NLRP3炎性體相關(guān)分子如NLRP3、ASC、IL-1β的表達及其并用膽固醇結(jié)晶誘導(dǎo)巨噬細胞活化產(chǎn)生IL-1β和TNF-α的水平，探討NLRP3炎性體活化途徑在動脈粥樣硬化發(fā)病中的作用。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2016年1月至2016年12月在桐鄉(xiāng)市第二人民醫(yī)院門診及住院的動脈粥樣硬化患者共40例設(shè)為實驗組，其中男23例，女17例，年齡49～84歲（69.9±9.6）歲；均經(jīng)超聲檢查確診。入選標(biāo)準(zhǔn)：血管內(nèi)膜增厚，內(nèi)-中膜厚度1.0～1.2mm或管腔內(nèi)粥樣硬化斑塊形成、管腔狹窄；排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有急性感染的臨床表現(xiàn)；（2）嚴(yán)重腎功能衰竭；（3）患有痛風(fēng)、類風(fēng)濕疾病、糖尿病、惡性腫瘤或其他嚴(yán)重消耗性疾?。唬?）長期服用激素或免疫抑制劑的患者。選取桐鄉(xiāng)市第二人民醫(yī)院同期健康體檢者40例作為對照組，其中男24例，女16例，年齡50～80（68.6±11.1）歲。兩組對象性別、年齡等基線資料比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）,見表1。

表1 兩組對象的主要基線資料比較

1.2 方法

1.2.1 血漿細胞因子檢測 采集清晨空腹靜脈血5ml，肝素抗凝，收集血液后，以1 200r/min離心10min，分離血漿將血漿置于EP管（美國，Axygen,Y3700），置于-20℃冰箱保存。用ELISA試劑盒檢測血漿中IL-1β（美國，eBioscience，85-88-7261-22）、IL-18（美國，e－Bioscience，85-BMS267-2） 和 IL-37（美國，Invitrogen 88-52103）濃度，按試劑盒說明書操作，酶標(biāo)儀（Molecular Devices，SynergyMx M5） 測定 450nm 處吸光度（A）值，以試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品測定結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算細胞因子的含量。

1.2.2 定量PCR檢測巨噬細胞（MDM）中NLRP3炎性體相關(guān)分子mRNA的表達 采集靜脈血5ml，肝素抗凝，將細胞用PBS稀釋1倍后，加入至含淋巴細胞分離液（挪威，Stemcell，LymphoprepTM，#07851）的離心管中，采用密度梯度離心法分離兩組患者的單個核細胞，分化為MDM，根據(jù)TRIzol試劑盒（康為，CW0580S）說明書提取總RNA，加入20μl的DEPC水溶解，測定RNA的濃度和OD比值，符合要求后按SuperRT cDNA第一鏈合成試劑盒（康為，CW0741M）說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，20μl反應(yīng)體系中包括 dNTP mix 4μl，SuperRT 1μl，5×RTBuffer 4μl，RNA 2μl，引物 2μl，DEPC 水 7μl，反應(yīng)物4℃儲存待用。實時熒光定量PCR根據(jù)參考文獻進行，20μl反應(yīng)體系中含 SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（2×）10μl，PCR上游和下游引物各1μl，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液（cDNA溶液）2μl，DEPC 水 6μl，在定量 PCR 儀（Applied Biosystems,7900）上進行反應(yīng)，反應(yīng)條件為 95℃，30s；95℃，5s；60℃，34s，40 個循環(huán)，每個樣品設(shè)定 3 個復(fù)孔，并使用溶解曲線分析引物特異性。用2-△△Ct法計算出每組樣本的基因表達量，每種檢測重復(fù)3次。引物根據(jù)文獻報道設(shè)計和合成（上海生工生物工程技術(shù)有限公司），序列見表2。

表2 引物序列

1.2.3 膽固醇刺激MDM產(chǎn)生細胞因子的檢測 用膽固醇結(jié)晶（美國，Sigma-Aldrich，C8667）刺激 MDM，收集MDM細胞上清液，用ELISA方法檢測TNF-α（美國，eBioscience，85-88-7346-22）、IL-1β 的含量。實驗按試劑盒說明書操作，酶標(biāo)儀測定450nm處吸光度（A）值，以試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品測定結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算細胞因子的含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件,正態(tài)分布的計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組對象血漿中細胞因子含量的比較見表3。由表3可見，實驗組動脈粥樣硬化患者的IL-1β和IL-18的水平顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而IL-37水平略高于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 兩組對象血漿中細胞因子含量的比較

2.2 兩組對象MDM NLRP3炎性體相關(guān)分子表達水平比較見表4。

表4 兩組MDM NLRP3炎性體相關(guān)分子表達水平比較

由表4可見，實驗組NLRP3、ASC、IL-1β的mRNA表達顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.3 兩組對象MDM經(jīng)膽固醇結(jié)晶刺激后產(chǎn)生細胞因子水平的比較見表5。

表5 兩組對象MDM經(jīng)膽固醇結(jié)晶刺激后細胞因子水平的比較

由表5可見，實驗組分離的MDM經(jīng)膽固醇結(jié)晶刺激后TNF-α、IL-1β的分泌水平均顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

3 討論

動脈粥樣硬化是一種以脂質(zhì)沉積、白細胞浸潤和血管平滑肌細胞增殖為主要特征的慢性炎癥性疾病，但是到目前為止，動脈粥樣硬化患者粥樣損傷時炎癥反應(yīng)的發(fā)生機制尚未完全闡明[1]，免疫應(yīng)答引起的炎癥反應(yīng)與其密切相關(guān)[2-3]。近年來研究表明，損傷的組織和細胞產(chǎn)生的損傷/DAMPs能被模式識別受體（PRR）識別后介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。這些模式識別受體包括TLR、NLR、RLR和CLR等，其中NLR識別DAMPs后能形成由NLR、ASC、caspase-1等形成的稱為炎性體的分子復(fù)合物[14]。炎性體形成后能激活caspase-1，活化的caspase-1繼而通過酶切IL-1β和IL-18前體分子而生成具有生物學(xué)活性的IL-1β和IL-18，進而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。NLRP3炎性體[15]是研究最多的一種，NLRP3炎性體由NLRP3、ASC和caspase-1組成。多種內(nèi)源性刺激物如膽固醇結(jié)晶、葡萄糖、游離脂肪酸、尿酸鈉（MSU）結(jié)晶及胞質(zhì)外ATP和外源性刺激物如細菌、病毒等成分能誘導(dǎo)NLPR3的活化，通過誘導(dǎo)促炎性細胞因子如IL-1β的產(chǎn)生，在如動脈粥樣硬化[6-10]、糖尿病[16-17]等免疫炎癥性疾病中的發(fā)病過程中起著重要的作用。如臨床報告發(fā)現(xiàn)，血液中IL-1β和IL-18的升高程度與冠狀動脈病的嚴(yán)重度密切相關(guān)。

動脈壁的慢性炎癥是動脈粥樣硬化發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，單核細胞浸潤是動脈壁中粥樣斑塊的發(fā)生的基本特征。近來研究發(fā)現(xiàn)固有免疫細胞如MDM、內(nèi)皮細胞吞噬游離脂肪酸（FFA）、膽固醇結(jié)晶后，可激活炎性體途徑，釋放炎癥因子如IL-1β、TNF-α等，在動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展中起重要的作用[6-10]。本研究顯示，動脈粥樣硬化患者血漿中的IL-1β和IL-18的水平顯著高于對照組，提示動脈粥樣硬化患者可能存在慢性低度炎癥狀態(tài)。IL-37是新近發(fā)現(xiàn)的具有抗炎癥作用的細胞因子[18]，本研究結(jié)果顯示，動脈粥樣硬化患者血漿中IL-37水平僅略高于對照組，但無統(tǒng)計學(xué)差異，提示IL-37可能是為了調(diào)節(jié)炎癥應(yīng)答而代償性升高。IL-1β和IL-18的產(chǎn)生依賴于NLRP3炎性體的激活，而炎性體的激活需要二個階段，即NLRP3炎性體相關(guān)分子的誘導(dǎo)表達階段和激活階段，研究發(fā)現(xiàn)修飾的LDL如氧化可被MDM的TLR和清道夫受體識別并作為初始信號誘導(dǎo)NLRP3和IL-1β的表達[8,9]，本研究將外周血單個核細胞分離后進一步分化為MDM，采用實時熒光PCR檢測MDM中NLRP3、ASC、IL-1 mRNA表達，同樣發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化患者MDM 的 NLRP3、ASC、IL-1β的 mRNA表達顯著高于對照組，與早期研究發(fā)現(xiàn)冠狀動脈病患者外周血單個核細胞和皮下脂肪組織的NLRP3、IL-1β、IL-18等分子表達升高結(jié)果一致[19-21]。為進一步研究動脈粥樣硬化患者MDM對膽固醇結(jié)晶刺激的敏感性，體外用一定濃度的膽固醇結(jié)晶刺激后發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化患者MDM的TNF-α、IL-1β分泌水平均顯著高于對照組，提示動脈粥樣硬化患者的MDM吞噬膽固醇或FFA后導(dǎo)致NLRP3炎性體的激活并促進IL-1β、TNF-α的產(chǎn)生，以上結(jié)果提示由膽固醇結(jié)晶刺激引起的炎性體激活途徑可能在動脈粥樣硬化硬化的發(fā)生、發(fā)展中起重要的作用。有關(guān)膽固醇結(jié)晶激活NLRP3炎性體的分子機制，有學(xué)者推測膽固醇結(jié)晶被巨噬細胞MDM吞噬后可導(dǎo)致吞噬溶酶體的不穩(wěn)定性或破裂，引起溶酶體的組織蛋白酶B釋放，組織蛋白酶B和鉀離子外流、反應(yīng)性氧代謝產(chǎn)物一起介導(dǎo)NLRP3炎性體的活化[8,9]。

近來研究發(fā)現(xiàn)炎性體活化途徑抑制劑在炎性體相關(guān)疾病的治療中取得較好的效果[22-23]，最近文獻報道常用于冠心病治療的藥物他汀類藥物能抑制NLRR3炎性體的激活而發(fā)揮抗炎作用[10-24]，這些發(fā)現(xiàn)為進一步研制開發(fā)有效的動脈粥樣硬化治療藥物提供了一定的理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。

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