小粒徑辛伐他汀盤(pán)狀重組高密度脂蛋白載藥系統(tǒng)的制備及體外評(píng)價(jià)

楊蕓 張文麗 劉建平

【摘 要】目的：體外制備小粒徑辛伐他汀盤(pán)狀重組高密度脂蛋白載藥系統(tǒng)，對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行表征并觀察載藥系統(tǒng)對(duì)泡沫細(xì)胞存活率的影響。方法：利用乙醇注入-超聲分散法制備辛伐他汀脂質(zhì)體，借助膽酸鈉介導(dǎo)載脂蛋白apoA-I與脂質(zhì)結(jié)合，構(gòu)建盤(pán)狀重組高密度脂蛋白載藥系統(tǒng)。對(duì)載藥系統(tǒng)的理化性質(zhì)進(jìn)行表征，并進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定泡沫細(xì)胞存活率。結(jié)果：載藥系統(tǒng)為40 nm左右的盤(pán)狀，長(zhǎng)軸方向上的直徑在100 ～ 200 nm，盤(pán)的側(cè)面高度在50 nm以下。藥物包封率在80 %以上，載藥量約為2.8 %，在4℃放置7天內(nèi)穩(wěn)定性良好。apoA-I與脂質(zhì)結(jié)合后其α-螺旋含量上升，與脂質(zhì)結(jié)合的穩(wěn)定性有所提高。載藥系統(tǒng)與泡沫細(xì)胞孵育后，細(xì)胞存活率有所升高。結(jié)論：體外成功制備了小粒徑辛伐他汀盤(pán)狀重組高密度脂蛋白載藥系統(tǒng)，該系統(tǒng)對(duì)泡沫細(xì)胞的病理凋亡具有一定的治療作用。

【關(guān)鍵詞】 盤(pán)狀重組高密度脂蛋白；辛伐他汀；載脂蛋白apoA-I；泡沫細(xì)胞

【中圖分類號(hào)】R743 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2095-6851（2018）04-00-01

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種動(dòng)脈壁的慢性炎癥疾病，與冠狀動(dòng)脈疾病、心肌梗塞等多種血管疾病的發(fā)生有關(guān)[1]。巨噬細(xì)胞存在于AS的各個(gè)病理階段，參與斑塊炎癥反應(yīng)、纖維帽變薄、壞死核心形成及斑塊破裂等多個(gè)病理過(guò)程[2，3]。因此，將巨噬細(xì)胞作為治療AS的靶點(diǎn)具有重要的研究意義。

高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）是一種存在于血漿中的天然脂蛋白，直徑在7～13 nm，由多種生物大分子組成[4，5]。載脂蛋白A-I（apolipoprotein A-I，apoA-I）是HDL上含量最為豐富的蛋白成分，約占HDL蛋白含量的70 %。此外HDL上還包括一些其他的脂質(zhì)成分，如膽固醇、膽固醇酯、甘油三酯以及磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂等多種磷脂。HDL能夠移除外周組織多余的膽固醇，遞送肝臟進(jìn)行代謝消除，這一過(guò)程即為膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)（reverse cholesterol transport，RCT）[5，6]，RCT被認(rèn)為是HDL抗AS的主要機(jī)制[4]。此外，HDL還具有抗炎、抗氧化等多種生理功能[7]，同樣能夠起到抗AS的治療作用。

目前，國(guó)內(nèi)外已有學(xué)者體外制備重組HDL（reconstituted HDL，rHDL），具有與天然HDL相類似的組成、性質(zhì)及結(jié)構(gòu)，并具有良好的生物相容性、生物可降解性等優(yōu)勢(shì)，可將其作為化藥[8]、基因[9]或造影劑[10]的載體。他汀類藥物具有降血脂、抗炎抗氧化等藥理效用，可用于抗AS?？诜委焺┝康乃☆愃幬镏饕诟闻K發(fā)揮降脂作用，若要達(dá)到抑制斑塊的作用，則需要口服5 ～ 7倍的劑量[11]，如此會(huì)產(chǎn)生一定的肝毒性并伴隨有肌病等一系列副作用。因此，將脂溶性他汀類藥物載入rHDL中，可降低毒副作用，同時(shí)實(shí)現(xiàn)藥物與載體抗AS的協(xié)同作用。

本實(shí)驗(yàn)室前期采用薄膜分散法制備載他汀類藥物的rHDL[12]，該方法中使用的氯仿具有高毒性。本文以辛伐他?。╯imvastatin，ST）作為模型藥，采用乙醇注入-超聲分散法制備辛伐他汀脂質(zhì)體（ST loaded liposome，ST-liposome），避免采用高毒性有機(jī)溶劑，此外制備過(guò)程中不加入膽固醇，以盡量減少促AS發(fā)展的不良因素的引入。將脂質(zhì)體與apoA-I蛋白樣品孵育，得到小粒徑辛伐他汀重組高密度脂蛋白載藥系統(tǒng)（ST-loaded rHDL，ST-rHDL）。對(duì)制備得到的載藥系統(tǒng)進(jìn)行粒徑、包封率（entrapment efficiency，EE）及載藥量（drug-loading rate，DL）測(cè)定，以透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）、原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）觀察其形態(tài)特征，并利用圓二色光譜（circular dichroism，CD）及鹽酸胍（guanidine hydrochloride，Gdn-HCl）變性實(shí)驗(yàn)研究apoA-I的二級(jí)結(jié)構(gòu)及其與脂質(zhì)結(jié)合的穩(wěn)定性，最后觀察ST-rHDL對(duì)RAW 264.7巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞存活率的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 試劑 大豆磷脂（上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司）；辛伐他汀原料藥（上虞京新藥業(yè)有限公司惠贈(zèng)）；膽酸鈉（北京索萊寶科技有限公司）；Tris（生興生物公司）；Sephadex G50（50-150 μm，瑞典pharmacia公司）；apoA-I蛋白樣品（實(shí)驗(yàn)室從FIV沉淀中提?。?；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基（維森特生物技術(shù)有限公司）；胎牛血清FBS（維森特生物技術(shù)有限公司）；四甲基噻唑藍(lán)MTT（sigma）；ox-LDL（廣州奕源生物科技有限公司）；甲醇為色譜純，其余試劑均為市售分析純

1.2 儀器 JY-92II超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；RE-85Z旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市英峪予華儀器廠）；動(dòng)態(tài)光散射儀（Brookhaven）；RF-5301PC熒光分光光度計(jì)（島津）；高效液相色譜儀（島津）；紫外分光光度計(jì)（南京科爾儀器設(shè)備有限公司）；J810圓二色光譜儀；透射電鏡（Hitachi）；原子力顯微鏡（VEECO）

1.3 細(xì)胞 RAW 264.7巨噬細(xì)胞（南醫(yī)大惠贈(zèng)）

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥物含量測(cè)定方法的建立

2.1.1 HPLC方法的建立 對(duì)一定濃度的ST-甲醇溶液在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，確定藥物的檢測(cè)波長(zhǎng)為238 nm。色譜柱：Kromasil ODS C18柱（5 ?m，250 mm×4.6 mm）；流動(dòng)相：甲醇：水（78：22，v/v）；流速：1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：50 μl。

2.1.2 HPLC方法專屬性 將一定濃度的ST-甲醇溶液及用甲醇破乳稀釋的空白rHDL載體分別進(jìn)行HPLC檢測(cè)。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 用甲醇配制濃度分別為0.5、1、2、10、20、50、100 μg/ml的ST標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行HPLC檢測(cè)，以峰面積對(duì)ST濃度作圖得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.1.4 回收率及精密度考察 用甲醇配制濃度分別為0.5、10和100 μg/ml的ST標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入一定體積的空白rHDL載體，進(jìn)行HPLC檢測(cè)，計(jì)算回收率及RSD值。取回收率所用樣品溶液，于一天內(nèi)三個(gè)不同時(shí)間及連續(xù)三天的同一時(shí)間進(jìn)樣，得到日內(nèi)、日間精密度并計(jì)算RSD值。

2.2 ST-rHDL的制備 稱取處方量的大豆磷脂和ST放入西林瓶中，無(wú)水乙醇溶解，此為有機(jī)相。另取一定體積Tris-HCl緩沖液（含膽酸鈉）于另一西林瓶中作為水相。將有機(jī)相加熱至65℃，勻速緩慢滴入相同溫度下持續(xù)攪拌的水相中。滴加結(jié)束后繼續(xù)保溫?cái)嚢? h，超聲分散后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，用緩沖液定容至適當(dāng)體積后過(guò)濾得到ST-liposome混懸液。將混懸液與apoA-I蛋白樣品室溫孵育，過(guò)濾即得ST-rHDL。

2.3 ST-rHDL的理化性質(zhì)表征 2.3.1 粒徑測(cè)定

將ST-liposome及ST-rHDL稀釋一定倍數(shù)后，利用動(dòng)態(tài)光散射法（dynamic light scattering，DLS）測(cè)定粒徑及多分散指數(shù)（polydispersity index，PDI）。

2.3.2 EE及DL測(cè)定 用葡聚糖微柱離心法分離ST-rHDL和游離藥物，進(jìn)行HPLC檢測(cè)并計(jì)算藥物濃度。取相同體積的ST-rHDL直接用甲醇破乳稀釋，進(jìn)行HPLC檢測(cè)并計(jì)算藥物濃度。按下述公式（1）計(jì)算EE：EE （%）= C/C0 × 100 % （1）式中，EE為藥物的包封率；C為rHDL中包裹的藥物濃度；C0為rHDL混懸液中的藥物總濃度。

按下述公式（2）計(jì)算DL：DL （%）= W/W0 × 100 % （2）式中，DL為載藥量；W為rHDL中包裹的藥物總量；W0為ST-rHDL的藥物和輔料的總重量。

2.3.3 TEM形態(tài)觀察 將ST-liposome及ST-rHDL稀釋后滴到碳膜覆蓋的銅網(wǎng)上，用磷鎢酸溶液（2.0%，w/v）于室溫下染色樣品，烘干后進(jìn)行TEM觀察。

2.3.4 AFM形態(tài)觀察 將ST-rHDL稀釋后滴于1 cm × 1 cm的玻璃片上，烘干后進(jìn)行AFM觀察。

2.3.5 apoA-I的二級(jí)結(jié)構(gòu)檢測(cè) 將apoA-I蛋白樣品及ST-rHDL進(jìn)行透析，除掉鹽分。以去離子水作為空白背景，檢測(cè)190 ～ 250 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的CD光譜。用蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件計(jì)算α-螺旋，β-折疊，β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲所占百分比。

2.3.6 apoA-I與脂質(zhì)結(jié)合的穩(wěn)定性考察 配制一系列濃度的Gdn-HCl溶液，與等體積ST-rHDL或apoA-I蛋白樣品溶液混合，使得Gdn-HCl濃度分別為0、1、2、4、5、6、8、10、12 M，24 h后用熒光分光光度計(jì)測(cè)定最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)，固定激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm。

2.3.7 放置穩(wěn)定性考察 將ST-rHDL置于4 ℃儲(chǔ)存，分別于1、4、7天后，測(cè)定其粒徑及EE。

2.4 泡沫細(xì)胞存活率檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW 264.7細(xì)胞以5000個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板，以含10%胎牛血清及1%雙抗的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基于5 % CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞貼壁，以60 μg/ml的ox-LDL繼續(xù)培養(yǎng)24 h以誘導(dǎo)細(xì)胞泡沫化。PBS清洗后，加入無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋的ST-rHDL（磷脂濃度分別為50、100、200、400、600和800 μg/ml），37 ℃孵育6 h。PBS清洗后，加入含 MTT的無(wú)血清培養(yǎng)基，37 ℃孵育4 h。移除培養(yǎng)液，加入DMSO溶解藍(lán)紫色甲瓚結(jié)晶，用酶標(biāo)儀于570 nm測(cè)OD值。此外，設(shè)計(jì)一組泡沫細(xì)胞以不含ST-rHDL的無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h觀察存活情況。每個(gè)樣品六復(fù)孔，根據(jù)下式計(jì)算細(xì)胞存活率：

其中，ODcontrol為僅用空白培養(yǎng)液不加藥處理的含細(xì)胞的對(duì)照孔的OD值，ODs 為加藥處理的供試孔的OD值，OD0 為無(wú)細(xì)胞的空白孔的OD值。

3 結(jié)果和討論

3.1 藥物含量測(cè)定方法的建立

3.1.1 HPLC方法專屬性

如圖1所示，藥物出峰時(shí)間在13 ～ 14 min，輔料對(duì)藥物的檢測(cè)沒(méi)有干擾，該方法專屬性良好。

3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Peak area=-65589.25726 + 99935.36131×C，R2 = 0.9999。ST濃度在0.5 ～ 100 μg/ml范圍內(nèi)峰面積與濃度成正比，線性關(guān)系良好。

3.1.3 回收率及精密度考察

在低、中、高三種濃度下的回收率均在98～102%之間，RSD值均小于2%，且三種濃度下的日內(nèi)、日間精密度的RSD值均小于2%，符合方法學(xué)要求。

3.2 ST-rHDL的理化性質(zhì)表征

3.2.1 粒徑測(cè)定

結(jié)果如表1所示，ST-liposome粒徑約為40 nm，孵育apoA-I蛋白樣品形成ST-rHDL之后，其粒徑?jīng)]有發(fā)生明顯改變，粒徑仍在40 nm左右。

3.2.2 EE及DL測(cè)定

以相同處方工藝條件制備三批ST-rHDL經(jīng)葡聚糖凝膠微柱離心法分離載體與游離藥物并進(jìn)行HPLC檢測(cè)，計(jì)算得到的 EE為（85.09 ± 0.57）%，DL為（2.80 ± 0.02）%。

3.2.3 TEM形態(tài)觀察

圖3 （A）ST-liposome，形態(tài)為不規(guī)則的球形，原因可能是脂質(zhì)材料中不含膽固醇，因此磷脂雙層膜的流動(dòng)性較強(qiáng)，容易變形。圖3（B）為ST-rHDL，明顯看出載體呈盤(pán)狀，且堆積在一起。TEM比例尺為200nm，可見(jiàn)粒徑平均在40nm左右，與DLS檢測(cè)結(jié)果一致。

3.2.4 AFM形態(tài)觀察

如圖4所示，ST-rHDL形態(tài)為盤(pán)形，長(zhǎng)軸方向的直徑在100～200 nm之間，盤(pán)的側(cè)面高度小于50 nm。

3.2.4 apoA-I的二級(jí)結(jié)構(gòu)檢測(cè)

根據(jù)CD譜圖預(yù)測(cè)得到的二級(jí)結(jié)構(gòu)各百分含量如表2所示，游離apoA-I與rHDL的脂質(zhì)結(jié)合之后，構(gòu)象發(fā)生了一定改變，各二級(jí)結(jié)構(gòu)所占百分比含量都發(fā)生了不同程度的變化。如α-螺旋含量升高，一定程度上能夠促進(jìn)蛋白與脂質(zhì)之間的結(jié)合[13]。

3.2.5 apoA-I與脂質(zhì)結(jié)合的穩(wěn)定性考察

如圖5所示，將游離apoA-I與不同濃度的Gdn-HCl溶液孵育相同時(shí)間后，其最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)有所改變。隨著Gdn-HCl溶液濃度增大，游離apoA-I的最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)逐漸增大，說(shuō)明apoA-I在Gdn-HCl作用下發(fā)生變性，構(gòu)象發(fā)生明顯改變。相比之下，apoA-I與脂質(zhì)結(jié)合后，其穩(wěn)定性有所提高，耐受Gdn-HCl的能力增強(qiáng)。

3.2.6 放置穩(wěn)定性

將ST-rHDL于4 ℃放置7天，期間制劑粒徑及EE均未發(fā)生明顯改變，放置穩(wěn)定性良好。

3.3 泡沫細(xì)胞存活率檢測(cè)

不同濃度載藥制劑對(duì)泡沫細(xì)胞存活率的影響如圖6所示，泡沫細(xì)胞存活率均大于100%。泡沫細(xì)胞不加制劑同樣培養(yǎng)6 h后的細(xì)胞存活率以培養(yǎng)0 h為對(duì)照，結(jié)果顯示，泡沫細(xì)胞本身活性會(huì)下降，存活率降至60%。因此，載藥制劑對(duì)泡沫細(xì)胞起到了一定的治療作用，如介導(dǎo)膽固醇外流、制劑攝取進(jìn)入細(xì)胞以使藥物發(fā)揮作用等，使得細(xì)胞泡沫化程度有所緩解，存活情況改善。但制劑濃度過(guò)大時(shí)，由于高的脂質(zhì)濃度，本身會(huì)有一定細(xì)胞毒性。

4 結(jié)論

本文利用乙醇注入-超聲分散法制備了不含膽固醇的辛伐他汀脂質(zhì)體，避免使用高毒性有機(jī)溶劑，同時(shí)減少了不利于抗AS的成分的引入，借助膽酸鈉介導(dǎo)載脂蛋白與脂質(zhì)結(jié)合，構(gòu)建小粒徑盤(pán)狀重組高密度脂蛋白載藥系統(tǒng)，該系統(tǒng)對(duì)泡沫細(xì)胞的病理凋亡具有一定的緩解作用，提高細(xì)胞存活率。該載藥系統(tǒng)粒徑相對(duì)較小，有利于體內(nèi)靶向遞送時(shí)穿透斑塊組織表面的纖維帽結(jié)構(gòu)，到達(dá)深層泡沫細(xì)胞發(fā)揮治療作用，為后續(xù)載體的進(jìn)一步優(yōu)化設(shè)計(jì)及體內(nèi)靶向研究提供了一定的研究基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

Taleb S.Inflammation in atherosclerosis[J].Archives of Cardiovascular Diseases.2016，109（12）：708-15.

Ross R.The pathogenesis of atherosclerosis：a perspective for the 1990s[J].Nature.1993，362（6423）：801-9.

Moore KJ，Tabas I.Macrophages in the pathogenesis of atherosclerosis[J].Cell.2011，145（3）：341-55.

Damiano MG，Mutharasan RK，Tripathy S，et al.Templated high density lipoprotein nanoparticles as potential therapies and for molecular delivery[J].Advanced Drug Delivery Reviews.2013，65（5）：649-62.

Podrez EA.Anti-oxidant properties of high-density lipoprotein and atherosclerosis[J].Clinical & Experimental Pharmacology & Physiology.2010，37（7）：719-25.

R?hrl C，Stangl H.HDL endocytosis and resecretion[J].Biochimica Et Biophysica Acta.2013，1831（11）：1626–33.