魚糜pH-shifting工藝及其膠凝機制研究綜述及展望

徐莉娜,賀海翔,羅 煜,付湘晉,*,張 琳,丁玉琴

(1.中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院,湖南長沙 410004) (2.湖南宏興隆湘蓮食品有限公司,湖南湘潭 411200)

魚糜具有營養(yǎng)豐富、食用方便、耐儲藏等優(yōu)點,是我國水產(chǎn)品加工行業(yè)中增長最快的產(chǎn)品類別,其加工技術也一直是研究熱點,不斷有新技術被開發(fā)出來,pH-shifting魚糜加工技術即是其中之一。pH-shifting魚糜加工技術與傳統(tǒng)水洗魚糜技術完全不同,其產(chǎn)業(yè)化將極大改變魚糜生產(chǎn)行業(yè)污染大、得率低、成本高的現(xiàn)狀。但目前國內(nèi)研究還較少,產(chǎn)業(yè)界也未得到足夠關注。本文綜述了近年來的研究進展,包括pH-shifting工藝對魚糜蛋白組成、魚糜蛋白質(zhì)分子結構、魚糜膠凝特性、蛋白降解、蛋白交聯(lián)及魚糜凝膠微結構的影響等，為pH-shifting魚糜加工技術的理論研究和產(chǎn)業(yè)化提供參考。

1 pH-shifting魚糜加工技術簡介

pH-shifting魚糜加工技術由美國學者Hultin、Kelleher發(fā)明,先在極端pH(酸法,pH≤3.0或堿法,pH≥10.0)下使絕大部分魚肉蛋白質(zhì)溶解,離心或過濾去掉不溶解物和雜質(zhì),再調(diào)pH至蛋白質(zhì)的等電點(pH5.5左右)沉淀回收魚糜蛋白,所以又被稱為Isoelectric solubilization/precipitating工藝[1]。

pH-shifting魚糜加工技術的優(yōu)點主要有以下幾個方面:

a.魚糜產(chǎn)率顯著高于傳統(tǒng)水洗工藝:pH-shifting工藝可完全提取與魚刺連結較緊的魚肉,pH-shifting工藝回收了大部分肌漿蛋白;所以,魚糜產(chǎn)率顯著提高。如付湘晉[2]在白鰱魚糜加工研究中發(fā)現(xiàn),傳統(tǒng)水洗工藝蛋白回收率為59.8%,pH-shifting工藝可達79.1%。

b.原料適應范圍廣:pH-shifting工藝可適用于小魚、雜魚、多刺魚、多脂魚等[3],可直接以去內(nèi)臟的全魚為原料[4],還可以加工下腳料(如魚皮、魚排等)為原料[5-6]。

c.耗水量降低50%以上,廢水中蛋白質(zhì)含量很低,可重復使用[7]。

d.魚糜品質(zhì)優(yōu)良:在pH-shifting工藝的極端pH環(huán)境中,組織蛋白酶大部分變性,避免了組織蛋白酶引起的凝膠劣化,凝膠質(zhì)量優(yōu)于或相當于傳統(tǒng)水洗魚糜;pH-shifting魚糜脂肪含量更低,產(chǎn)品儲藏穩(wěn)定性提高;魚肉魚腥味、土腥味物質(zhì)能有效脫除[8-10]。

e.pH-shifting魚糜在低鹽量(1%,w/w)時膠凝特性優(yōu)于傳統(tǒng)水洗魚糜,故可用于加工優(yōu)質(zhì)低鹽魚糜制品[11]。

2 pH-shifting魚糜加工技術國內(nèi)外研究現(xiàn)狀

國外已有大量文獻研究了不同魚的pH-shifting工藝及新工藝對魚糜品質(zhì)的影響[12],如鯡魚(herring)[13]、太平洋鱈魚(Pacific whiting)[14]、鱈魚(cod)、石斑魚(rockfish)[15]、鯰魚(catfish)、羅非魚(tilapia)[16]、大西洋黃花魚(Atlantic croaker)[17]、沙丁魚、鯖魚(mackerel)[18]、大西洋鯡魚(Atlantic menhaden)[19]、巨型魷魚(giant squid)、魷魚(jumbo squid)[7,20-21]、鱒魚(trout)[4]、印度鯖魚(Indian mackerel)[22]、黃條紋鲹(yellow stripe trevally)[23]、尼羅羅非魚(Nile tilapia)、寬頭鯰魚(broadhead catfish)[10]、白鰱魚(Silver carp)[24-26]、黑海棱鯡(kilka,Clupeonella cultriventris)[27]等魚均有研究報道。

國內(nèi)也進行了一定研究:付湘晉[2](將pH-shifting翻譯為“酸堿法”)、付慶[28]、王瑛[29]、陳敦喜[30]分別研究了白鰱魚、羅非魚、草魚的pH-shifting魚糜的加工工藝及其膠凝特性。

近年來,這一技術的應用范圍進一步擴展。已有文獻報道采用這一技術提取雞肉蛋白[31]、加工魚蛋白粉[6]、制備可食性蛋白膜[20,23]等。蔣將、熊幼齡等[32]把pH-shifting技術(翻譯為“pH偏離”)用于大豆蛋白、豌豆蛋白改性,其膠凝性顯著提高。pH-shifting魚糜蛋白的營養(yǎng)價值及安全性[33]等也有報道。

總結研究文獻發(fā)現(xiàn),絕大多數(shù)魚的pH-shifting工藝魚糜的凝膠強度優(yōu)于或相當于其傳統(tǒng)水洗魚糜,只有沙丁魚[16]、羅非魚[18]等少數(shù)pH-shifting魚糜凝膠的強度低于水洗魚糜凝膠,大多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)，堿法魚糜品質(zhì)優(yōu)于酸法魚糜。目前的研究主要集中在工藝參數(shù)優(yōu)化和魚糜膠凝特性比較,對pH-shifting魚糜膠凝機制的研究還很少。

3 pH-shifting魚糜膠凝機制研究進展

魚糜凝膠品質(zhì)主要由魚糜蛋白質(zhì)組成、蛋白質(zhì)分子結構及蛋白質(zhì)互作(降解、交聯(lián)、聚集等)決定,而蛋白質(zhì)互作形成的微結構則直接決定了凝膠質(zhì)量。與傳統(tǒng)水洗魚糜相比,pH-shifting魚糜含更多肌漿蛋白,蛋白質(zhì)分子在pH-shifting過程中結構發(fā)生明顯變化,凝膠微結構也與傳統(tǒng)水洗魚糜凝膠有一定差異。

3.1 pH-shifting工藝對魚糜蛋白組分組成及蛋白降解、交聯(lián)的影響

目前,魚糜蛋白組分分析主要采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)。SDS-PAGE能識別肌球蛋白重鏈(MHC,200 kDa)、肌動蛋白(Actin,43 kDa)、原肌球蛋白(Topomyosin,38 kDa)等。SDS-PAGE也是目前研究魚糜凝膠蛋白降解、交聯(lián)的主要方法。采用SDS-PAGE法,研究者從pH-shifting魚糜中發(fā)現(xiàn)了一些新的蛋白條帶。如大西洋黃花魚pH-shifting魚糜中有54、23 kDa蛋白條帶,而水洗魚糜沒有[17]。石斑魚pH-shifting魚糜中發(fā)現(xiàn)120 kDa條帶,推測是MHC的降解產(chǎn)物,pH-shifting魚糜凝膠中Actin、MHC含量均低于水洗魚糜凝膠,膠凝后,酸法魚糜(AC)中120 kDa條帶明顯減少,而堿法魚糜(AK)中120、42 kDa條帶消失,表明不同魚糜中參與膠凝的蛋白質(zhì)有差異[14]。太平洋鱈魚[14]酸法魚糜中Actin、MHC含量明顯降低,出現(xiàn)了124、78、70 kDa的新蛋白組分。羅非魚堿法魚糜[34]含更高的肌動蛋白,而原肌球蛋白條帶消失。孫月娥[35]在白鰱魚魚糜熱致膠凝過程中發(fā)現(xiàn),酸法魚糜蛋白降解非常明顯,但堿法魚糜蛋白未發(fā)生明顯降解;pH-shifting魚糜蛋白在熱致膠凝過程中比傳統(tǒng)水洗魚糜蛋白交聯(lián)更多;此外,36～43 kDa之間的5條帶,不同凝膠中含量差異較大。

從上述研究中可以看出,pH-shifting魚糜中新發(fā)現(xiàn)了許多與魚糜凝膠質(zhì)量相關的蛋白組分,但SDS-PAGE無法鑒定。而且,即使是生化分析已確認的對魚糜凝膠質(zhì)量有重要影響的組織蛋白酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TGase)等,在SDS-PAGE圖片上也無法識別。由于魚糜中蛋白質(zhì)種類多達上千種[36],其中絕大多數(shù)蛋白含量較少,對魚糜凝膠質(zhì)量的影響未知,可以推斷,尚有更多對魚糜凝膠質(zhì)量有重要影響的蛋白質(zhì)組分待發(fā)現(xiàn)。所以,魚糜蛋白膠凝機制研究需要構建分辨率更高的方法,以獲得精確的魚糜熱致膠凝過程中蛋白質(zhì)交聯(lián)、降解圖譜,解析各蛋白組分在膠凝過程中的作用。

以雙向電泳分析(2D-PAGE)為主要技術手段的蛋白質(zhì)組學方法分辨率遠高于傳統(tǒng)的一維SDS-PAGE,如鯽魚肌肉樣品經(jīng)2D-PAGE分析,分離出1000個以上的蛋白質(zhì)點[36]。蛋白質(zhì)組學技術可識別食品品質(zhì)蛋白類決定因子,如Kjaersgard等[37]通過對11種不同冷凍儲存條件下鱈魚肌肉蛋白質(zhì)組圖譜進行分析,識別了與冷凍儲存魚肉質(zhì)地和味道特有變化相關的蛋白質(zhì),如肌球蛋白輕鏈、磷酸丙糖異構酶、醛縮酶A、肌動蛋白片段等。還未有報道采用蛋白質(zhì)組學方法對pH-shifting魚糜及其凝膠進行研究。通過蛋白質(zhì)組學研究,可獲得魚糜熱致膠凝過程中蛋白質(zhì)交聯(lián)、降解圖譜,并有望發(fā)現(xiàn)除MHC、Actin、組織蛋白酶、TGase等以外的與凝膠品質(zhì)相關的蛋白質(zhì)。

3.2 pH-shifting對魚糜中各蛋白組分互作的影響

魚肉含20%～30%肌漿蛋白、66%～77%肌原纖維蛋白。目前主要是以肌原纖維蛋白或肌球蛋白純?nèi)芤耗Ｐ脱芯磕z凝機制。肌漿蛋白組分對肌原纖維蛋白膠凝特性的影響研究集中在組織蛋白酶和TGase,其它組分的影響還研究很少。

Choi、Park研究發(fā)現(xiàn)，組織蛋白酶在pH-shifting工藝的極端低pH條件下活化,并造成MHC、Actin降解[14]。Chaijian[18]發(fā)現(xiàn),沙丁魚、鯖魚堿法魚糜中TGase活性降低,預膠凝效果較差。Perez-Mateos[19]發(fā)現(xiàn)，大西洋鯡魚酸法魚糜中TGase全部失去活性,而堿法對魚糜中TGase活性影響不大。付湘晉[8]在白鰱魚魚糜中發(fā)現(xiàn),熱穩(wěn)定組織蛋白酶活性在pH-shifting酸法(pH2.3)魚糜中殘留較高,而在pH-shifting堿法極端堿性環(huán)境(pH11.8)中失活;pH-shifting對TGase活性影響不大,且pH-shifting魚糜在TGase作用下更易交聯(lián)。Chanarat[22]在印度鯖魚的pH-shifting魚糜中發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象。Jiang和Xiong認為[32],pH-shifting處理可以使蛋白暴露更多的-SH基、谷氨酰胺基、ε-氨基等活性基團,從而有利于蛋白交聯(lián)發(fā)生。

肌漿蛋白中其它組分對肌原纖維蛋白聚集、膠凝的影響不同文獻結論不一致:有報道認為,肌漿蛋白聚集體吸附到肌原纖維蛋白上,干擾肌原纖維蛋白形成凝膠三維網(wǎng)狀結構,使凝膠強度降低[34];但也有報道，認為肌漿蛋白可使魚糜凝膠強度增加,94、40、26 kDa蛋白有積極作用,但未對這些組分進行鑒定[38];Hemug[39]報道肌漿蛋白可顯著提高肌原纖維蛋白凝膠的保水性,且添加了肌漿蛋白的凝膠微結構更加光滑。在pH-shifting加工過程中,肌漿蛋白中存在一些蛋白組分可減輕極端堿性環(huán)境引起的肌球蛋白變性[18],從而對pH-shifting魚糜凝膠有正面作用。

3.3 pH-shifting對魚糜蛋白分子結構、膠凝特性及魚糜凝膠微結構的影響

蛋白質(zhì)分子在pH-shifting的極端酸堿性環(huán)境處理過程中,分子緊密有序的折疊狀態(tài)由于靜電斥力展開,蛋白質(zhì)-水相互作用占優(yōu)勢,蛋白質(zhì)溶解;再在pH調(diào)到等電點時,蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用占優(yōu)勢,蛋白質(zhì)分子重折疊和聚集[12]。重折疊或聚集的蛋白質(zhì)分子與未變性蛋白質(zhì)分子結構上的差異,導致pH-shifting魚糜的膠凝特性與傳統(tǒng)水洗魚糜有較大差異[40]。Paker[26]發(fā)現(xiàn)pH-shifting魚糜G′(儲能模量)顯著高于水洗魚糜,形成凝膠化的溫度更低,作者認為pH-shifting處理使肌原纖維蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)樗^的“熔球態(tài)”,穩(wěn)定性降低,分子表面有更多的活性基團和疏水面積。付湘晉[41]、孫月娥[35]等發(fā)現(xiàn),白鰱魚pH-shifting魚糜G′顯著低于水洗魚糜,原因是魚糜中含較多的變性蛋白聚集體?？梢?不同魚肉蛋白質(zhì)分子在pH-shifting處理過程中發(fā)生的結構變化有很大差異。更合理的解釋是,pH-shifting魚糜由天然態(tài)、熔球態(tài)、聚集態(tài)蛋白質(zhì)組成,三種狀態(tài)的相對比例不同導致不同魚肉pH-shifting魚糜的膠凝特性不同。

“結構決定功能”,凝膠質(zhì)量與其微結構之間存在密切關系。圖1是白鰱魚pH-shifting魚糜(包括酸法魚糜和堿法魚糜)及水洗魚糜凝膠的掃描電鏡圖片[35],從圖1可以看出,水洗魚糜凝膠是三維網(wǎng)狀結構,較均勻;酸法魚糜凝膠、堿法魚糜凝膠三維網(wǎng)狀結構不均勻,且酸法魚糜凝膠中存在大量粗纖維狀蛋白聚集體結構,而堿法魚糜凝膠中存在大量顆粒狀蛋白聚集體結構。即蛋白聚集體可能是導致白鰱魚pH-shifting魚糜凝膠微結構不均勻的原因,但具體機制需深入研究。根據(jù)魚糜膠凝特性及微結構觀察的結果,可以把pH-shifting魚糜凝膠看成是蛋白聚集體與未變性蛋白的共混體系凝膠。

圖1 工藝對魚糜凝膠微結構的影響Fig.1 Effect of process on the microstructure of surimi gel注：WM:水洗魚糜,AC:酸法魚糜,AK:堿法魚糜。

近年來,基于(微)相分離現(xiàn)象的共混體系凝膠微結構形成機制為凝膠微結構多樣性提供了新的解釋[42]。兩種大分子物質(zhì)溶液混合時,由于表面電荷、δ電位、尺寸、形狀差異等導致的熱力學不相容引起相分離,是一個動力學過程,由微(觀)相分離逐步轉(zhuǎn)變?yōu)楹暧^相分離,在溶膠-凝膠體系中,由于黏度較高,這一動力學過程速度較慢,往往尚未發(fā)生明顯宏觀相分離,即已發(fā)生凝膠化,凝膠黏度更高,微相分離被固化,可獲得豐富的不均勻凝膠微結構。Renard等[43]發(fā)現(xiàn),β-乳球蛋白與其乙醇聚集體發(fā)生相分離。李云[44]發(fā)現(xiàn),大豆蛋白熱聚集體與未變性大豆蛋白共混膠凝時發(fā)生微相分離。Tanaka[45]指出,大的聚集體和小的蛋白質(zhì)及亞基共存混合體系是一種典型的動力學不均勻體系,相分離是普遍現(xiàn)象。但肌原纖維蛋白還未見相關報道。

基于此考慮,本文對這種共混凝膠微結構的形成機制作如下分析,如圖2所示。pH-shifting魚糜中蛋白聚集體與未變性蛋白加鹽斬拌時,形成蛋白共混體系,在加熱膠凝后,體系固化,從而得到共混凝膠。

圖2 pH-shifting魚糜共混膠凝機制Fig.2 Co-gelling mechanism for pH-shifting surimi

由于魚糜中蛋白聚集體含量變化,及蛋白聚集體-蛋白聚集體、蛋白聚集體-未變性蛋白、未變性蛋白-未變性蛋白作用強弱不同,混合凝膠可能通過以下方式形成不同的微結構。如果蛋白聚集體自身能膠凝,則:a.蛋白聚集體-未變性蛋白作用強時,可能會以蛋白聚集體為核,以“成核-增長”的方式形成微相分離型不均勻凝膠;b.蛋白聚集體含量較高,蛋白聚集體-蛋白聚集體作用強時,聚集體之間交聯(lián),形成團塊狀、片狀凝膠結構,未變性蛋白熱變性后,以聚集體為中心聚集、交聯(lián),使凝膠結構更加緊密。如果蛋白聚集體自身不能膠凝,則:a.未變性蛋白交聯(lián)形成凝膠網(wǎng)絡,蛋白聚集體吸附在未變性蛋白形成的凝膠網(wǎng)絡骨架上,加強凝膠結構;b.蛋白聚集體作為填充物,干擾凝膠網(wǎng)絡的形成,從而使凝膠網(wǎng)絡不完整,存在較大的孔洞;c.蛋白聚集體作為填充物,與未變性蛋白熱力學不相容,由于空間排阻作用,發(fā)生微相分離,使能形成網(wǎng)絡的未變性蛋白濃縮,從而使網(wǎng)絡骨架變粗,凝膠的強度提高。

由于“結構決定功能”,通過調(diào)控微結構獲得具有不同功能特性的凝膠一直是食品科學家的夢想,所以凝膠微結構形成機制已成為研究熱點。如分形理論、計算機圖形學[46]、X-射線斷層掃描及三維重構技術[47]等均應用于食品凝膠微結構研究。從共混膠凝及微相分離的角度,利用上述理論與技術方法對魚糜凝膠微結構形成機制進行研究,可為魚糜凝膠微結構調(diào)控提供新的思路。

4 pH-shifting工藝對我國魚糜加工業(yè)的意義

近年來,海洋漁業(yè)資源因過度捕撈、海水污染等原因,可用于生產(chǎn)魚糜的優(yōu)質(zhì)海水魚資源越來越少。而我國淡水魚產(chǎn)量居世界第一位,養(yǎng)殖淡水魚產(chǎn)量占世界養(yǎng)殖淡水魚總產(chǎn)量的70%以上,其中,青、草、鰱、鳙、鯉等年產(chǎn)量均達百萬噸以上,能穩(wěn)定供應。所以,發(fā)展淡水魚魚糜是必然趨勢,也是我國的優(yōu)勢。特別以白鰱魚、鳙魚為代表的低值淡水魚,產(chǎn)量大,加工率低。加工成魚糜制品是大量轉(zhuǎn)化低值淡水魚的重要方向。

低值淡水魚魚糜加工中存在的主要技術難點及問題是:a.刺多、細,且多肌間刺,機械采肉時,大量肌肉殘留在魚刺上,加之淡水魚本身個體小、肉薄,所以,采肉率一般不到40%;b.肌漿蛋白中含大量熱穩(wěn)定組織蛋白酶,在熱致膠凝過程中導致魚糜凝膠劣化,傳統(tǒng)魚糜加工工藝用水洗去掉肌漿蛋白,損失了約30%的蛋白質(zhì),進一步降低了產(chǎn)率。pH-shifting魚糜工藝能基本克服上述問題,顯著提高淡水魚魚糜得率和凝膠強度,其工業(yè)化價值很大。如果pH-shifting技術實現(xiàn)工業(yè)化,則低值淡水魚深加工領域?qū)l(fā)生巨大變革;事實上,與pH-shifting類似的工藝在大豆分離蛋白生產(chǎn)上早已實現(xiàn)工業(yè)化。

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