中藥Q0409篩選方改善SAM-P/8小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力*

李健玲, 徐 卉, 張賀平, 付詠梅, 王彥平, 王華東, 陸大祥△, 戚仁斌△

(暨南大學(xué) 1附屬第一醫(yī)院麻醉科， 2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系， 國家中醫(yī)藥管理局病理生理實驗室， 廣東 廣州 510632)

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種由多源性病因引起的進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，其典型特征是神經(jīng)病理和神經(jīng)化學(xué)的改變，可在老年前期起病，但老年期的發(fā)病率更高。根據(jù)國際阿爾茨海默病聯(lián)合會發(fā)布的報告，目前全球約有4 700萬阿爾茨海默病患者；美國阿爾茨海默病協(xié)會2017年度報告，全美大約已有550萬患者，美國每66秒出現(xiàn)一位AD患者，到2050年，這個時間將縮短至33秒[1]?！丁笆濉眹依淆g事業(yè)發(fā)展和養(yǎng)老體系建設(shè)規(guī)劃》預(yù)測，到2020年，全國60歲以上老年人口將增加到2.55億人左右，占總?cè)丝诒戎靥嵘?7.8%左右，2050年更將高達(dá)4.37億。流行病學(xué)統(tǒng)計結(jié)果表明，我國65歲以上老年人AD的罹患率約為老年人口的4.8%左右，并且在以每年5%～7%的速度增長，保守估計我國已有AD患者約600萬～700萬[2]。以AD為代表的老年病日益成為家庭和社會的沉重負(fù)擔(dān)，防治AD不僅是一個高難度的醫(yī)學(xué)問題，也是一個重大的社會問題。本課題組在先前的研究中發(fā)現(xiàn)中藥Q0409篩選方具有較好的改善小鼠學(xué)習(xí)記憶的能力[3]。在本研究中，我們選用AD模型SAM-P/8快速老化系小鼠為研究對象，運用中藥Q0409篩選方進(jìn)行治療性研究，觀察該方對AD疾病模型的治療作用及可能機制。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

健康4月齡SAM-P/8小鼠50只(雌29只，雄21只)，體重(20±5) g；健康4月齡SAM-R/1小鼠21只(雌12只,雄9只)，體重(20±5) g，由北京大學(xué)實驗動物中心提供[動物合格證號：SCXK(京)2002-0001]。健康4月齡昆明小鼠20只，雄雄各半，體重(20±5) g，由廣東省實驗動物中心提供[動物合格證號為SCXK(粵)2003-0002;粵監(jiān)證字為2006A018]。

2 主要試劑與儀器

中藥Q0409篩選方選用人參和遠(yuǎn)志免煎顆粒劑(三九醫(yī)藥)；石杉堿甲(huperzine A, HupA)片(每片50 μg,上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司)；乙酰膽堿酯酶(acetyl cholinesterase，AChE)檢測試劑盒和蛋白定量(雙縮脲法)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；I抗為兔抗β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein,Aβ)1-42親和純化的多克隆抗體(Chemicon International)；II抗為HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)；濃縮型3,3’-二氨基聯(lián)苯胺(3,3’-diaminobenzidine, DAB)試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。視頻自動跟蹤Morris水迷宮(成都泰盟科技有限公司)；Lambda 45紫外/可見光連續(xù)光譜分光光度計(Perkin Elmer)；BX-51數(shù)碼照相顯微鏡(Olympus)。

3 藥物配制

3.1中藥Q0409篩選方溶液的配制 人參和遠(yuǎn)志的中藥免煎顆粒劑用雙蒸水配制成不同配伍的中藥溶液(具體藥物劑量和濃度依據(jù)《中藥藥理學(xué)》[4]確定，遠(yuǎn)志286 g/L，人參238 g/L)。

3.2石杉堿甲溶液的配制 HupA人的劑量為4.29 μg/kg，根據(jù)人與小鼠體表面積換算公式，得出小鼠的劑量約為0.03 μg/g，HupA的劑量為每片含藥50 μg，加入12 mL雙蒸水，終濃度約為4.2 mg/L。

4 實驗方法

4.1動物飼養(yǎng)和給藥 小鼠每天自由飲食、飲水，并定時換墊料，以維持小鼠生活環(huán)境清潔衛(wèi)生。同時每天定時給各組小鼠灌胃相應(yīng)的雙蒸水、中藥和石杉堿甲溶液。

4.2動物分組 實驗前，對小鼠進(jìn)行初步篩選，根據(jù)游泳找到Morris水迷宮平臺的潛伏期，按隨機區(qū)組方法分成5組[5]：(1)昆明小鼠對照組，即正常對照組(control組，n=20)；(2)SAM-R/1小鼠對照組(SAM-R/1組，n=21)；(3)SAM-P/8小鼠組，即疾病模型組(SAM-P/8組,n=17)；(4)中藥Q0409篩選方治療組(SAM-P/8+Q0409,n=16)；(5)石杉堿甲治療組，即陽性藥物對照組(SAM-P/8+HupA組，n=17)。其中，中藥治療組的小鼠每天灌胃相應(yīng)劑量中藥溶液，對照組和疾病模型組的小鼠灌胃相同體積的雙蒸水，陽性藥物對照組的小鼠灌胃相應(yīng)劑量石杉堿甲溶液，連續(xù)60 d(即從4月齡到6月齡)。第61～65天每天先灌胃相應(yīng)劑量中藥、石杉堿甲溶液和雙蒸水(劑量同前)，1 h后，開始進(jìn)行Morris水迷宮實驗。

4.3Morris水迷宮實驗 第61～65天，進(jìn)行Morris水迷宮實驗，整個實驗分為2個過程：定位航行(na-vigation training)和空間探索(spatial probe training)實驗[6]。(1)定位航行實驗：用于檢測動物的學(xué)習(xí)和記憶獲得能力。第61～64天，將平臺置于東北象限的中央，每天分別從東西南北4個入水點將動物背向平臺放入水中，記錄動物游上平臺所需時間即逃避潛伏期，歷時4 d，具體方法與篩選動物時相同；(2)空間探索實驗：用于測量動物對平臺位置的記憶保持能力。最后 1 d，即第65天，撤除平臺，任選1個入水點將動物背向平臺放入水中，讓動物自由游泳60 s，記錄60 s內(nèi)動物穿越原平臺區(qū)的次數(shù)及動物在各象限的游泳時間。所有行為學(xué)測試過程中，保持房間安靜，光線柔和，室內(nèi)參照物位置不變。

4.4小鼠腦海馬組織勻漿 第65天，水迷宮實驗結(jié)束后，立即處死各組剩余小鼠，剝離腦組織中的海馬，置玻璃勻漿器中加入預(yù)冷生理鹽水制成10%(g/mL)腦海馬組織勻漿，待測定腦海馬組織勻漿中乙酰膽堿酯酶的活性。

4.5小鼠大腦的固定 第65天，水迷宮實驗結(jié)束后，每組取雌、雄小鼠，由心臟用4%多聚甲醛固定液灌注固定，約20～30 min后，待小鼠全身硬化時，取出小鼠的大腦組織，置4%多聚甲醛固定液中，鉛筆標(biāo)記，并放入冰箱冷藏保存(4 ℃)備用。

4.6生化檢測 按試劑盒說明書的方法測定各組小鼠腦海馬組織勻漿中乙酰膽堿酯酶的活性。

4.7小鼠海馬組織Aβ蛋白的免疫組化染色 石蠟切片脫蠟和水化后，用PBS(pH 7.4)沖洗3次，每次3 min。根據(jù)抗Aβ抗體的說明書要求和試片的結(jié)果，無需對組織抗原進(jìn)行修復(fù);每張切片加1滴或50 μL 3%過氧化氫，室溫下孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗3次，每次3 min，除去PBS液;每張切片加約40～50 μL的 抗Aβ抗體(1∶10稀釋，終濃度為 50 mg/L)，室溫下孵育放入冰箱冷藏室4 ℃過夜。24 h后，取出冷藏抗原-抗體反應(yīng)的玻片，用PBS沖洗3次，每次3～5 min。除去PBS液，每張切片加1滴或50 μL即用型Max VisionTM試劑(II抗為goat anti-rabbit IgG)，室溫下孵育10～15 min。PBS沖洗3次,每次3 min,除去PBS液，每張切片加2滴新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察3～5 min;自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，PBS或自來水沖洗返藍(lán)，切片經(jīng)過梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，蓋上蓋玻片，中性樹膠封固;待封固好的中性樹膠干燥后，取片于顯微鏡下觀察拍照，采用圖像分析軟件Image-Pro Plus 3.0進(jìn)行分析。為防止可能出現(xiàn)的假陽性和假陰性結(jié)果，在實驗過程設(shè)置陽性與陰性對照。陰性對照即在染色過程中不加 I 抗，以PBS溶液代替，其余步驟完全相同。

5 統(tǒng)計學(xué)處理

小鼠Morris水迷宮定位航行實驗結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用重復(fù)測量方差分析；小鼠Morris水迷宮空間探索實驗結(jié)果、小鼠腦海馬組織勻漿中乙酰膽堿酯酶活性及Aβ沉積陽性面積等數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 中藥Q0409篩選方對小鼠Morris水迷宮實驗行為學(xué)指標(biāo)的影響

1.1各組小鼠Morris水迷宮定位航行實驗結(jié)果 由圖1可見，經(jīng)過4 d尋找隱匿平臺的訓(xùn)練，5組動物的逃避潛伏期均下降(P<0.05)。昆明小鼠對照組與SAM-R/1對照組之間比較，逃避潛伏期的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性；而這2個組的逃避潛伏期均短于SAM-P/8組(P<0.05)，提示疾病模型是可靠的；與SAM-P/8組比較，SAM-P/8+Q0409組和SAM-P/8+石杉堿甲組的逃避潛伏期均縮短(P<0.05),提示SAM-P/8+Q0409組的學(xué)習(xí)記憶能力有所改善。

Figure 1. The avoiding latency of mice in the navigation training every day. Mean±SD.*P<0.05vsSAM-P/8 group.

圖1小鼠在定位航行實驗中逃避潛伏期的比較

1.2各組小鼠Morris水迷宮空間探索實驗結(jié)果的比較 經(jīng)過4 d尋找隱匿平臺的學(xué)習(xí)訓(xùn)練，第5天進(jìn)行記憶實驗，結(jié)果見表1。昆明小鼠對照組與SAM-R/1對照組之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性；而這2個組的目標(biāo)象限停留時間均長于SAM-P/8組，且經(jīng)過平臺次數(shù)均多于SAM-P/8組(P<0.05)，提示疾病模型是可靠的；與SAM-P/8組比較，SAM-P/8+Q0409組和SAM-P/8+石杉堿甲組的目標(biāo)象限停留時間均延長，經(jīng)過平臺次數(shù)均明顯增多(P<0.01)。

表1小鼠第5天游泳經(jīng)過平臺次數(shù)及目標(biāo)象限停留時間
Table 1. The frequencies of mice passing through the platform and the stay time in the aim quadrant of the mice on the 5th day (Mean±SD)

GroupnStay time in the aimquadrant (s)Frequency of mice passing through the platformControl2014.14±4.13△2.05±0.30△SAM-R/12113.40±5.54△2.00±0.29△SAM-P/8179.92±4.560.63±0.17SAM-P/8+Q04091614.89±5.60△△1.94±0.30△△SAM-P/8+HupA1713.58±6.81△1.88±0.30△

△P<0.05,△△P<0.01vsSAM-P/8 group.

2 中藥Q0409篩選方對小鼠海馬組織勻漿乙酰膽堿酯酶活性的影響

由圖2可見，昆明小鼠對照組與SAM-R/1對照組之間海馬組織勻漿AChE活性的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性；這2個組海馬組織勻漿AChE活性明顯低于與SAM-P/8組(P<0.05)，提示疾病模型是可靠的；與SAM-P/8組比較，SAM-P/8+Q0409組和SAM-P/8+石杉堿甲組海馬組織勻漿AChE活性均明顯降低(P<0.01)。

Figure 2. The activity of AChE in the hippocampus of the mice. Mean±SD.△P<0.05,△△P<0.01vsSAM-P/8 group.

圖2小鼠海馬組織勻漿乙酰膽堿酯酶活性的比較

3 中藥Q0409篩選方對SAM-P/8小鼠海馬CA1區(qū)Aβ蛋白表達(dá)的影響

圖3和表2為小鼠大腦海馬CA1區(qū)Aβ蛋白免疫組化染色照片和海馬CA1區(qū)Aβ蛋白沉積的陽性面積的分析結(jié)果。

Figure 3. The photographs of immunohistochemical staining for Aβ in CA1 area of the hippocampus in mice. Left: male; right: female. Scale bar=50 μm.

圖3小鼠大腦海馬CA1區(qū)Aβ蛋白免疫組化染色結(jié)果

表2小鼠海馬CA1區(qū)Aβ蛋白沉積的陽性面積
Table 2. The positive area of Aβ deposition in CA1 area of the hippocampus in mice (mm2. Mean±SD)

GroupMaleFemaleControl0△0△△SAM-R/10△△0△△SAM-P/8 1.757±0.0161.942±0.017SAM-P/8+Q04090.013±0.001△△0.052±0.001△△SAM-P/8+HupA0.375±0.005△△0.547±0.006△△

△△P<0.01vsSAM-P/8 group.

雌雄昆明小鼠和SAM-R/1小鼠的海馬CA1區(qū)均未見DAB著色(棕黃色)，僅見蘇木素復(fù)染后的深藍(lán)色細(xì)胞核和藍(lán)色背景，無Aβ蛋白沉積(陽性面積為0 mm2)。SAM-P/8小鼠的海馬CA1區(qū)，箭頭所指區(qū)域可見成片DAB棕黃著色，且范圍較大、顏色較深，為小鼠腦內(nèi)典型病變“老年斑”(較深的棕黃著色為Aβ蛋白沉積較多的部分)，深藍(lán)色的細(xì)胞核為蘇木素復(fù)染所致，藍(lán)色背景不明顯可能與Aβ蛋白廣泛沉積有關(guān)。SAM-P/8+Q0409組雄鼠的海馬CA1區(qū)僅見散在著色很淺的棕黃色，未見典型的“老年斑”，Aβ蛋白沉積的陽性面積變?。淮剖蠛ｑRCA1區(qū)箭頭所指區(qū)域仍有“老年斑”，但顏色明顯變淺，Aβ蛋白沉積的陽性面積變小；深藍(lán)色細(xì)胞核和藍(lán)色背景為蘇木素復(fù)染所致，提示中藥治療組小鼠海馬Aβ蛋白沉積明顯減少，“老年斑”著色減輕、范圍縮小。SAM-P/8+石杉堿甲組雌雄小鼠海馬CA1區(qū)箭頭所指區(qū)域仍有典型的“老年斑”，雄鼠的斑塊顏色較深但Aβ蛋白沉積的陽性面積明顯減小，雌鼠斑塊顏色變淺且Aβ蛋白沉積的陽性面積減小，深藍(lán)色細(xì)胞核和藍(lán)色背景為蘇木素復(fù)染所致，提示石杉堿甲治療組小鼠海馬“老年斑”有一定程度的減輕。

討 論

AD按發(fā)病人群可分為家族性AD和散發(fā)性AD，家族性AD按年齡又可分為早發(fā)性AD (<65歲)和晚發(fā)性AD (>65歲)。遺傳學(xué)已發(fā)現(xiàn)3類基因，即APP基因、PS-1和PS-2基因及ApoE基因的突變或多態(tài)性與AD的早期發(fā)病有關(guān)。AD有2個特征性病理變化：由神經(jīng)組織淀粉樣斑塊沉積形成的老年斑和由過度磷酸化的tau蛋白組成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)。目前，AD的治療僅能控制疾病發(fā)病初期的癥狀，尚缺乏有效藥物阻止疾病進(jìn)展，已有的研究主要采取阻斷老年斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)形成的方法以延緩疾病進(jìn)程，如提高α-分泌酶活性、抑制β-分泌酶和γ-分泌酶的作用、促進(jìn)Aβ的降解和清除、抑制神經(jīng)纖維纏結(jié)等，但臨床效果不佳[1, 7]。傳統(tǒng)的中醫(yī)療法也從病因、發(fā)病機制及治療等方面對AD作了深入的研究并顯示了自身優(yōu)勢，中醫(yī)藥實驗性治療的成果拓寬了建立多方位靶向治療的思路。本課題組在先前的研究中發(fā)現(xiàn)，中藥Q0409篩選方(人參和遠(yuǎn)志)具有較好的改善小鼠學(xué)習(xí)記憶的能力[3]。其能否在AD的治療中發(fā)揮一定的效果呢？本實驗擬選用AD疾病模型小鼠SAM-P/8快速老化系小鼠為模型，運用中藥Q0409篩選方進(jìn)行干預(yù)，以觀察該方對AD疾病模型的作用及可能機制。同時選用石杉堿甲作為陽性對照藥物。

快速老化小鼠(senescence-accelerated mouse，SAM)具備均一的遺傳背景和穩(wěn)定老化病態(tài)特征[8]。SAM品系中，P8 除具有P品系的一般老化癥狀外，伴快速老化而自然出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶力障礙和低恐怖、低緊張狀態(tài)，為腦老化癡呆模型小鼠。其特點是具有認(rèn)知障礙，且在渡過生長期后(4～6月)，伴快速老化自然發(fā)生，與臨床癡呆的漸進(jìn)性發(fā)生極為相似，與人類衰老和癡呆的臨床特征非常接近，不同于造模動物和轉(zhuǎn)基因動物只具有單一的衰老特征，行為學(xué)、形態(tài)學(xué)、神經(jīng)生化和分子生物學(xué)的研究為此提供了較充足的證據(jù)。目前，美、中、日、韓等國學(xué)者采用此模型進(jìn)行了大量相關(guān)的基礎(chǔ)研究和藥物研究，SAM-P/8系小鼠為我們進(jìn)一步深入理解老化和癡呆的機制提供了一種理想的自然發(fā)病模型[9]。因此，本實驗選擇AD的自然發(fā)病模型小鼠——快速老化系小鼠SAM-P/8作為研究對象，以觀察中藥Q0409篩選方對該AD自然發(fā)病模型的影響。因為SAM-P/8系小鼠衰老發(fā)病的關(guān)鍵時期為4～6月齡，是其機體各方面生理、病理指標(biāo)變化最快、最明顯的時期。有研究證實了4月齡與6月齡SAM-P/8小鼠，各方面指標(biāo)差異明顯，而6月齡、8月齡和12月齡SAM-P/8小鼠則在各方面指標(biāo)差異不明顯[10]。所以，本實驗把藥物(中藥Q0409篩選方或石杉堿甲)的干預(yù)時間選定為4月齡小鼠，連續(xù)給藥2個月。

本研究選用的陽性對照藥物石杉堿甲是我國科學(xué)家于1986 年從民間草藥千層塔(蛇足石杉，Huperziaserrata)中分離得到的一種新型石松類生物堿有效單體[11]，具有極高的選擇性抑制腦內(nèi)乙酰膽堿酯酶和增強腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)元的功能，此外，還具有作用時間長、易透過血腦屏障、口服生物利用度高以及不良反應(yīng)少等多種優(yōu)點，效果優(yōu)于加蘭他敏、多奈哌齊和他克林等臨床藥物[12-13]。

本研究分別從小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力(行為學(xué))、神經(jīng)生化指標(biāo)(海馬組織AChE活性)和組織形態(tài)學(xué)(Aβ蛋白免疫組化)3個方面對中藥Q0409篩選方干預(yù)AD模型小鼠的作用及其初步機制進(jìn)行了探討。

中藥Q0409篩選方治療組小鼠的行為學(xué)測試(Morris水迷宮)結(jié)果顯示，治療組比疾病模型組(SAM-P/8)小鼠在學(xué)習(xí)訓(xùn)練第1～4天的逃避潛伏期明顯縮短，第5天的記憶成績(目標(biāo)象限停留時間和游泳經(jīng)過平臺次數(shù))較疾病模型組小鼠有明顯提高，與2個正常對照組和石杉堿甲治療組的小鼠比較，學(xué)習(xí)和記憶成績的差異均無統(tǒng)計學(xué)顯著性。提示中藥Q0409篩選方可以改善AD自然發(fā)病模型SAM-P/8小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力，與石杉堿甲效果相似。

中藥Q0409篩選方治療組小鼠的神經(jīng)生化指標(biāo)(海馬組織AChE活性)的結(jié)果表明，石杉堿甲治療組(陽性藥物對照組)小鼠海馬組織AChE活性最低，其次是中藥治療組，而活性最高的是疾病模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)顯著性。這一結(jié)果提示,中藥Q0409篩選方改善SAM-P/8小鼠學(xué)習(xí)記憶的能力可能與其具有抑制小鼠海馬區(qū)的AChE活性有關(guān)。

本實驗采用Aβ蛋白特異性抗體的免疫組化染色(DAB顯色)，由免疫組化染色的結(jié)果可以看到，疾病模型小鼠(SAM-P/8系小鼠)海馬區(qū)的Aβ蛋白沉積較為廣泛，部分形成了明顯的“老年斑”，與文獻(xiàn)報道一致[14]；而正常昆明小鼠和SAM-R/1系對照小鼠的Aβ蛋白免疫組化染色均為陰性，僅見蘇木素復(fù)染所致深藍(lán)色的細(xì)胞核和藍(lán)色背景，與SAM-P/8系小鼠差異十分明顯；而中藥Q0409篩選方治療組雄鼠未見典型的“老年斑”，雌鼠可見“老年斑”顏色變淺，二者的海馬CA1區(qū)Aβ蛋白沉積的陽性面積減少，這一結(jié)果與人類的老年性癡呆病存在性別差異的特點亦有相似之處。根據(jù)Aβ蛋白沉積的陽性面積的結(jié)果還可以看出，中藥治療組的Aβ蛋白沉積輕于石杉堿甲治療組。這一結(jié)果提示，中藥Q0409篩選方改善AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用與其減少AD模型小鼠海馬區(qū)的Aβ蛋白沉積有關(guān)。

綜上所述，中藥Q0409篩選方可以明顯提高AD模型小鼠(SAM-P/8小鼠)的學(xué)習(xí)和記憶能力，其初步機制可能與其抑制小鼠海馬區(qū)AChE活性，減少Aβ蛋白沉積，進(jìn)而減輕由Aβ所致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡等有關(guān)；其療效與石杉堿甲相似。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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