下調(diào)USP9X表達(dá)對(duì)胃癌AGS細(xì)胞凋亡和侵襲能力的影響*

張彩鳳，韓 宇，夏永華，杜學(xué)芳，肖懷蔥，趙潤根，張利利，楊雙梅

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 1消化內(nèi)科， 2皮膚科， 3麻醉科， 河南 衛(wèi)輝 453100)

胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一[1]。盡管在早期診斷和治療中具有明顯的進(jìn)展，但胃癌患者仍占全球所有腫瘤相關(guān)死亡的9%[2-3]。因而尋找新的分子靶點(diǎn)對(duì)于胃癌患者的治療具有十分重要的價(jià)值。X染色體連鎖的泛素特異性肽酶 9(ubiquitin-specific peptidase 9, X-linked，USP9X)作為一種去泛素化酶(deubiquitylating enzyme，DUB)能調(diào)控多種不同的信號(hào)途徑[4-5]。USP9X也被證實(shí)參與很多疾病特別是腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[6-10]。USP9X在不同的腫瘤中可能發(fā)揮不同的作用，在胰腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)USP9X的缺失能加速胰腺癌的產(chǎn)生，表明其在胰腺癌中主要是腫瘤抑制基因；但在多發(fā)性骨髓瘤中，USP9X的過表達(dá)與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，提示其可能是癌基因。最近來自胃癌的一項(xiàng)研究表明，USP9X在胃癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，其表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移和腫瘤分期密切相關(guān)，USP9X的高表達(dá)能降低胃癌患者總的生存率，是胃癌患者獨(dú)立的預(yù)后因子[11]，因而在胃癌中USP9X可能發(fā)揮癌基因的作用。但其在胃癌中確切的功能尚不清楚。因此，在本研究中，我們利用RNA干擾技術(shù)下調(diào)胃癌細(xì)胞中USP9X的表達(dá)，分析其表達(dá)下調(diào)對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡和侵襲的影響，并初步探討其可能的分子機(jī)制。該研究有望為以USP9X為靶點(diǎn)的胃癌基因治療奠定基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)材料

人胃癌AGS細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫。脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen；USP9X小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)、對(duì)照siRNA以及鼠抗人USP9X、髓樣細(xì)胞白血病蛋白1(myeloid cell leukemia 1，Mcl-1)、Bax、基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)和β-actin單克隆抗體均購自Santa Cruz；RPMI-1640 購自Life Technologies；胎牛血清購自HyClone；凋亡檢測(cè)試劑盒Annexin V-FITC購自eBiosciences；基質(zhì)膠購自BD。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 胃癌AGS細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)基，并補(bǔ)充10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素，于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)所用的AGS細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期。

2.2siRNA轉(zhuǎn)染及分組 當(dāng)AGS細(xì)胞融合度達(dá)90%左右時(shí)，將USP9X siRNA和對(duì)照siRNA按照脂質(zhì)體2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并于轉(zhuǎn)染后48 h進(jìn)行相關(guān)的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為3組：AGS組(未處理的AGS細(xì)胞)、siRNA control組(用對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞)和USP9XsiRNA組(用USP9XsiRNA轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞)。

2.3Real-time PCR 從各個(gè)不同轉(zhuǎn)染的胃癌AGS細(xì)胞中提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR特定的試劑盒(北京天根生化科技有限公司)將各個(gè)不同的組份加入至反應(yīng)體系中，擴(kuò)增USP9X的上游引物序列為5’-CATGGACCTGGCTCTCAGTG-3’， 下游引物序列為5’-AAACACATGGGGACTTCGCT-3’，產(chǎn)物大小為220 bp；擴(kuò)增內(nèi)參照β-actin的上游引物序列為5’-AACTGGGACGACATGGAGAAAA-3’， 下游引物序列為5’-GGATAGCACAGCCTGGATAGCA-3’，產(chǎn)物大小為192 bp。USP9X的mRNA相對(duì)表達(dá)水平采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。

2.4Western blot實(shí)驗(yàn) 從各個(gè)不同轉(zhuǎn)染的胃癌AGS細(xì)胞中提取總蛋白，采用SDS-PAGE對(duì)蛋白進(jìn)行分離，然后將其轉(zhuǎn)膜，封閉后加入針對(duì)USP9X、Mcl-1、Bax、MMP-2和β-actin的 I 抗，然后加入 II 抗，最后采用ECL發(fā)光液進(jìn)行曝光顯示出特定的蛋白條帶，蛋白的相對(duì)表達(dá)水平=目的蛋白的灰度值/β-actin的灰度值。

2.5CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 將不同處理的胃癌AGS細(xì)胞接種至96孔板中，每孔為2 000個(gè)細(xì)胞。按照CCK-8試劑盒(中國碧云天生物工程有限公司)的說明書，檢測(cè)不同時(shí)點(diǎn)AGS細(xì)胞的活力。最后利用GraphPad Prism 6.0軟件繪制細(xì)胞的生長曲線。

2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡USP9XsiRNA和對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染胃癌AGS細(xì)胞后于48 h收獲細(xì)胞，采用預(yù)冷PBS緩沖液漂洗，按1×109/L的密度重懸細(xì)胞，接著取100 μL細(xì)胞置于流式管中，加入Annexin V-FITC和碘化丙啶各5 μL，于避光下孵育15 min后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)10 000個(gè)細(xì)胞，最后采用CellQuest軟件分析細(xì)胞凋亡的結(jié)果。

2.7Boyden小室檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力 將各個(gè)不同處理的胃癌AGS細(xì)胞(每組1×105個(gè))分別懸浮在含有0.2%小牛血清的800 μL培養(yǎng)基中，然后將各個(gè)不同處理的胃癌AGS依次接種至Boyden小室的上層，培養(yǎng)6 h。然后收集濾膜下層的細(xì)胞，并采用甲醇進(jìn)行固定，并通過HE染色來觀察下層細(xì)胞的數(shù)量，最后通過計(jì)算濾膜下層的細(xì)胞數(shù)來評(píng)估其穿膜的細(xì)胞數(shù)(30個(gè)視野，×200)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，3組之間差異的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 USP9X siRNA下調(diào)胃癌AGS細(xì)胞中USP9X的mRNA表達(dá)

Real-time PCR結(jié)果表明，USP9XsiRNA組中USP9X的mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著低于未處理的AGS組和對(duì)照siRNA組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);然而，未處理的AGS組和對(duì)照siRNA組之間USP9X的mRNA相對(duì)表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖1。

Figure 1. The mRNA expressions of USP9X in the AGS cells with different treatments detected by real-time PCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsAGS group and siRNA control group.

圖1Real-timePCR檢測(cè)各個(gè)不同處理的AGS細(xì)胞中USP9XmRNA的表達(dá)

2 USP9X siRNA下調(diào)胃癌AGS細(xì)胞中USP9X蛋白的表達(dá)

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，USP9XsiRNA組中USP9X蛋白的表達(dá)水平顯著低于未處理的AGS組和對(duì)照siRNA組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；然而，未處理的AGS組和對(duì)照siRNA組之間USP9X蛋白表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖2。

Figure 2. The protein expression of USP9X in the AGS cells with different treatments. Mean±SD.n=4.*P<0.05vsAGS group and siRNA control group.

圖2USP9X蛋白在各個(gè)不同處理的AGS細(xì)胞中的表達(dá)

3 USP9X表達(dá)下調(diào)顯著抑制胃癌AGS細(xì)胞的活力

CCK-8實(shí)驗(yàn)分析不同處理組別AGS細(xì)胞的活力，結(jié)果見圖3。與未處理組和對(duì)照siRNA組相比，USP9XsiRNA轉(zhuǎn)染的AGS細(xì)胞的活力顯著受到抑制，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；然而，未處理組的AGS細(xì)胞和對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染的AGS細(xì)胞之間相比，其細(xì)胞活力的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

Figure 3. The effect of USP9X down-regulation on the viability of gastric carcinoma AGS cells. Mean±SD.n=4.*P<0.05vsAGS group and siRNA control group.

圖3USP9X表達(dá)下調(diào)對(duì)胃癌AGS細(xì)胞活力的影響

4 下調(diào)USP9X表達(dá)對(duì)胃癌AGS細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，USP9XsiRNA組中胃癌細(xì)胞的早期凋亡率顯著高于未處理的AGS組和對(duì)照siRNA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);此外，USP9XsiRNA組中胃癌AGS細(xì)胞的活細(xì)胞比率顯著低于未處理的AGS組和對(duì)照siRNA組(P<0.01),見圖4。

5 下調(diào)USP9X表達(dá)對(duì)胃癌AGS細(xì)胞侵襲能力的影響

Boyden小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，USP9XsiRNA組中胃癌AGS細(xì)胞的穿膜數(shù)顯著低于未處理的AGS組和對(duì)照siRNA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);然而，未處理的AGS組和對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染的AGS組相比，胃癌AGS細(xì)胞穿膜數(shù)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖5。

6 下調(diào)USP9X表達(dá)對(duì)凋亡和侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步探討USP9X在胃癌細(xì)胞凋亡和侵襲調(diào)控中的可能分子機(jī)制，我們采用Western blot檢測(cè)不同處理組別胃癌AGS細(xì)胞中Mcl-1、Bax和MMP-2蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，與未處理的AGS組和對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染的AGS組相比，USP9X siRNA組中Mcl-1和MMP-2表達(dá)顯著下調(diào)，而Bax蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05或P<0.01)，提示USP9X表達(dá)下調(diào)介導(dǎo)的凋亡和侵襲能力變化可能與Mcl-1、Bax和MMP-2表達(dá)變化密切相關(guān),見圖6。

Figure 4. The effects of down-regulation of USP9X expression on apoptosis of gastric carcinoma AGS cells. Mean±SD.n=4.**P<0.01vsAGS group and siRNA control group.

圖4USP9X表達(dá)下調(diào)對(duì)胃癌AGS細(xì)胞凋亡的影響

Figure 5. Down-regulation of USP9X expression inhibited invasion ability of gastric carcinoma AGS cells (HE staining,×200). Mean±SD.n=4.**P<0.01vsAGS group and siRNA control group.

圖5USP9X表達(dá)下調(diào)抑制胃癌AGS細(xì)胞的侵襲能力

Figure 6. The protein expression of Mcl-1, Bax and MPP-2 in the AGS cells with different treatments determined by Western blot. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsAGS group and siRNA control group.

圖6Westernblot檢測(cè)各個(gè)不同處理的AGS細(xì)胞中Mcl-1、Bax和MMP-2蛋白的表達(dá)

討 論

研究表明，泛素化在蛋白質(zhì)降解和蛋白質(zhì)功能調(diào)控中發(fā)揮重要作用[12]，這個(gè)過程受泛素連接酶和去泛素化酶的精確調(diào)控[13]。USP9X作為去泛素酶家族的成員之一，能使底物去泛素化，并使其在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在，從而調(diào)控多種不同的細(xì)胞功能。研究表明，高表達(dá)的USP9X通過調(diào)控特定的基因從而牽涉到腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移，如Mcl-1、β-catenin和轉(zhuǎn)化生長因子-β等。最近研究進(jìn)一步顯示在人腫瘤組織中USP9X的表達(dá)與Mcl-1(Bcl-2家族的成員之一)相關(guān)[7]，提示USP9X可能參與腫瘤細(xì)胞的凋亡調(diào)控，因而可能成為腫瘤分子靶向治療潛在的分子靶點(diǎn)。

由于去泛素化酶包括USP9X在許多人類腫瘤中發(fā)揮重要作用[14]，因此有必要開發(fā)特異性的去泛素化酶抑制劑作用于腫瘤潛在的治療靶點(diǎn)。在本研究中，我們首先采用RNA干擾技術(shù)，將USP9XsiRNA轉(zhuǎn)染胃癌AGS細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其在48 h能顯著抑制胃癌AGS細(xì)胞中USP9X mRNA和蛋白的表達(dá)，這一結(jié)果為進(jìn)一步探討USP9X在胃癌中的功能奠定基礎(chǔ)。

研究表明，USP9X牽涉到許多重要的細(xì)胞生物學(xué)過程的調(diào)控，如細(xì)胞黏附、侵襲、轉(zhuǎn)移以及細(xì)胞凋亡等。Dupont等[15]發(fā)現(xiàn)USP9X能調(diào)控細(xì)胞的黏附過程，這主要通過β-catenin和E-cadherin表達(dá)的變化發(fā)揮作用。此外，USP9X能調(diào)控mTOR和TGFβ信號(hào)途徑，這些信號(hào)途徑廣泛參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。USP9X也能通過調(diào)控p53和抗凋亡蛋白Mcl-1從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的凋亡過程[7]。這些研究從分子水平解析USP9X在調(diào)控腫瘤細(xì)胞侵襲和凋亡中所涉及的關(guān)鍵分子事件。此外，F(xiàn)u等[11]研究小組研究胃癌組織中USP9X的表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)USP9X的表達(dá)與Mcl-1呈正相關(guān)，并且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、腫瘤分期密切相關(guān)，提示USP9X可能在胃癌細(xì)胞凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，但確切的生物學(xué)功能尚不清楚。因此，在目前的研究中，我們采用流式細(xì)胞術(shù)和Boyden小室檢測(cè)下調(diào)USP9X表達(dá)對(duì)胃癌AGS細(xì)胞凋亡和侵襲的影響，結(jié)果表明下調(diào)USP9X表達(dá)能明顯誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，并顯著降低胃癌細(xì)胞的侵襲能力，這些結(jié)果提示USP9X可能在胃癌細(xì)胞的凋亡和侵襲過程中發(fā)揮重要的作用。此外，在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步分析不同處理的胃癌AGS細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Mcl-1和Bax以及侵襲相關(guān)蛋白MMP-2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)下調(diào)USP9X表達(dá)能明顯降低Mcl-1和MMP-2的表達(dá)，但顯著增加Bax蛋白的表達(dá)，這可能是下調(diào)USP9X表達(dá)引發(fā)胃癌細(xì)胞凋亡和侵襲改變的原因之一，但確切的分子機(jī)制仍需要進(jìn)一步闡明。

總之，本研究采用的USP9XsiRNA能顯著下調(diào)胃癌細(xì)胞中USP9X mRNA和蛋白的表達(dá)水平，其表達(dá)水平的下調(diào)誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡和降低其侵襲能力，并明顯降低Mcl-1和MMP-2的表達(dá)，但顯著增加Bax蛋白的表達(dá)。這些研究表明未來進(jìn)一步闡明其詳細(xì)的分子調(diào)控機(jī)制有望為以USP9X為靶點(diǎn)的胃癌的分子靶向治療提供理論依據(jù)。

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