枸杞多糖減輕過氧化氫誘導的人內(nèi)皮樣細胞EA.hy926氧化損傷*

王玉林，呂林林，王 霞，高永清，周 兆，劉革修△，王林靜△

(1廣東藥學院公共衛(wèi)生學院， 廣東 廣州 510006； 2暨南大學基礎(chǔ)醫(yī)學院血液學研究所， 廣東 廣州 510632)

心腦血管疾病是我國發(fā)病率與致殘率較高的疾病之一，嚴重影響著人們的生活質(zhì)量。心腦血管疾病的發(fā)生機制極其復雜，其可能受到同型半胱氨酸[1]、炎癥[2]、高血脂、高血糖[3]和高血壓等不良刺激的影響，致機體氧化與抗氧化失衡，從而不同程度地損傷血管內(nèi)皮細胞，發(fā)生多種心腦血管疾病和嚴重的并發(fā)癥。在正常生理條件下，血管內(nèi)皮細胞不僅維持血管的完整性還具有內(nèi)分泌功能，分泌內(nèi)皮素和一氧化氮(nitric oxide,NO)等血管活性物質(zhì)，進而調(diào)節(jié)血管的舒縮功能，與機體的生理活動相協(xié)調(diào)。因此，保護和預防血管內(nèi)皮細胞損傷在心腦血管疾病的防治中起著重要性的作用。

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)枸杞多糖(Lyciumbarbarumpolysaccharides，LBP)是從枸杞子中提取的一種多聚糖與多肽和蛋白質(zhì)結(jié)合的可溶性復合物, 主要由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖和鼠李糖 6 種單糖組成，有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、降血糖和增強免疫功能等多種廣泛重要的生物活性作用[4]，比如其能減輕過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)誘導的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞的損傷[5]。但枸杞多糖防治血管內(nèi)皮細胞損傷的作用機制尚未闡明。因此，本研究將探討LBP對過氧化氫損傷的EA.hy926細胞活力、遷移和凋亡等生物學特性的影響以及參與調(diào)控的潛在信號通路，為開發(fā)LBP及其類似物治療和治療心腦血管損傷性疾病提供依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

人內(nèi)皮樣細胞EA.hy926購自中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所細胞資源中心；枸杞多糖由暨南大學藥學院葉文才教授課組提供；30% H2O2購自廣州化學試劑廠；高糖DMEM培養(yǎng)基(HyClone)； CCK-8試劑(日本同仁公司)；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和0.25%胰酶(Sigma-Aldrich)；吖啶橙(acridine orange，AO)和溴乙啶(ethidium bromide，EB)購自MYM Technologies Limited；血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) ELISA試劑盒和NO檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinsitol 3-kinase，PI3K)抑制劑LY294002(Selleck)；ECL化學發(fā)光試劑盒(Thermo)；兔抗人cleaved caspase-3單克隆抗體、鼠抗人Bcl-2單克隆抗體、兔抗人Akt單克隆抗體、鼠抗人p-Akt單克隆抗體、兔抗人內(nèi)皮型NO合酶(endothelial NO synthase,eNOS)單克隆抗體、兔抗人p-eNOS(Ser1177)單克隆抗體和鼠抗人β-actin單克隆抗體(CST)。

2 主要方法

2.1細胞培養(yǎng) 將凍存的EA.hy926細胞復蘇，轉(zhuǎn)移到25 cm2細胞培養(yǎng)瓶，加入含1%青鏈霉素和10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)期細胞進行實驗。

2.2實驗分組 實驗分為5個組：對照(control)組，損傷模型(damage)組(50 mmol/L H2O2)、LBP組(100 mg/L LBP)、抗損傷(anti-damage)組[分為3個亞組，分別用50 mg/L(low dose)、100 mg/L(medium dose)和200 mg/L(high dose)枸杞多糖預處理1 h后加入50 mmol/L H2O2，之后共處理24 h]和LY294002組(在抗損傷組的基礎(chǔ)上加入PI3K抑制劑LY294002，濃度為20 μmol/L)。

2.3CCK-8法檢測細胞活力 取對數(shù)期細胞制成細胞懸液，調(diào)整密度為5×107/L，每孔100 μL細胞懸液接種到96孔板，在5% CO2、37 ℃和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，更換成新鮮的含10% FBS高糖DMEM培養(yǎng)基后，按分組加入相應藥物處理，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，收集上清液，換上新的培養(yǎng)基并每孔加入10 μL CCK-8溶液，培養(yǎng)箱中避光孵育2 h，于酶標儀450 nm(參比波長為630 nm)處檢測各組的吸光度，實驗設(shè)4個復孔，重復4次。

2.4劃痕法測定細胞遷移能力 取對數(shù)期生長的EA.hy926細胞制成細胞懸液，按每孔1×106的密度接種于6孔板，待細胞生長至80%融合，使用無菌的200 μL槍頭垂直于6孔板均勻地劃4條互相垂直的橫線，PBS洗去脫落的細胞，然后加入新鮮含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，并加入LBP使其終濃度為100 mg/L，處理1 h；然后，damage組和anti-damage組分別加入H2O2使其終濃度均為50 mmol/L繼續(xù)培養(yǎng)，分別于0 h、12 h、24 h和48 h，在帶有拍照系統(tǒng)的倒置顯微鏡(Leica)下觀察拍照，然后使用ImageJ軟件對各組在不同時間點的劃痕寬度進行相對測量。

2.5流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期的EA.hy926細胞制成細胞懸液，按每孔1×106個接種于6孔板中，培養(yǎng)12 h后，加入LBP使其終濃度為100 mg/L，預處理1 h；然后對damage組和anti-damage組加入H2O2使其終濃度為50 mmol/L，培養(yǎng)24 h后，胰酶消化后，用1 000 r/min離心機離心5 min收集細胞進行Annexin V-FITC+PI染色，染色方法參照試劑盒，然后在流式細胞儀(BD)上檢測。

2.6AO/EB染色檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期的EA.hy926細胞制成細胞懸液，按每孔50 000的密度接種于25T培養(yǎng)瓶中，10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當細胞長至70%～80%融合時，加入LBP使其終濃度為100 mg/L，預處理1 h后加入H2O2使其終濃度為50 mmol/L；在37 ℃、5% CO2且飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，收集所有細胞(包括細胞培養(yǎng)液中的)進行AO/EB染色，將收集的細胞用適量的PBS重懸混勻，并吸取50～100 μL的細胞混懸液于載玻片上進行涂片，接著滴加50 μL的AO/EB混合液(濃度均為10 mg/L)并蓋上蓋玻片，然后立即在正立熒光顯微鏡(Leica)下拍照觀察。

2.7Griess法檢測細胞上清NO水平 取對數(shù)生長期的EA.hy926細胞制成細胞懸液，按每孔1×106個接種于6孔板中，培養(yǎng)12 h后，加入LBP使其終濃度為100 mg/L，預處理1 h后加入H2O2使其終濃度為50 mmol/L；培養(yǎng)30 min后收集細胞上清液，按照試劑盒操作測定 NO 水平。首先制作標準曲線，采用分光光度計在 450 nm 波長處檢測各組的吸光度。

2.8ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清VEGF的水平 取對數(shù)生長期的EA.hy926細胞制成細胞懸液，按每孔1×106個接種于6孔板中，培養(yǎng)12 h后，加入LBP使其終濃度為100 mg/L，預處理1 h后加入H2O2使其終濃度為50 mmol/L；培養(yǎng)30 min后收集細胞培養(yǎng)上清，按照試劑盒操作測定VEGF水平。采用分光光度計在 450 nm 波長處檢測各組的吸光度。

2.9Western blot檢測蛋白水平 取對數(shù)生長期的EA.hy926細胞制成細胞懸液，置于10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當細胞長至70%～80%融合時，加入LBP使其終濃度為100 mg/L，預處理1 h后加入H2O2使其終濃50 mmol/L；在37 ℃、5% CO2且飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，RIPA法提取細胞總蛋白，BCA試劑盒定量，100 ℃變性5 min后上樣，SDS-PAGE 60 V，30 min后，改為110 V，60 min，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，TBST漂洗后，5%脫脂奶粉封閉 1 h，孵育 I 抗過夜，TBST漂洗3次，II 抗搖床孵育1 h，TBST漂洗3次，ECL試劑盒顯色，最后在全自動化學發(fā)光和熒光凝膠成像系統(tǒng)(UVITEC)中顯影拍照觀察，并用Gel-Pro Analyzer 6.0 軟件對照片進行分析。

3 統(tǒng)計學處理

用SPSS 13.0進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析，用Graph-Pad Prism 7.00進行統(tǒng)計繪圖。所有實驗均重復4次，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較各組方差齊時用Student-Newman-Keuls (SNK)檢驗，方差不齊時采用Tamhane’s T2法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 LBP對H2O2損傷的EA.hy926細胞活力的影響

與control組相比，damage組EA.hy926細胞的活力明顯降低(P<0.05)；與damage組比較，LBP預處理能明顯提高細胞活力(P<0.05)；LBP的me-dium dose(100 mg/L)組提高細胞活力最明顯(P<0.05)，但low dose組和high dose組之間的差異無統(tǒng)計學顯著性，故選LBP濃度為100 mg/L用于后續(xù)實驗，見圖1。

Figure 1. The effects ofLyceumbarbarumpolysaccharides (LBP) on the viability of EA. hy926 cells induced by H2O2. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsdamage group;△P<0.05vsmedium dose group.

圖1枸杞多糖對H2O2損傷的EA.hy926細胞活力的影響

2 LBP對H2O2誘導的EA.hy926細胞凋亡及其形態(tài)學的影響

2.1LBP對H2O2誘導的EA.hy926細胞凋亡的影響 經(jīng)100 mg/L的LBP預處理1 h后，加入H2O2(50 mmol/L)處理24 h，EA.hy926細胞的凋亡情況所示，與control組相比，damage組的細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)；與damage組相比，anti-damage的凋亡率顯著下降(P<0.05)；LBP組的凋亡率與control組的凋亡率比較差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖2。

Figure 2. The effect of LBP on the apoptosis of EA.hy926 cells induced by H2O2. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsdamage group.

圖2LBP對H2O2誘導的EA.hy926細胞凋亡的影響

2.2LBP對H2O2誘導的EA.hy926細胞形態(tài)學的影響 AO能透過所有的細胞膜，并將其染成綠色，只有細胞膜不完整的細胞可以吸收EB，將核染成紅色。因此，活細胞擁有正常的綠色；早期凋亡細胞的核綠色更明顯，并且核內(nèi)染色體出現(xiàn)片段狀；晚期凋亡細胞出現(xiàn)聚縮的片段化橙色染色體；壞死細胞則顯示橙色核。經(jīng)H2O2(50 mmol/L)處理24 h后收集細胞，經(jīng)AO/EB染色，細胞的形態(tài)發(fā)生明顯改變；control組的細胞呈正常的圓形且擁有綠色的細胞核，而damage組的細胞呈現(xiàn)大量的紅色細胞核；anti-damage組的細胞有少部分細胞核呈現(xiàn)紅色；LBP組的細胞形態(tài)和control組比較無明顯區(qū)別，見圖3。

3 LBP對H2O2誘導的EA.hy926細胞培養(yǎng)上清中NO和VEGF水平的影響

與control組相比，damage組的NO濃度顯著降低(P<0.05)；與damage組比較，anti-damage組的NO濃度明顯升高(P<0.05);與anti-damage組比較，LY294002組的NO濃度顯著降低(P<0.05)，提示LBP通過提高NO水平減輕H2O2對EA.hy926細胞的損傷作用，見圖4A。與control組比較，damage組的VEGF濃度顯著降低；與damage組比較，anti-damage組的VEGF濃度明顯升高(P<0.05)；與anti-damage組比較，LBP組的VEGF濃度顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4B。

4 LBP對H2O2誘導的EA.hy926細胞遷移能力的影響

劃痕實驗中，隨著時間的延長(0 h、12 h、24 h和48 h)各實驗組的劃痕相對距離在逐漸減小，見表1。12 h后damage組與control組劃痕間的相對距離比較明顯增加(P<0.05)。與damage組比較，anti-damage組的劃痕相對距離明顯縮短(P<0.05)。LBP組與control組比較差異無統(tǒng)計學顯著性，提示枸杞多糖對EA.hy926細胞的遷移有促進作用，見圖5及表1。

Figure 3. The influence of LBP on the morphlogical changes of H2O2-induced EA.hy926 cells. The scale bar=100 μm.

圖3LBP對H2O2誘導的EA.hy926細胞形態(tài)學的改變

Figure 4. The effects of LBP on the contents of NO (A) and VEGF (B) in H2O2-induced EA.hy926 cells. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsdamage group;△P<0.05vsanti-damage group.

圖4LBP對H2O2誘導的EA.hy926細胞培養(yǎng)上清中NO和VEGF含量的影響

Figure 5. The effects of LBP on the migration ability of EA.hy926 cells induced by H2O2(×100).

圖5LBP對H2O2誘導的EA.hy926細胞遷移的影響

表1不同時點LBP對H2O2誘導的EA.hy926細胞相對遷移距離的影響
Table 1. The migration distances of the EA.hy926 cells pretreated with LBP under H2O2induction at different time points (μm. Mean±SD.n=4)

Group0 h12 h24 h48 hControl574±23316±12136±2653±17Damage571±16447±11?351±45?195±15?Anti-damage562±18383±48?#328±32#105±14?#LBP568±10376±28185±35#△93±24#

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsdamage group;△P<0.05vsanti-damage group.

5 LBP 對受H2O2損傷的EA.hy926細胞p-Akt、cleaved caspase-3、eNOS、p-eNOS、Bax和Bcl-2蛋白水平的影響

Western blot實驗結(jié)果顯示，與control組相比，damage組的Bcl-2/Bax比值及eNOS和p-eNOS蛋白水平降低,cleaved caspase-3蛋白水平升高(P<0.05)；與damage組比較，anti-damage組的Bcl-2/Bax比值升高,cleaved caspase-3蛋白水平降低，eNOS和p-eNOS蛋白水平顯著升高(P<0.05);與anti-damage組比較，LY294002組的p-Akt蛋白水平顯著降低(P<0.05)，見圖6。這一結(jié)果提示LBP對EA.hy926細胞的保護作用與PI3K/Akt信號通路有關(guān)。

Figure 6. The effects of LBP on the protein levels of Bax, Bcl-2, p-Akt, eNOS， p-eNOS and cleaved casepase-3 in the EA.hy926 cells. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsdamage group;△P<0.05vsanti-damage group.

圖6EA.hy926細胞Bax、Bcl-2、eNOS、p-eNOS、p-Akt和cleavedcaspase-3蛋白水平的變化

討 論

動脈粥樣硬化是心腦血管疾病的主要發(fā)病因素，而血管內(nèi)皮氧化應激反應則是動脈粥樣硬化重要發(fā)病機制之一[6]。一方面，氧化應激產(chǎn)生的氧自由基可以增加內(nèi)皮細胞通透性，有利于脂質(zhì)成分進入內(nèi)皮下，引起炎癥反應，導致LDL轉(zhuǎn)變形成ox-LDL、誘發(fā)動脈粥樣硬化的發(fā)生;另一方面，氧化應激中的氧自由基不僅刺激內(nèi)皮細胞分泌促進血管收縮的物質(zhì)，影響內(nèi)皮依賴性血管舒張功能缺陷，進而加速血管管壁的重構(gòu)，而且過度的氧化應激可以促進內(nèi)皮細胞的凋亡[7]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LBP預處理減輕H2O2對EA.hy926細胞的損傷,提高其細胞活力，改善其遷移能力，提高了分泌VEGF的水平； LBP通過上調(diào)Bcl-2蛋白表達，下調(diào)Bax蛋白表達，增加Bcl-2/Bax比值，降低cleaved caspase-3蛋白水平，從而抑制H2O2誘導的內(nèi)皮細胞凋亡。細胞凋亡通常涉及到2種信號通路，包括線粒體通路和細胞死亡受體通路。氧化應激發(fā)生時，線粒體膜電位降低，并釋放大量的氧化應激產(chǎn)物。線粒體通路的特征是線粒體釋放細胞色素C，隨后形成一種細胞色素C/Apaf-1復合物，進一步激活caspase。細胞死亡受體通路的特征是細胞死亡受體與其配體結(jié)合，然后激活caspase-3，最終誘導細胞凋亡[8-9]。本研究中，H2O2處理后上調(diào)cleaved caspase-3蛋白表達，LBP預處理下調(diào)cleaved caspase-3蛋白表達，表明LBP通過抑制caspase信號通路的激活，從而抑制了H2O2對EA.hy926細胞的損傷。為探究預處理的藥物對細胞形態(tài)的變化情況，本實驗采用AO/EB染色在熒光顯微鏡下觀察到，H2O2處理的EA.hy926細胞的核染色質(zhì)呈明顯的紅色；LBP預處理的核染色質(zhì)大部分呈現(xiàn)正常的綠色，少部分呈紅色；結(jié)果顯示LBP對H2O2誘導的細胞凋亡具有明顯的抑制作用。

研究表明，eNOS對血管活性具有重要調(diào)節(jié)作用，多種刺激因子通過激活PI3K/Akt信號通路調(diào)節(jié)其表達[10-11]。為了進一步研究LBP對H2O2損傷的EA.hy926細胞的保護作用機制是否與PI3K/Akt/eNOS信號通路有關(guān)，本研究中，與damage組比較，LBP預處理提高細胞上清液中NO水平和上調(diào)p-Akt、eNOS和p-eNOS蛋白水平。加入PI3K抑制劑后，發(fā)現(xiàn)細胞上清液NO水平和p-Akt蛋白水平明顯下降且有統(tǒng)計學意義，說明LBP改善血管內(nèi)皮細胞損傷的作用消失。可以得出結(jié)論的是LBP對H2O2損傷的EA.hy926細胞保護作用機制是激活PI3K/Akt/eNOS信號通路有關(guān)。

綜上所述，LBP對H2O2誘導EA.hy926細胞損傷有保護作用，其機制是激活PI3K/Akt/eNOS信號通路，上調(diào)p-Akt、eNOS、p-eNOS和Bcl-2的蛋白水平，下調(diào)cleaved caspase-3和Bax的蛋白水平，提高內(nèi)皮細胞的活力及NO和VEGF水平。本研究為體外實驗，還需要做體內(nèi)實驗進一步研究LBP對H2O2損傷的機體的整體調(diào)節(jié)作用，為其在以后的臨床應用中提供更多的價值。LBP作為中國的一種傳統(tǒng)的中草藥，其對機體有較少的副作用，可以有效的預防和治療心腦血管疾病及其并發(fā)癥的發(fā)生，在臨床上長期使用具有潛在的前景。

[參 考 文 獻]

[1] Moselhy SS, Demerdash SH. Plasma homocysteine and oxidative stress in cardiovascular disease[J]. Dis Mar-kers, 2003, 19(1):27-31.

[2] García N, Zazueta C, Aguilera-Aguirre L. Oxidative stress and inflammation in cardiovascular disease[J]. Oxid Med Cell Longev, 2017, 27(5):1942-1994.

[3] Kayama Y, Raaz U, Jagger A, et al. Diabetic cardiovascular disease induced by oxidative stress[J]. Int J Mol Sci, 2015, 16(10):25234-25263.

[4] 馬倩倩, 李 駿, 張松杰, 等. 枸杞多糖生物活性的研究進展[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工, 2017, 14(7): 59-61, 66.

[5] Shan T, Shan T, Liu F, et al. Effects of Lycium barbarum polysaccharides on the damage to human endometrial stromal cells induced by hydrogen peroxide[J]. Mol Med Rep, 2017, 15(2):879-884.

[6] Liu L, Lao W, Ji QS, et al. Lycium barbarum polysaccharides protected human retinal pigment epithelial cells against oxidative stress-induced apoptosis[J]. Int J Ophthalmol, 2015, 8(1):11-16.

[7] 駱瑩瑩, 陳 述, 王大新. 氧化應激對動脈粥樣硬化內(nèi)皮細胞損傷作用的研究進展[J]. 醫(yī)學綜述, 2015, 21(5):772-775.

[8] Park WH. Anti-apoptotic effect of caspase inhibitors on H2O2-treated HeLa cells through early suppression of its oxidative stress[J]. Oncol Rep, 2014, 31(5):2413-2421.

[9] Park WH. Antiapoptotic effects of caspase inhibitors on H2O2-treated lung cancer cells concerning oxidative stress and GSH [J]. Mol Cell Biochem, 2017, 441(1-2):125-134.

[10] Xu L, Zhu J, Yin W, et al. Astaxanthin improves cognitive deficits from oxidative stress, nitric oxide synthase and inflammation through upregulation of PI3K/Akt in diabetes rat[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015, 8(6):6083-6094.

[11] Chang CM, Su YF, Chang CZ, et al. Progesterone attenuates experimental subarachnoid hemorrhage-induced vasospasm by upregulation of endothelial nitric oxide synthase via akt signaling pathway[J]. Biomed Res Int, 2014, 13(6):2314-6141.