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    磷尾礦土壤中解磷細(xì)菌的篩選及解磷能力的測(cè)定

    2018-06-29 06:47:16陳佳興秦琴邱樹毅王雪酈
    生物技術(shù)通報(bào) 2018年6期
    關(guān)鍵詞:解磷磷礦單胞菌

    陳佳興 秦琴 邱樹毅 王雪酈,3

    (1. 貴州省貴州大學(xué)發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴陽(yáng) 550025;2. 貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院,貴陽(yáng) 550025;3.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,貴陽(yáng) 550025)

    中國(guó)是一個(gè)磷礦資源豐富的大國(guó),據(jù)2013-2014年美國(guó)地質(zhì)調(diào)查局研究數(shù)據(jù)顯示,中國(guó)現(xiàn)有磷礦儲(chǔ)量約37億t,占全球儲(chǔ)量的5.5%,位居全球第二[1-2]。中國(guó)磷礦資源雖豐富但分布極為不均,主要集中在云南、四川、貴州、湖北等地區(qū)[3]。除分布不均外,中國(guó)磷礦還具有富礦少、貧礦多等不足,全國(guó)磷礦平均品位在17%左右[4-6]。貴州磷礦多以無機(jī)磷鹽形式存在,全省磷礦平均品位為22.14%,磷礦質(zhì)量居全國(guó)之首,以此資源為依托已建立了全國(guó)最重要的磷礦石和磷化工基地[7-9]。然而,磷礦在實(shí)際生產(chǎn)中經(jīng)化學(xué)浮選工藝后將產(chǎn)生大量的磷尾礦渣,其組分特征為w(P2O5)≤10%[10],因含磷量低,屬工業(yè)固體廢棄物。目前采用丟棄或庫(kù)存的方式處理,給環(huán)境造成一定影響,因此磷尾礦的綜合再利用備受企業(yè)和學(xué)者的關(guān)注?,F(xiàn)階段,我國(guó)磷尾礦的綜合利用率僅有7%,利用途徑包括直接施用于土壤中、利用化學(xué)浮選法或磁選法提取有用礦物、利用酸解法制備化學(xué)復(fù)合肥及制備建筑材料[11-14]。其中,通過酸解法制備的磷肥復(fù)合肥[15],在使用中不僅降低了植物的吸收利用率[16],還會(huì)導(dǎo)致土壤出現(xiàn)板結(jié)等現(xiàn)象。因此,探索一種更環(huán)保、更高效的磷尾礦綜合利用途徑具有非常重要的意義。

    近年來,隨著應(yīng)用生物技術(shù)的發(fā)展,大量解磷微生物涌現(xiàn)出來。解磷微生物是一類能將難溶性磷酸鹽轉(zhuǎn)化為可溶性磷酸鹽的微生物。目前已知的具有解磷能力的微生物包括細(xì)菌、真菌和放線菌等,其中解磷細(xì)菌的數(shù)量和種類較多。國(guó)內(nèi)外報(bào)道的解無機(jī)磷細(xì)菌主要有產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、歐文氏菌屬(Erwinia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、多硫桿菌屬(Thiobacillus)等[17-20]。鐘傳青和 Gadd等[21-22]就解磷細(xì)菌的解磷機(jī)制進(jìn)行探索,研究發(fā)現(xiàn)解磷細(xì)菌能分泌磷酸酶和某些低分子量的有機(jī)酸,后者可向環(huán)境中提供質(zhì)子和有機(jī)酸陰離子,從而促使難溶性的磷酸鹽溶解[22]。故可利用解磷微生物制備解磷菌肥,此肥料不僅可提高土壤中磷的利用率,還可減少化學(xué)磷肥的使用量[23]?,F(xiàn)階段,解磷微生物在實(shí)際生產(chǎn)中已有應(yīng)用,但其多樣性不高,因此篩選出具有高效解磷性能的微生物,仍然是生產(chǎn)解磷菌肥的一項(xiàng)重要工作[24-26]。

    本研究從貴州甕福磷尾礦堆積場(chǎng)采集的土壤樣品中篩選出高效解磷微生物,并通過菌株形態(tài)特征、生理生化和16S rDNA基因序列分析以及系統(tǒng)發(fā)育樹對(duì)其菌株進(jìn)行鑒定,并探索其對(duì)難溶性磷酸鹽的解磷能力,為今后開發(fā)和利用解磷菌肥提供參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 儀器 101-1AB電熱恒溫干燥箱:天津泰斯特儀器有限公司;YXQ-LS-75G立式壓力蒸汽滅菌鍋:上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;BMJ-250C培養(yǎng)箱:上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備;JJ-CJ-IFD型超凈工作臺(tái):蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司;正置熒光顯微鏡:奧林巴斯Olympus;FA-2004N電子分析天平:上海菁海儀器有限公司;Heraeus Multifuge X3R大容量冷凍離心機(jī):美國(guó)Thermo Fisher公司;721可見分光光度計(jì):上海菁華科技儀器有限公司;PHS-3C型精密酸度計(jì):上海大普儀器有限公司;PCR 擴(kuò)增儀:德國(guó) Jena;核酸電泳儀:德國(guó) Jena。

    1.1.2 試劑 細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)BIOMIGA 公司。磷酸三鈣、葡萄糖、氯化鈉和瓊脂等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

    1.1.3 樣品來源 磷礦土壤樣品從貴州甕福磷尾礦堆積場(chǎng)采集。

    1.1.4 培養(yǎng)基 無機(jī)磷選擇性固體培養(yǎng)基:葡萄糖10.0 g,Ca3(PO4)25.0 g,(NH4)2SO40.5 g,NaCl 0.3g,KCl 0.3 g,MgSO4·7H2O 0.3 g,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g,MnSO4·4H2O 0.03 g,瓊脂18 g,蒸餾水1 000 mL,pH 7.0-7.5,121℃滅菌20 min。其中以Ca3(PO4)2作為磷源,需與其他藥品分開滅菌后混合。牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基:蛋白胨 10.0 g,牛肉膏 3.0 g,氯化鈉 5.0 g,瓊脂 15 g,蒸餾水 1 000 mL,pH 7.0-7.4,115℃滅菌30 min。上述兩種培養(yǎng)基的配方中去掉瓊脂即可制成液體培養(yǎng)基。

    1.2 方法

    1.2.1 解磷細(xì)菌的分離篩選及純化 稱取5 g土壤樣品,加入盛有45 mL 無菌生理鹽水的錐形瓶中,制成稀釋度為10-1的土壤懸液,置于30℃的搖床中振蕩30 min。將土壤懸液按10倍梯度制成10-2-10-6,并各取上述梯度的土壤懸液0.2 mL均勻涂布在無機(jī)磷選擇性固體培養(yǎng)基上,每個(gè)稀釋度重復(fù)3 次。將其倒置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-5 d后,用接種環(huán)挑取具有溶磷圈的單菌落在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上進(jìn)行分離及純化。將純化后的菌種分別點(diǎn)接于無機(jī)磷選擇性固體培養(yǎng)基上,在30℃條件下培養(yǎng)4-5 d后觀察溶磷圈產(chǎn)生情況,通過十字交叉法測(cè)量溶磷圈直徑(D)和菌落直徑(d)。根據(jù)是否產(chǎn)生溶磷圈及D/d值的大小來初步確定菌株的溶磷能力,篩選出具有明顯溶磷圈的菌株轉(zhuǎn)接到牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上,置于4℃下保存。

    1.2.2 形態(tài)學(xué)鑒定 將篩選得到的解磷細(xì)菌分別點(diǎn)種于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上,在30℃條件下培養(yǎng)2 d后觀察單菌落形態(tài)特征。

    1.2.3 生理生化測(cè)定 參考第八版《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[27]測(cè)定糖醇發(fā)酵、淀粉降解、明膠液化、甲基紅試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)等生理生化試驗(yàn),進(jìn)行觀察和記錄。

    1.2.4 分子生物學(xué)鑒定 將解磷細(xì)菌接入50 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基,置于30℃,180 r/min的搖床中振蕩2 d,然后使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(美國(guó)BIOMIGA公司)提取解磷細(xì)菌DNA。采用細(xì)菌16S rDNA通用上游引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和下游引物1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)對(duì)解磷細(xì)菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增。細(xì)菌PCR擴(kuò)增體系為25 μL:細(xì)菌DNA模板 2 μL,2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL,上下游引物各 1 μL,ddH2O 8.5 μL。細(xì)菌 PCR 反應(yīng)程序 :94℃預(yù)變性5 min后,94℃變性1 min,55℃退火1min,72℃延伸2 min,35個(gè)循環(huán),然后72℃延伸10 min,4℃保存。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠,1×TAE電泳緩沖液,上樣5 μL,以5 V/cm電壓電泳檢驗(yàn),在凝膠成像儀系統(tǒng)進(jìn)行觀察,拍照。再將PCR產(chǎn)物送至英淮捷基貿(mào)易有限公司測(cè)序,為保證序列的準(zhǔn)確度,測(cè)序采用雙向測(cè)序。所得測(cè)序結(jié)果輸入美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心NCBI(National Center of Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),選取同源性較高的菌株序列作為參照,用MEGA 5.05軟件構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹,進(jìn)行菌種鑒定。

    1.2.5 磷含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參照NY/T 2421-2013《植株全磷含量測(cè)定 鉬銻抗比色法》[28]中磷含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法,以測(cè)得的吸光度為縱坐標(biāo),磷濃度為橫坐標(biāo)繪制磷標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.2.6 解磷細(xì)菌溶磷能力及培養(yǎng)液pH值的測(cè)定[29]將篩選得到的菌株接種于50 mL的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,經(jīng)30℃,180 r/min過夜培養(yǎng)后得到種子液,菌量約為1×108CFU/mL。再按1%的接種量接種到無機(jī)磷選擇性液體培養(yǎng)基中后,置于上述同等條件下培養(yǎng)7 d。以不接菌作為對(duì)照,每株菌設(shè)置3組平行。搖床培養(yǎng)1-7 d過程中每天定時(shí)取樣,一部分樣品用pH計(jì)直接測(cè)定培養(yǎng)液的pH值。另一部分樣品在10 000 r/min條件下離心5 min,上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后用鉬銻抗比色法測(cè)定OD700值,根據(jù)磷含量標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出上清液中磷的含量。

    1.2.7 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22. 0和Excel 2003進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)和分析,用Origin 8.5軟件作圖,表中數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值。

    2 結(jié)果

    2.1 解磷細(xì)菌的分離篩選結(jié)果

    在無機(jī)磷選擇性固體培養(yǎng)基上分離出4株菌落形態(tài)不同的菌株,分別編號(hào)為PSB1、PSB2、PSB3和PSB4。通過觀察這4株菌的溶磷圈大?。▓D1)發(fā)現(xiàn),PSB1、PSB3和PSB4具有明顯溶磷圈(表1)。

    表1 溶磷圈法測(cè)量菌株的解磷能力

    2.2 解磷細(xì)菌的鑒定結(jié)果

    2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 3株解磷細(xì)菌在30℃恒溫下培養(yǎng)2 d后菌落直徑可達(dá)3-5 mm,單菌落形態(tài)及描述見表2和圖2。

    2.2.2 生理生化測(cè)定 對(duì)篩選所得菌株P(guān)SB1、PSB3和PSB4進(jìn)行部分生理生化指標(biāo)測(cè)定,結(jié)果見表3。3株菌在培養(yǎng)條件下均能利用檸檬酸鹽(鈉),并產(chǎn)生H2O2酶,不能產(chǎn)生H2S和賴氨酸脫羧酶。菌株P(guān)SB1僅能利用D-海藻糖、甘露醇和D-麥芽糖作為碳源進(jìn)行生長(zhǎng)代謝,而菌株P(guān)SB3能利用葡萄糖、蔗糖和甘露醇等多種糖醇,菌株P(guān)SB4不能利用任何一種碳源。

    2.2.3 分子生物學(xué)鑒定 篩選所得3株解磷細(xì)菌的PCR產(chǎn)物擴(kuò)增電泳圖如圖3所示,將PCR產(chǎn)物送至英淮捷基貿(mào)易有限公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果表明,PSB1、PSB3和PSB4目的片段大小分別為1 409 bp、1 400bp和 1 410 bp。

    圖1 解磷細(xì)菌的溶磷圈圖

    表2 三株解磷細(xì)菌菌落的形態(tài)描述

    圖2 解磷細(xì)菌單菌落圖

    將測(cè)序得到的3株解磷細(xì)菌16S rDNA基因序列輸入NCBI BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)中與較為相似且已發(fā)表的菌株16S rDNA基因序列進(jìn)行比對(duì),再通過MEGA 5.0軟件,將3株解磷細(xì)菌與其同屬親緣關(guān)系較近的模式菌株進(jìn)行同源性分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果如圖4所示。PSB1與普城沙雷氏菌(Serratia plymuthica)菌株聚在同一分支,其序列同源性為99%;PSB3與嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)菌株聚在同一分支,其序列同源性為99%;PSB4與泡囊短波單胞菌(Brevundimonas vesicularis)菌株聚在同一分支,其序列同源性為99%。

    表3 三株解磷細(xì)菌的生理生化特征

    圖3 三株解磷細(xì)菌的PCR產(chǎn)物擴(kuò)增圖

    結(jié)合菌落形態(tài)特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析結(jié)果,最后鑒定菌株P(guān)SB1、PSB3和PSB4分別為普城沙雷氏菌、嗜麥芽窄食單胞菌和泡囊短波單胞菌。

    圖4 三株解磷細(xì)菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

    2.3 磷含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

    由圖5可知,磷含量標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y =0.500 4x-0.007 3,相關(guān)系數(shù)R2為 0.999 3。結(jié)果表明,兩者線性相關(guān)良好。

    圖5 磷含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

    2.4 解磷細(xì)菌解磷能力及培養(yǎng)液pH值的測(cè)定

    本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)利用磷酸三鈣為唯一磷源,對(duì)其進(jìn)行液態(tài)培養(yǎng),采用鉬銻抗比色法測(cè)定了不同解磷細(xì)菌的解磷能力,結(jié)果見圖6和圖7。

    如圖6所示,3株解磷細(xì)菌在7 d液態(tài)培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液的pH值發(fā)生了明顯變化。在起初的24 h內(nèi),菌株P(guān)SB1、PSB3和PSB4培養(yǎng)液的pH值均顯著下降,由最初pH值7.00分別下降至4.47、4.51和4.99。這可能由于解磷細(xì)菌在生長(zhǎng)代謝過程中產(chǎn)生了各種有機(jī)酸,如蘋果酸、檸檬酸等,導(dǎo)致培養(yǎng)液的pH值降低。直至培養(yǎng)到96 h時(shí),菌株P(guān)SB3和PSB4培養(yǎng)液中的pH值降至最低,分別為4.30和4.35。菌株P(guān)SB1培養(yǎng)液在144 h時(shí)pH值降至最低,pH值為4.24。在三者pH值分別降至最低后,培養(yǎng)液pH值隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)變化趨勢(shì)并不明顯。

    圖6 解磷細(xì)菌液態(tài)培養(yǎng)中pH值的變化

    圖7 解磷細(xì)菌液態(tài)培養(yǎng)中溶磷量的變化

    如圖7所示,3株解磷細(xì)菌在7 d液態(tài)培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液內(nèi)可溶性磷含量總體呈先增加,后逐漸平緩減少的變化趨勢(shì)。3株解磷細(xì)菌培養(yǎng)液中可溶性磷含量在0-48 h內(nèi)變化顯著,分別迅速升高至 127.82 μg/mL、147.73 μg/mL 和 130.03 μg/mL。菌株P(guān)SB3培養(yǎng)液中可溶性磷含量在72 h時(shí)達(dá)到最高,為153.84 μg/mL,此后可溶性磷含量趨于穩(wěn)定,但從96 h之后,該值出現(xiàn)緩慢降低的趨勢(shì)。同樣,菌株P(guān)SB1和PSB4培養(yǎng)液中可溶性磷含量在96 h時(shí)達(dá)到最高,分別為 148.87 μg/mL 和 146.76 μg/mL,此后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),可溶性磷含量均有所下降,其中菌株P(guān)SB4培養(yǎng)液中可溶性磷含量下降較為明顯。由于解磷細(xì)菌在產(chǎn)生各種有機(jī)酸將磷酸三鈣溶解成可溶性磷的同時(shí),菌體為維持自身生長(zhǎng)代謝的需求將可溶性磷作為磷源將其利用,從而導(dǎo)致培養(yǎng)液中可溶性磷含量的降低。

    3 討論

    目前,許多研究者已分離出多種具有解磷能力的細(xì)菌。李白等[30]從土壤中分離得到3株解磷細(xì)菌,其中解磷能力最高可達(dá)到96.31 μg/mL。萬(wàn)兵兵等[31]從鄭州市砂質(zhì)潮土中分離出一株短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus),最高解磷能力可達(dá)到128.90 μg/mL。余旋[32]對(duì)從四川核桃主產(chǎn)區(qū)根際篩選出的解磷細(xì)菌進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng),最優(yōu)解磷能力在200 μg/mL左右。與國(guó)內(nèi)已報(bào)到的文獻(xiàn)相比,該實(shí)驗(yàn)篩選所得的3株細(xì)菌PSB1、PSB3和PSB4的解磷能力均在150 μg/mL左右,都是具有較高解磷能力的菌種。

    菌種PSB3被鑒定為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia),目前對(duì)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的研究多以其耐藥性和對(duì)動(dòng)植物感染與致病等方面為主[33-35],在解無機(jī)磷方面鮮見報(bào)道。但通過該實(shí)驗(yàn)可知,嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的解磷效果理想,故今后可對(duì)其在提高磷尾礦中磷的利用率以及研發(fā)解磷菌肥等方面進(jìn)行深入研究。

    為了研究實(shí)驗(yàn)篩選所得3株解磷細(xì)菌的解磷能力,對(duì)其進(jìn)行液態(tài)培養(yǎng)。通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,在液態(tài)培養(yǎng)初期,培養(yǎng)液中可溶性磷含量均隨著培養(yǎng)液pH值的降低而逐漸增加。但當(dāng)培養(yǎng)液的pH值降至最低時(shí),3株解磷細(xì)菌的解磷能力并非均達(dá)到最大值。通過SPSS 22.0軟件對(duì)3株解磷細(xì)菌培養(yǎng)液的pH值和其解磷能力做相關(guān)性分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株P(guān)SB1和PSB4培養(yǎng)液中pH值與其解磷能力存在顯著的負(fù)相關(guān)性(P<0.05),相關(guān)系數(shù)r分別為-0.897和-0.958。說明菌株P(guān)SB1和PSB4是通過分泌某些有機(jī)酸來溶解無機(jī)磷,導(dǎo)致培養(yǎng)液中pH值的降低,該結(jié)論與多數(shù)已報(bào)道的研究結(jié)論相一致[36-38]。而菌株P(guān)SB3培養(yǎng)液中pH值與其解磷能力不存在顯著相關(guān)性(P>0.05),相關(guān)系數(shù)r為-0.675,表明菌株P(guān)SB3在液態(tài)培養(yǎng)過程中可能產(chǎn)生了除有機(jī)酸以外的非有機(jī)酸物質(zhì),促使無機(jī)磷溶解。Illmer等[39]研究發(fā)現(xiàn)黃灰青霉(Penicillium aurantiogriseum)和假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)PI1889只有在NH4+介質(zhì)存在條件下才具有溶解無機(jī)磷酸鹽的能力,主要是因?yàn)楹粑饔没騈H4+同化作用釋放出質(zhì)子引起磷酸鹽的溶解,該項(xiàng)研究驗(yàn)證了非生成有機(jī)酸溶解難溶性磷酸鹽的機(jī)理。故菌株P(guān)SB3同樣可能也存在非分泌有機(jī)酸的其他解磷機(jī)理,具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

    4 結(jié)論

    本研究選取貴州甕福磷尾礦土壤為樣品,成功分離篩選出3株高效解磷細(xì)菌PSB1、PSB3和PSB4。通過對(duì)菌株的形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征及分子生物學(xué)等技術(shù)和理論,初步鑒定菌株P(guān)SB1、PSB3和PSB4分別為普城沙雷氏菌、嗜麥芽窄食單胞菌和泡囊短波單胞菌。將上述菌種置于以磷酸三鈣為唯一磷源的無機(jī)磷液體培養(yǎng)基中,在30℃恒溫條件下培養(yǎng)7 d,測(cè)得最大解磷能力分別為148.87、153.84和146.76 μg/mL。菌株P(guān)SB1和PSB4培養(yǎng)液中pH值與其解磷能力存在顯著的負(fù)相關(guān)性,而菌株P(guān)SB3不存在,其解磷機(jī)理還需進(jìn)一步研究。

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