2，4-表油菜素內(nèi)酯和赤霉素對(duì)微擬球藻產(chǎn)油率及脂肪酸組成的影響

凌婷 楊樹(shù)萍 魏煜凡 張琳

（寧波大學(xué)海洋學(xué)院，寧波 315211）

改變微藻的培養(yǎng)條件（如氮磷硅等營(yíng)養(yǎng)成分、pH、溫度、光強(qiáng)等）既可調(diào)控微藻的脂肪酸組成，又可調(diào)控微藻的總脂含量［1-4］。添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑也是其中一種有效手段。據(jù)報(bào)道，2，4-表油菜素內(nèi)酯（2，4-Epibrassinosteroid，EBR）、赤霉素（Gibberellin A3，GA3）、吲哚乙酸（Indole-3-acetic acid，IAA）、水楊酸（Salicylic acid，SA）等植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)促進(jìn)微藻生長(zhǎng)、優(yōu)化脂肪酸組成、增加抗逆性等有顯著功效［5］。該結(jié)論在小球藻（Chlorella sp.）、球等鞭金藻（Isochrysis galbana）等微藻中得以印證［6］。微擬球藻（Nannochloropsis sp.），屬于真眼點(diǎn)藻綱（Eustigmatophyceae），是一類具有巨大開(kāi)發(fā)潛力的經(jīng)濟(jì)微藻。其富含多糖、蛋白和多不飽和脂肪酸（PUFAs）等高附加值產(chǎn)物，被廣泛用作水產(chǎn)餌料及心臟病、糖尿病等疾病的預(yù)防［7］。此外，微擬球藻油脂含量高，被視為最有發(fā)展前景的生物柴油原材料之一［8］。

目前，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)微擬球藻產(chǎn)油率及脂肪酸組成影響的研究較少，本實(shí)驗(yàn)著重分析了EBR、GA3對(duì)微擬球藻大洋種（Nannochloropsis oceanica）生長(zhǎng)、產(chǎn)油率和脂肪酸組成的影響，擬找出最適濃度，為微擬球藻的研究和應(yīng)用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

微擬球藻藻種編號(hào)為N. oceanica LAMB0001，由中國(guó)海洋大學(xué)應(yīng)用微藻生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。培養(yǎng)基選用f/2海水培養(yǎng)基［9］。培養(yǎng)溫度（24±1）℃，光 周 期（L∶D）12 h∶12 h， 光 照 強(qiáng) 度 60 μmol photons/（m2·s）。每天固定時(shí)間搖瓶4次，防止細(xì)胞貼壁。EBR和GA3購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，使用微孔膜過(guò)濾除菌配制成母液，低溫保存。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)流程 將微擬球藻培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)中期，分別取60 mL接種于新鮮f/2培養(yǎng)基中至總體積300mL，并分別添加EBR和GA3至相應(yīng)的終濃度。EBR和GA3分別設(shè)置4個(gè)濃度梯度0、5、15和50 mg/L，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行。培養(yǎng)10 d，收集細(xì)胞，測(cè)定干重、脂肪酸組成及總脂含量。期間，每天監(jiān)測(cè)藻液光密度變化。

1.2.2 光密度及干重測(cè)定 光密度測(cè)定方法：本實(shí)驗(yàn)使用750 nm波長(zhǎng)下藻液的吸光度來(lái)表示藻液光密度。光密度值代表細(xì)胞密度。干重測(cè)定方法：離心收集一定體積的藻液，冷凍干燥后稱取藻粉重量。

1.2.3 總脂含量測(cè)定分析 取30 mg冷凍干燥的藻粉至密封性良好的螺口玻璃管中，加入氯仿-甲醇（體積比2∶1）劇烈震蕩15 min，離心（4 000 r/min，10 min）后吸取上清液至新的螺口玻璃管中。重復(fù)抽提3次。向裝有上清液的玻璃管中加入適量NaCl溶液（0.9%），充分震蕩混勻，靜置30 min。吸取下層有機(jī)相至新玻璃管中，50℃水浴待氯仿全部揮發(fā)，稱重并計(jì)算總脂含量。

1.2.4 脂肪酸組成測(cè)定分析 取20 mg冷凍干燥的藻粉置于密封性良好的螺口玻璃管中，加入2 mL KOH-CH3OH溶液（2 mol/L）于75℃水浴鍋中皂化和甲酯化30 min；冷卻至室溫后加入2 mL HCl-CH3OH溶液（3 mol/L），75℃水浴酸化30 min；冷卻后再加入1 mL色譜級(jí)正己烷和適量蒸餾水，充分震蕩促進(jìn)分層；吸取正己烷相待測(cè)。

脂肪酸組成分析：采用Agilent 6890 Series GC System 氣相色譜儀（US10251016，USA），色譜柱為 HP-5毛 細(xì) 管 柱（30 m×320 μm×0.25 μm，5%Phenyl Siloxane），檢測(cè)器為氫火焰離子化檢測(cè)器（FID）。使用安捷倫化學(xué)工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（Agilent Chemsation）分析結(jié)果，以面積歸一化法計(jì)算脂肪酸組分的相對(duì)百分含量。

2 結(jié)果

2.1 EBR和GA3對(duì)生長(zhǎng)的影響

添加不同濃度EBR的微擬球藻生長(zhǎng)狀況如圖1所示。曲線使用Origin 7.0軟件非線性擬合得到，光密度值代表細(xì)胞密度，曲線斜率變化代表生長(zhǎng)速率。當(dāng)EBR濃度小于15 mg/L時(shí)，隨著EBR濃度升高，微擬球藻對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期不斷延長(zhǎng)。培養(yǎng)至第10天，15 mg/L EBR處理組光密度較5 mg/L處理組和對(duì)照組分別提高了6.44%和17.45%。由此可見(jiàn)，15 mg/L EBR對(duì)其生長(zhǎng)促進(jìn)最明顯。而50 mg/L EBR對(duì)微擬球藻生長(zhǎng)產(chǎn)生了抑制作用，培養(yǎng)僅至第4天，光密度就下降至初始值的47%，顯微觀察發(fā)現(xiàn)藻細(xì)胞已裂解。

與EBR不同，較對(duì)照組，本實(shí)驗(yàn)中所設(shè)3種濃度的GA3均能促進(jìn)微擬球藻生長(zhǎng)，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期延長(zhǎng)（圖2）。培養(yǎng)10 d后，添加了5、15和50 mg/L GA3的處理組光密度分別比對(duì)照組高出 14.54%，17.51%和29.28%；50 mg/L GA3處理下光密度達(dá)到最大。說(shuō)明GA3對(duì)微擬球藻的細(xì)胞增殖十分有效。

圖1 不同濃度EBR對(duì)微擬球藻藻液光密度的影響

2.2 EBR和GA3對(duì)生物量、總脂含量及產(chǎn)油率的影響

本實(shí)驗(yàn)所設(shè)50 mg/L EBR顯著抑制微擬球藻生長(zhǎng)，藻液濃度過(guò)低，以致無(wú)法收集測(cè)定后續(xù)指標(biāo)。如表1所示，添加較低濃度（5、15 mg/L）的EBR后，該藻生物量較對(duì)照組顯著增加，分別增加了9.19%、13.97%，而總脂含量并未發(fā)生顯著變化。綜合生物量和總脂含量來(lái)看，添加5和15 mg/L EBR后該藻產(chǎn)油率較對(duì)照組分別增加了7.85%和13.97%。生物量增幅與產(chǎn)油率增幅相近，由此推測(cè)EBR對(duì)微擬球藻產(chǎn)油率的提高主要?dú)w功于其對(duì)該藻生物量積累的促進(jìn)，并不影響單位質(zhì)量藻細(xì)胞的總脂含量。

圖2 不同濃度GA3對(duì)微擬球藻液光密度的影響

表1 EBR和GA3對(duì)微擬球藻生物量及總脂含量的影響

由表1可知，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，GA3處理組微擬球藻生物量較對(duì)照組顯著提高，且隨GA3濃度增加而增加；當(dāng)GA3為50 mg/L時(shí)，生物量最高達(dá)0.337 g/L。而總脂含量與之不同，5、15、50 mg/L處理組較對(duì)照組均沒(méi)有顯著變化。綜合生物量和總脂含量分析，產(chǎn)油率在GA3為15 mg/L時(shí)達(dá)到最大值（8.184 mg/（L·d）），顯著高于對(duì)照組及5和50mg/L處理組。以上結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)所設(shè)濃度GA3均顯著促進(jìn)了微擬球藻生物量的積累，而對(duì)總脂含量影響不大。產(chǎn)油率的差異主要是來(lái)自GA3對(duì)微擬球藻生長(zhǎng)的影響。總體來(lái)看，15 mg/L GA3對(duì)產(chǎn)油率提高效果最顯著。

2.3 EBR和GA3對(duì)脂肪酸組成的影響

不同濃度EBR和GA3對(duì)微擬球藻脂肪酸組成的影響如表2和表3所示。與對(duì)照相比，不同濃度的EBR和GA3對(duì)14∶0（十四烷酸，其中14代表脂肪酸碳鏈長(zhǎng)度，0代表雙鍵的數(shù)量；以此類推）所占比例基本無(wú)影響，16∶0、16∶1、18∶1所占比例隨著EBR和GA3濃度升高而顯著降低，而18∶2、20∶4、20∶5（EPA）所占比例顯著提高。特別是EPA含量顯著提高，培養(yǎng)僅10 d，15和50 mg/L GA3處理組中其含量即分別達(dá)到了34.96%和36.34%。

表2 EBR濃度對(duì)微擬球藻脂肪酸組成的影響

表3 GA3濃度對(duì)微擬球藻脂肪酸組成的影響

3 討論

3.1 EBR和GA3對(duì)微擬球藻生長(zhǎng)的影響

EBR是一種廣譜、無(wú)毒的高活性植物激素，其最突出的作用是促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)與分裂、促進(jìn)植物光合作用及增加植物抗逆性［10-12］。范新照等［13］認(rèn)為2 μmol/L EBR即可顯著促進(jìn)微茫藻（Micractinium sp.）生長(zhǎng)；而10 μmol/L EBR則顯著抑制其生長(zhǎng)，最大生物量較對(duì)照組減少了72.83%。王小飛等［14］研究表明，在0-0.2 mg/L范圍內(nèi)，隨EBR濃度升高，三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）生物量呈先增后減之趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在5、15 mg/L時(shí)，EBR顯著促進(jìn)微擬球藻生長(zhǎng)；而50 mg/L EBR則會(huì)抑制該藻生長(zhǎng)。這與前人研究結(jié)果相似，但因不同藻種對(duì)EBR敏感性有差異，其最適作用濃度也不同。

GA3是重要的植物激素之一，其主要作用是促進(jìn)細(xì)胞分裂。Falkowska等［15］研究了GA3對(duì)鎘鉛脅迫條件下普通小球藻（Chlorella vulgaris）的影響，結(jié)果表明，GA3可促進(jìn)細(xì)胞增殖和光合色素及單糖的積累。Park等［16］發(fā)現(xiàn)，1 mg/L GA3對(duì)萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）生長(zhǎng)促進(jìn)效果最顯著。范新照等［13］使用GA3處理微茫藻后發(fā)現(xiàn)，1 μmol/L GA3對(duì)藻株生長(zhǎng)有明顯促進(jìn)作用；增加GA3濃度至5 μmol/L 則會(huì)顯著抑制該藻生長(zhǎng)，其最大生物量比對(duì)照組減少了60.70%。據(jù)報(bào)道，在一定濃度范圍（0.01-10 mg/L）內(nèi)，隨GA3濃度升高，其對(duì)銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）生長(zhǎng)促進(jìn)越明顯；濃度過(guò)高則會(huì)抑制其生長(zhǎng)［17］。在本實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，GA3對(duì)微擬球藻生長(zhǎng)促進(jìn)效果也隨GA3濃度增大而增強(qiáng)，這與低濃度EBR在其他藻中的作用效果相似。但本實(shí)驗(yàn)中濃度尚未達(dá)到抑制微擬球藻生長(zhǎng)的臨界值，更高濃度GA3的作用效果有待后期探索。

3.2 EBR和GA3對(duì)微擬球藻總脂含量及產(chǎn)油率的影響

除調(diào)節(jié)微藻生長(zhǎng)外，適宜濃度EBR和GA3對(duì)其總脂含量也有顯著影響。郝宗娣等［6］研究表明，EBR能顯著提高原始小球藻（Chlorella protothecoides）的總脂含量。王小飛等［14］認(rèn)為0.1 mg/L EBR能顯著提高三角褐指藻的產(chǎn)量和總脂含量。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，EBR處理下的微擬球藻產(chǎn)油率和生物量是同步增加的，而單位質(zhì)量藻細(xì)胞的總脂百分含量并未發(fā)生明顯改變，推測(cè)EBR提高微擬球藻產(chǎn)油率是通過(guò)促進(jìn)其細(xì)胞增殖實(shí)現(xiàn)的。

目前，GA3對(duì)微藻總脂含量影響的研究較少。據(jù)報(bào)道，1.0 μmol/L GA3處理下，微茫藻油脂含量較對(duì)照組有所降低；GA3濃度為5.0 μmol/L 時(shí)，其生物量降低但油脂含量卻顯著提高［13］。在本研究中，50 mg/L GA3雖促進(jìn)了微擬球藻生物量積累，但顯著抑制了單位質(zhì)量藻細(xì)胞的總脂含量，而15 mg/L GA3處理下總脂含量和產(chǎn)油率達(dá)到最高，效果較好，且優(yōu)于EBR處理組的效果。綜上，適宜濃度GA3對(duì)于促進(jìn)該藻生長(zhǎng)、總脂積累作用顯著。

3.3 EBR和GA3對(duì)微擬球藻脂肪酸組成的影響

多不飽和脂肪酸是形成生物膜的必備條件之一，在維持生物膜流動(dòng)性中起關(guān)鍵作用［18］。此外，參與多個(gè)重要生理過(guò)程，如物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)［19］和葉綠體形成［20］等。本實(shí)驗(yàn)中，添加EBR（5和15 mg/L）和GA3（5、15和50 mg/L）后，微擬球藻中飽和及單不飽和脂肪酸（16∶0、16∶1、18∶1）占比隨濃度升高而逐漸下降，多不飽和脂肪酸（18∶2、20∶4、20∶5）占比則顯著提高。培養(yǎng)10 d后，15和50 mg/L GA3處理組中EPA含量即分別達(dá)到了34.96%和36.34%。結(jié)果表明，一定濃度EBR和GA3可促進(jìn)微擬球藻生長(zhǎng)和油脂積累并優(yōu)化其脂肪酸組成。EPA屬于ω3系長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸，具有維持生物膜的結(jié)構(gòu)和功能、預(yù)防心腦血管疾病、提高機(jī)體免疫力和改善視力等功效［21］。作為EPA主要來(lái)源，現(xiàn)有魚(yú)油難以滿足人們的持續(xù)需求［22］，微擬球藻作為一類重要的經(jīng)濟(jì)微藻，在EPA生產(chǎn)上潛力巨大。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，5、15 mg/L EBR能顯著促進(jìn)微擬球藻生長(zhǎng)和提高其產(chǎn)油率，但對(duì)單位質(zhì)量藻細(xì)胞總脂含量影響不大。50 mg/L EBR則顯著抑制該藻生長(zhǎng)。5、15和50 mg/L GA3均顯著促進(jìn)微擬球藻生物量積累。15 mg/L GA3對(duì)微擬球藻產(chǎn)油率提升效果最顯著。50 mg/L GA3處理組生物量最高，但總脂積累受到一定抑制。添加EBR和GA3濃度后，飽和和單不飽和脂肪酸占比下降，多不飽和脂肪酸占比顯著提高。

［1］陳程浩, 吳嘉儀, 湯明星, 等. 八株海洋微藻Nannochloris sp. 生長(zhǎng)及生化性狀評(píng)價(jià)［J］. 生物技術(shù)通報(bào), 2016（6）：231-237.

［2］郭兵, 龔陽(yáng), 萬(wàn)霞, 等. 光強(qiáng)和溫度對(duì)球等鞭金藻（Isochrysis sphaerica）生長(zhǎng)及其脂肪酸的影響［J］. 中國(guó)油料作物學(xué)報(bào),2011, 33（3）：295-301.

［3］陳傳紅, 吳洪, 李青, 等. 三株?yáng)旁鍖僭逯旯夂献责B(yǎng)產(chǎn)油脂的比較研究［J］. 生物技術(shù)通報(bào), 2016, 32（6）：238-243.

［4］劉菲菲, 馮慕華, 尚麗霞, 等. 溫度對(duì)銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）和魚(yú)腥藻（Anabaena sp.）生長(zhǎng)及胞外有機(jī)物產(chǎn)生的影響［J］. 湖泊科學(xué), 2014, 26（5）：780-788.

［5］Salama ES, Kabraa N, Ji MK, et al. Enhancement of microalgae growth and fatty acid content under the influence of phytohormones［J］. Bioresource Technology, 2014, 172：97-103.

［6］郝宗娣, 劉平懷, 時(shí)杰, 等. 不同植物激素對(duì)原始小球藻生長(zhǎng)及油脂含量的影響［J］. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 39（8）：104-107.

［7］Ferreira M, Coutinho P, Seixas P, et al. Enriching rotifers with“premium” microalgae. Nannochloropsis gaditana［J］. Marine Biotechnology, 2009, 11（5）：585-595.

［8］何文棟, 朱葆華, 等. 微擬球藻富油藻株篩選及柱狀光生物反應(yīng)器培養(yǎng)評(píng)價(jià)研究［J］. 水生生物學(xué)報(bào), 2017, 4（5）：1112-1117.

［9］Guillard RRL, Ryther JH. Studies of marine planktonic diatoms.I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea（cleve）Gran［J］. Canadian Journal of Microbiology, 1962, 8：229-239.

［10］張琳. 油菜素內(nèi)酯的生理效應(yīng)及發(fā)展前景［J］. 北方園藝,2011, 20：188-191.

［11］鄭潔, 王磊. 油菜素內(nèi)酯在植物生長(zhǎng)發(fā)育中的作用機(jī)制研究進(jìn)展［J］. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào), 2014, 16（1）：52-58.

［12］李輝, 左欽月, 涂升斌. 油菜素內(nèi)酯生物合成和代謝研究進(jìn)展［J］. 植物生理學(xué)報(bào), 2015, 51（11）：1787-1798.

［13］范新照, 費(fèi)小雯, 吳小霞, 等. 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑EBR和GA3對(duì)微茫藻18A8（Micractinium sp.）生長(zhǎng)和油脂積累的影響［J］.熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 33（2）：4-8.

［14］王小飛, 張問(wèn), 等. 2, 4-表油菜素內(nèi)酯對(duì)三角褐指藻生長(zhǎng)及有機(jī)質(zhì)積累的影響［J］. 植物生理學(xué)報(bào), 2015, 9：1482-1488.

［15］Falkowska M, Pietryczuk A, Piotrowska A, et al. The effect of gibberellic acid（GA3）on growth, metal biosorption and metabolism of the green algae Chlorella vulgaris（Chlorophyceae）beijerinck exposed to cadmium and lead stress［J］. Polish Journal of Environmental Studies, 2011, 20（1）：53-59.

［16］Park WK, Yoo G, Moon M, et al. Phytohormone supplementation significantly increases growth of Chlamydomonas reinhardtii cultivated for biodiesel production［J］. Applied Biochemistry &Biotechnology, 2013, 171（5）：1128-1142.

［17］王勤. 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）生長(zhǎng)特性影響的研究［D］. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2009.

［18］Chang YT, Chang MC, et al. Distinctive roles of unsaturated and saturated fatty acids in hyperlipidemic pancreatitis［J］. World J Gastroenterol, 2015, 21（32）：9534-9543.

［19］Xiao YF, Ke Q, Wang SY, et al. Single point mutations affect fatty acid block of human myocardial sodium channel alpha subunit Na+channels［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98：3606-3611.

［20］Wallis JG, Browse J. Mutants of Arabidopsis reveal many roles for membrane lipids［J］. Prog Lipid Res, 2002, 41：254-278.

［21］李文宗, 王磊. 長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸EPA、DHA 的基因工程研究進(jìn)展［J］. 生物技術(shù)通報(bào), 2016, 32（8）：1-7.

［22］胡亞平, 吳剛, 張麗, 等. 長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的替代來(lái)源——轉(zhuǎn)基因油料作物［J］. 生物技術(shù)通報(bào), 2016, 6：1-6.