參茸益精片對高脂血癥大鼠的影響及分子機制研究

王自勤，王海偉，蘇 丹，霍 堅，呂宏迪*

0 引言

近年來，高脂血癥(Hyperlipidemia)臨床發(fā)病率持續(xù)增高，對人類身體健康危害嚴重。高脂血癥主要引起血膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白升高或高密度脂蛋白降低，其發(fā)生的分子機制復(fù)雜，影響因素眾多，遺傳基因和外界環(huán)境均會產(chǎn)生顯著的影響，是一種體內(nèi)脂類物質(zhì)代謝紊亂所引起的全身慢性疾病[1-2]。高血壓、糖尿病、胰島素抵抗等代謝異常性疾病與高脂血癥的發(fā)病密切相關(guān)[3-4]。闡明高脂血癥發(fā)生、發(fā)展的分子機制，探尋有效的臨床治療靶點和預(yù)防治療方案，是目前本領(lǐng)域國內(nèi)外研究的熱點。

參茸益精片主要由西洋參、黃芪等14味中藥組成，具有復(fù)脈固脫、補脾益肝、生津養(yǎng)血、安神益智壯腎陽、益精血、強筋骨等功能，可用于丙肝、乙肝常規(guī)治療后以及腫瘤患者放化療后白細胞減少、血紅蛋白低、高原反應(yīng)及消化不良等癥[5-7]。但參茸益精片是否可以影響高脂血癥的臨床癥狀，其具體分子機制如何，目前尚未見相關(guān)報道。本實驗以大鼠高脂血癥動物模型為研究對象，通過Western blot和RT-PCR等實驗，觀察低密度脂蛋白受體(LDLR)、血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)、VEGF蛋白和mRNA表達的變化，分析并闡明參茸益精片影響高脂血癥的分子機制，為其臨床應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 建立高脂血癥大鼠動物模型 SD大鼠(180～200 g)由一五九醫(yī)院實驗動物中心提供，隨機分為空白對照組(對照組)、高脂血癥模型組(模型組)、洛伐他汀治療組(洛伐他汀組，0.1 mg/kg)，參茸益精片治療組(低劑量組：0.1 mg/kg；中劑量組：0.5 mg/kg；高劑量組：1 mg/kg)，每組6只。模型組動物連續(xù)飼喂高脂飼料(20%蛋白粉，30%黃油，50%基礎(chǔ)飼料)，自由飲水，4周后檢測大鼠血脂水平[8]。治療組在飼喂高脂飼料的同時，口服灌胃不同劑量的參茸益精片，洛伐他汀作為陽性對照組，4周后檢測大鼠血脂水平和相關(guān)指標。

1.2 血脂水平分析 大鼠尾靜脈采血，按照試劑盒說明，分析血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平。

1.3 肝臟SOD和MDA活性分析 取大鼠肝臟，組織勻漿，2 000 r/min離心10 min，取上清，按照試劑盒說明，分析肝臟SOD和MDA的活性。

1.4 Western blot分析 分別取大鼠肝臟和主動脈組織，PBS沖洗，加入裂解液，機械勻漿處理，12 000 r/min離心30 min。BCA蛋白定量法測定蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，5%奶粉孵育1 h，封閉非特異性背景染色，再分別加入LDLR、VCAM-1和VEGF一抗(1∶1 000)孵育，4 ℃過夜后，與二抗室溫孵育2 h。ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光顯影，收集圖像。

1.5 RT-PCR分析 分別取大鼠肝臟和主動脈組織，TRIZOL法提取總RNA，通過RT-PCR分析LDLR、VCAM-1和VEGF mRNA水平的變化。LDLR上游引物5′-GTGGTCTCGGCCCATCCA TCCCTGC-3′,下游引物5′-TGCGGCCACTCATCCGAGCCATCTT-3′；VCAM-1上游引物5′-ATCCCTACCATTGA AGATACTGG-3′，下游引物5′-TGATGACAGTTCTCCTTCTTTG-3′；VEGF上游引物5′-ATGGCAGAAGGAGGAGGG-3′,下游引物5′-CGAAACGCTGAGGGAGGCT-3′。β-actin上游引物:5′-GAAGTGTGACGTTGACAT CCG-3′,下游引物:5′-GCCTAGAAGCATTTGC GGTG-3′,瓊脂糖凝膠(1%)電泳分離RT-PCR產(chǎn)物，凝膠成像儀觀察圖像，分析組間差異。

2 結(jié)果

2.1 參茸益精片對高脂血癥大鼠血脂水平的影響 大鼠連續(xù)飼喂高脂飼料4周后，與對照組比較，模型組大鼠血漿中TC、TG、LDL-C水平顯著升高，HDL-C水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示大鼠高脂血癥動物模型符合實驗要求。與模型組比較，參茸益精片治療組TC、TG、LDL-C水平顯著降低，HDL-C水平顯著升高(P<0.05)，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，其效果與臨床高脂血癥的治療藥物洛伐他汀類似。見表1。

2.2 參茸益精片對高脂血癥大鼠肝臟SOD和MDA活性的影響 大鼠連續(xù)飼喂高脂飼料4周后，與對照組比較，模型組大鼠肝臟中SOD活性顯著降低，MDA活性顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，參茸益精片治療組SOD活性顯著增加，MDA活性顯著降低(P<0.05)，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，其效果與臨床高脂血癥的治療藥物洛伐他汀類似。見表2。

2.3 參茸益精片對高脂血癥大鼠相關(guān)分子蛋白表達的影響 本研究結(jié)果顯示，大鼠連續(xù)飼喂高脂飼料4周后，與對照組比較，模型組大鼠肝臟中LDLR表達明顯降低(P<0.05)。與模型組比較，

表1 參茸益精片對高脂血癥大鼠血脂水平的影響(nmol/L)

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

參茸益精片治療組和洛伐他汀組大鼠肝臟中LDLR表達顯著增加(P<0.05)。與對照組比較，模型組大鼠主動脈VCAM-1和VEGF表達均明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，參茸益精片治療組VCAM-1和VEGF表達顯著降低(P<0.05)。見圖1。

表2 參茸益精片對高脂血癥大鼠肝臟SOD和MDA活性的影響

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

圖1 參茸益精片對高脂血癥大鼠相關(guān)分子蛋白表達的影響

注：1.對照組，2.模型組，3.低劑量組，4.中劑量組，5.高劑量組，6.洛伐他汀組

2.4 參茸益精片對高脂血癥大鼠相關(guān)分子mRNA表達的影響 RT-PCR結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組大鼠主動脈VCAM-1和VEGF mRNA表達均明顯增加(P<0.05),而肝臟中LDLR mRNA表達明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，參茸益精片治療組大鼠主動脈VCAM-1和VEGF mRNA表達顯著降低(P<0.05)，而肝臟中LDLR mRNA表達明顯增加(P<0.05)，洛伐他汀組LDLR、VCAM-1和VEGF mRNA表達趨勢與參茸益精片治療組一致。見圖2。

3 討論

參茸益精片的主要有效成分是人參皂苷(Ginsenoside)Rg1、Re和黃芪甲苷(Astragaloside A)，具有復(fù)脈固脫、補脾益肝、生津養(yǎng)血的功效，可以達到疏通脈管、改善臟器供血及調(diào)節(jié)人體代謝功能的目的[9-10]。本研究通過建立大鼠高脂血癥動物模型，觀察參茸益精片是否具有調(diào)節(jié)血脂水平的效果，同時通過分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)，分析血脂相關(guān)分子的變化，以闡明參茸益精片的作用機制，為其進一步的臨床應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

圖2 參茸益精片對高脂血癥大鼠相關(guān)分子mRNA表達的影響

注：1.對照組，2.模型組，3.低劑量組，4.中劑量組，5.高劑量組，6.洛伐他汀組

本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠連續(xù)飼喂高脂飼料4周后，血漿中TC、TG和LDL-C水平均顯著升高，HDL-C水平顯著降低。同時給予參茸益精片治療的動物，其血脂水平相關(guān)的參數(shù)均與模型組有顯著的差異，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。參茸益精片的上述降脂效應(yīng)，與臨床常用的高脂血癥治療藥物洛伐他汀類似，提示參茸益精片具有潛在的臨床應(yīng)用前景。

高脂血癥分子機制的研究及臨床治療藥物和預(yù)防手段的探索是目前國內(nèi)外研究的熱點問題。研究結(jié)果表明，機體高脂血癥狀態(tài)下，肝臟易出現(xiàn)脂肪堆積，抗氧化能力降低，氧自由基水平顯著升高[11-12]。本研究結(jié)果表明，高脂飼料處理組的動物，肝臟MDA含量顯著升高，SOD活性顯著降低，提示高脂動物肝臟清除氧自由基和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的能力顯著下降。而參茸益精片治療的動物，肝臟SOD活性顯著增加，MDA含量顯著降低，提示參茸益精片可以改善肝臟脂質(zhì)過氧化的程度，減輕因高脂引起的過氧化物生成對肝臟的損傷，從而起到保護肝臟的作用，增強對血漿中TC、TG和LDL-C的處理能力。

基因的變化是引起高脂血癥的主要因素，同時也是臨床治療的藥物靶點和方向。大鼠肝臟中的LDLR、主動脈組織中的VCAM-1和VEGF均與高脂血癥密切相關(guān)，LDLR可與LDL結(jié)合，顯著降低LDL水平，VCAM-1和VEGF均與血管內(nèi)皮細胞黏附和遷移的進程相關(guān)，能夠誘導(dǎo)相關(guān)細胞因子的表達，參與血管形成[13-18]。肝臟中LDLR的表達與LDL-C和膽固醇的代謝途徑密切相關(guān)，從而影響肝臟對血漿中TC、TG和LDL-C等的處理能力。增加LDLR水平，可顯著提高肝臟對膽固醇的降解能力，降低血脂水平。本研究結(jié)果表明，模型組LDLR表達顯著降低，而參茸益精片治療后，大鼠肝臟中LDLR表達顯著增加，提示參茸益精片能夠增加肝臟對膽固醇的降解，從而降低血脂水平。研究表明，高脂血癥可引起主動脈中VCAM-1和VEGF的高表達，促進內(nèi)皮細胞黏附和遷移，誘導(dǎo)細胞因子表達，引起或加重動脈粥樣硬化斑塊的形成，造成機體的損害[17-18]。本研究結(jié)果表明，經(jīng)過參茸益精片治療的動物，其主動脈中VCAM-1和VEGF的表達水平顯著降低，提示參茸益精片對主動脈血管有一定的保護作用。綜上所述，我們建立的高脂血癥的動物模型符合要求，可用于后續(xù)的研究。結(jié)果表明，給予參茸益精片治療的動物，其LDLR表達顯著增高，VCAM-1和VEGF表達顯著降低。RT-PCR實驗結(jié)果表明，上述分子的mRNA表達水平也體現(xiàn)一樣的趨勢。參茸益精片可以顯著改善機體的血脂水平，可能與調(diào)控肝臟和主動脈中相關(guān)分子的表達水平密切相關(guān)，對于高脂血癥，參茸益精片具有一定的治療效應(yīng)。

參茸益精片能夠顯著抑制大鼠高脂血癥的發(fā)生，可能作為臨床治療并預(yù)防高脂血癥的藥物。本研究為參茸益精片的進一步臨床應(yīng)用提供了實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

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