利用宏基因測序分析鉛污染下三葉草根際土壤真菌的生物多樣性

王繼玥，石登紅，2，劉 燕*

(1.貴陽學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院，貴州 貴陽 550005；2.貴州省山地珍稀動(dòng)物與經(jīng)濟(jì)昆蟲重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550005)

隨著我國經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展以及人民生活水平的快速提升，土壤重金屬污染、土壤退化等問題亦趨嚴(yán)重[1-2]。相關(guān)研究表明，目前我國有10%以上的耕地遭受重金屬污染，其中約1%為重度污染。重金屬侵入耕地會(huì)破壞農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境，并危害糧食安全。據(jù)估算，全國每年因重金屬污染的糧食約2 000萬t，造成的直接經(jīng)濟(jì)損失約500億元[3]。而貴州由于不合理的礦藏開采方式，造成了嚴(yán)重的土壤污染，全省綜合污染指數(shù)為2 181，污染等級(jí)為中污染。貴州省主要污染物為鎘(Cd)、汞(Hg)、鉛(Pb)和砷(As)，其中鎘(Cd)、汞(Hg)、砷(As)污染均為中度或重度污染，只有黔南州及安順市有鉛(Pb)的輕污染，是相對(duì)容易處理的污染物。

土壤中存在豐富微生物群落，不同微生物群落與土壤介質(zhì)、水分、酶等構(gòu)成了復(fù)雜微生態(tài)環(huán)境。土壤微生物群落不僅是組成土壤的重要部分，也是土壤養(yǎng)分循環(huán)的推動(dòng)者，其豐度以及結(jié)構(gòu)的變化可以表征土壤質(zhì)量的變化情況[4-5]。研究[6]表明，土壤中微生物比土壤動(dòng)、植物對(duì)重金屬污染更敏感，土壤微生物的活性可以反映土壤的微生態(tài)環(huán)境，從而為全面科學(xué)地評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量提供依據(jù)。朱紅梅等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，高濃度鉛污染使土壤呼吸強(qiáng)度增加，微生物生物量碳減少，而低濃度鉛污染使呼吸強(qiáng)度減小，微生物生物量碳增大。吳燕玉等[8]研究發(fā)現(xiàn)，輕度土壤重金屬污就會(huì)抑制土壤微生物活性，而重度土壤重金屬污染會(huì)導(dǎo)致作物減產(chǎn)。雖然在土壤微生物中真菌所在比較低[9]，但其對(duì)土壤微生態(tài)環(huán)境的重要性并不亞于細(xì)菌。真菌通過參與分解有機(jī)質(zhì)[10]，為植物根系提供營養(yǎng)，維持土壤酶活性。因此，土壤真菌的多樣性對(duì)維持土壤生態(tài)系統(tǒng)的平衡至關(guān)重要[11-12]。

土壤宏基因組測序技術(shù)可以高效、準(zhǔn)確、快速檢測微生物群落的多樣性，為研究不同微生物豐度、組成、群落結(jié)構(gòu)、遺傳進(jìn)化等提供大量的信息。常安然等[13]利用宏基因組測序技術(shù)，揭示了煙草根際土壤真菌的群落組成和多樣性。徐紅梅等[14]也利用該技術(shù)，揭示了杭白芍根際真菌群落年際變化規(guī)律。這些研究為認(rèn)識(shí)真菌與植物共生體系的關(guān)系提供大量重要的信息。貴州省目前鉛污染程度尚不十分嚴(yán)重，可以通過生物吸附、降解等方式降低或者消除土壤鉛污染。本文通過高通量測序技術(shù)，研究鉛污染對(duì)三葉草根際土壤真菌多樣性的影響，為利用植物-微生物修復(fù)貴州地區(qū)土壤鉛污染提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在貴陽學(xué)院試驗(yàn)田采集無鉛污染的菜園土，土壤類型為耕型黃壤，土壤基本理化性質(zhì)：全氮為0.84 g/kg，全磷為0.68 g/kg，全鉀為1.05 g/kg，堿解N為121.3 mg/kg，速效磷為257.12 mg/kg，速效鉀為268.87 mg/kg，有機(jī)質(zhì)-為23.94 g/kg，pH為6.16，-Pd-為10.32 mg/kg。設(shè)3個(gè)鉛濃度處理，分別標(biāo)記為Pb1(300 mg/kg)、Pb2(600 mg/kg)、Pb3(900 mg/kg)，以無鉛處理為對(duì)照(Pb0)。土壤加Pb混勻平衡5 d后分別裝入內(nèi)徑為20 cm、高度為25 cm的塑料花盆中，每盆裝土6.6 kg(風(fēng)干質(zhì)量)，種植3株白三葉草(TrifoliumrepensLinn)幼苗。每處理5次重復(fù)，完全隨機(jī)排列。待生長30 d后，采用抖落法收集根際土壤，過2 mm篩進(jìn)行拆分，然后送上海生工公司進(jìn)行宏基因組學(xué)測序。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 16 SDNA高通量測序 采用 Ezup 柱式土壤基因組 DNA 抽提試劑盒提取土壤總DNA，利用Illumina 公司 MiseqTM測序儀進(jìn)行高通量測序。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 測序所得的原始read使用cutadapt 軟件出去接頭，PEAR軟件進(jìn)行序列對(duì)拼，Prinseq軟件進(jìn)行質(zhì)量剪切，使用Usearch軟件去除中非擴(kuò)增區(qū)域序列，然后對(duì)序列進(jìn)行校正，并用uchime軟件鑒定嵌合體，再將去除嵌合體的序列與數(shù)據(jù)庫代表性序列進(jìn)行blastn比對(duì)，剔除掉該低于閾值部分序列(靶區(qū)域外序列)。

采用Usearch軟件進(jìn)行OTU聚類分析，并作韋恩圖。使用97%相似度的OTU，利用mothur軟件稀釋曲線分析，利用R制作曲線圖。利用blastn將OTU序列(滿足相似度>90%且coverage>90%的序列)比對(duì)到18S真菌核糖體數(shù)據(jù)庫，ITS真菌核糖體數(shù)據(jù)庫和功能基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分類。并利用R對(duì)物種分類學(xué)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行作圖，并利用R的gplots package，將聚類之后的結(jié)果做物種豐度熱圖(heatmap)。根據(jù)各樣本物種豐度計(jì)算beta多樣性距離矩陣，將基于各樣本物種豐度通過bray-crutis算法構(gòu)建樣本聚類樹。使用MUSCLE軟件進(jìn)行多序列比對(duì)得到alignment文件，采用FastTree軟件(根據(jù)最大似然法)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹。采用R的pheatmap package，根據(jù)樣本間Unifrac距離矩陣?yán)L制熱圖?；谖锓N分類結(jié)果，計(jì)算在不同水平上各rank的豐度，比較4個(gè)樣本間豐度差異，找出顯著差異的物種分類(P≤0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤樣品的OTU 分類

圖1 4個(gè)不同土壤樣本的OTU韋恩圖Fig.1 Venn profile of OTU in different 4 samples

4個(gè)土壤樣本中(Pb0、Pb1、Pb2、Pb3)分別檢測到1 391、1 362、1 584和1 449個(gè)OTU，其中4個(gè)土壤樣本共有的OTU 為345個(gè)(圖1)。4個(gè)土壤樣各自特有的OUT為604個(gè)(占Pb0總OTU 的43.42%)，716個(gè)(占Pb1總OTU 的52.57%)，615個(gè)(占Pb2總OTU 的38.83%),580個(gè)(占Pb3總OTU 的40.28%)。

2.2 土壤樣品的多樣性指數(shù)分析

通過分析樣品的多樣性(Alpha diversity)來檢測土壤中真菌物種的豐富度以及多樣性。由表1可以看出，Pb0土壤樣本中獲取的優(yōu)質(zhì)reads數(shù)目最少，Pb2土壤樣本中檢測到的優(yōu)質(zhì)reads數(shù)目最多。ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)分別是用不同方法估計(jì)群落中含OTU數(shù)目的指數(shù)，在生態(tài)學(xué)中常用來估計(jì)物種總數(shù)。Pb1土壤樣本的ACE指數(shù)最低，Pb3土壤樣本的Chao1 指數(shù)均最低，表明Pb1和Pb3土壤樣本中的真菌總數(shù)都相對(duì)較少。4個(gè)土壤樣本DNA文庫的覆蓋率都在98%以上，能較好地反應(yīng)樣本的真實(shí)情況。Pb0土壤樣本的Shannon值最大，Simpson指數(shù)最低，Pb2土壤樣本的Shannon值最小，Simpson指數(shù)最大。Shannon指數(shù)越大，代表群落多樣性越高，而Simpson指數(shù)值越大，代表群落多樣性越低，說明Pb0土壤樣本的群落多樣性最高，而Pb2土壤樣本的群落多樣性最低。

表1 不同土壤樣品 alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)Tab.1 Alpha Index statistics of different soil

通過構(gòu)建稀釋曲線(Rarefaction Curve)，比較測序數(shù)據(jù)量不同的樣本中物種的豐富度，同時(shí)還可以顯示樣本的測序數(shù)據(jù)量的合理性。圖 2所示，4個(gè)土壤樣品rarefaction曲線均顯示趨于平坦的趨勢，說明這些樣本量足以覆蓋所有的真菌，其真菌群落具有豐富的多樣性。圖3 所示，4個(gè)土壤樣品的曲線數(shù)值先是直線上升，而后又趨向平坦，說明測序數(shù)據(jù)量合理，更多的數(shù)據(jù)量只會(huì)產(chǎn)生少量新的OUT，并且測序數(shù)據(jù)能覆蓋樣品中絕大多數(shù)真菌信息。Rank-abundance曲線可以表征樣品所含物種的豐富程度和均勻程度。由圖4可以看出，4個(gè)土壤樣品的橫坐標(biāo)長度均一致，都比較平坦，說明4個(gè)土壤樣品的物種組成都比較豐富，且物種組成的均勻程度也較高。

圖2 4個(gè)土壤樣品中真菌的Rarefaction 曲線Fig.2 Rarefaction curves of fungus in four samples

圖3 4個(gè)土壤樣品中真菌的Shannon曲線Fig.3 Shannon curves of fungus in four samples

通過構(gòu)建樣本聚類樹可以更直觀地表示不同樣品間的相似性和差異性(圖5)。通過不同顏色的樹枝表示來源于不同的組，展現(xiàn)了4個(gè)土壤樣本豐度的差異。如圖5所示，基于OUT分類，Pb2土壤樣本豐度與其余樣本之間的差異最大。主成分分析結(jié)果顯示(圖6)，Pb0、Pb1、Pb3樣本在一個(gè)區(qū)間，而Pb2樣本與其余樣本不在一個(gè)區(qū)間，表明Pb2樣本豐度與其余樣本有明顯差異。能直觀展現(xiàn)不同樣本之間的相似度。

圖4 不同土壤樣品的Rank abundance曲線Fig.4 Rank abundance curves of fungus in four samples

圖5 基于OTU的樣本聚類樹Fig.5 Clustering tree diagram based on OTU

圖6 4個(gè)土壤樣本的PCA 分析Fig.6 PCA analysis of four soil sample

顏色塊代表距離值，顏色越紅表示樣本間距離越近，相似度越高，越藍(lán)則距離越遠(yuǎn)Color blocks showed the distant value.The deeper the red color showed the closer the distance between the samples,the blue showed the farther圖7 4個(gè)土壤樣本的距離Fig.7 Heatmap of four soil sample

2.3 不同樣品的差異性比較

由圖7可以看出，顏色越深表示樣本間的差異越大。Pb2樣本和Pb1、Pb3樣本以及對(duì)照(Pb0)都差異顯著，這與聚類樹和主成分分析結(jié)果一致。Pb1樣本與對(duì)照(Pb0)之間以及Pb3樣本與對(duì)照(Pb0)之間的差異相對(duì)較小。對(duì)照(Pb0)與Pb2樣本的差異以及Pb3樣本與Pb2樣本的差異明顯大于Pb1樣本與Pb2樣本的差異。

2.4 不同土壤樣本真菌群落組成的差異

本研究發(fā)現(xiàn)4個(gè)土壤樣品的真菌主要分屬8大門(圖8)，其中子囊菌門Ascomycota分布最多，除對(duì)照外(Pb0)其余土壤樣本中都超過50%(49.77%～56.12%)，但各樣本間差異不明顯。隨著土壤中鉛濃度的增加，各土壤樣本中子囊菌門Ascomycota真菌群落的數(shù)量呈增加趨勢。其次為擔(dān)子菌門Basidiomycota(6.98%～8.91%)，接合菌門Zygomycota(3.04%～4.65%)。通過network分析(圖9)，可以看出Pb1和Pb3土壤樣本中擔(dān)子菌門Basidiomycota的真菌數(shù)量顯著高于Pb2和對(duì)照(Pb0)。Pb2土壤樣本中接合菌門Zygomycota的真菌數(shù)量顯著高于其余土壤樣本。各土壤樣本中壺菌門Chytridiomycota真菌群落分布較少，都低于10%(6.98%～8.91%)。只有Pb1土壤樣本中能檢測到極少量微孢子蟲門Microsporidia真菌分布，占比不足0.01%。還有相當(dāng)數(shù)量的真菌屬于未知門類(30.74%～37.13%)，且未知真菌群落的數(shù)量隨土壤中鉛濃度的增加而減少。

圖8 4種土壤樣本門分類豐度統(tǒng)計(jì)Fig.8 Relative abundance statistical figure of phylum classification from four soil samples

樣本以矩形為標(biāo)識(shí)，不同樣本顏色不同。物種分類以餅圖為標(biāo)識(shí)，面積大小代表整體豐度大小，餅圖中的不同色塊代表不同樣本在該物種分類上的豐度大小The sample is identified by a rectangle.The classification of species is labeled as pie.Different color represents different sample圖9 基于OTU的network圖Fig.9 Network based on OTU

2.5 不同土壤樣本真菌群落的差異

4個(gè)土壤樣品的真菌主要分屬20綱、20目和20科，其中超過30%(30.74%～37.13%)為未鑒定unclassified的類別，未鑒定真菌群落的數(shù)量隨土壤中鉛濃度的增加而減少。綱級(jí)別中糞殼菌綱Sordariomycetes(25.06%～35.15%)和散囊菌綱Eurotiomycetes(7.85%～11.61%)的真菌分布較多(表2)。目級(jí)別中肉座菌目分布較多，其在Pb3土壤樣本中的占比最低，為14.14%，在Pb2土壤樣本中占比最高，為23.68%，還有約5%的真菌屬于其他目分類?？萍?jí)別中叢赤殼科Nectriaceae(2.64%～6.74%)群落和小叢殼科Glomerellaceae群落(1.38%～3.56%)的分布相對(duì)較高。叢赤殼科Nectriaceae真菌群落的數(shù)量隨土壤中鉛濃度的增加而減少，小叢殼科Glomerellaceae真菌群落的數(shù)量隨土壤中鉛濃度的增加而增加，Pb3土壤樣本中小叢殼科真菌群落的數(shù)量顯著高于其余樣本。

表2 4種土壤樣本綱分類統(tǒng)計(jì)Tab.2 Relative abundance statistical table of class classification from four soil samples %

在屬級(jí)別，共在4個(gè)土壤樣本中檢測到335個(gè)真菌屬。其中青霉素Penicilliumsp.(0.71%～1.51%)、曲霉屬Aspergillussp.(1.75%～2.63%)、枝孢屬Cladosporiumsp.(1.52%～2.19%)的分布較多。其中Pb2土壤樣本中未能檢測到珠頭霉屬Oedocephalumsp.的真菌群落。Pb1土壤樣本中珠頭霉屬Oedocephalumsp.的菌群數(shù)量(1.82%)顯著高于其余樣本。Pb1和Pb3土壤樣本中未能檢測到亡革菌屬Thanatephorus的群落，Pb2土壤樣本中亡革菌屬Thanatephorussp.的群落數(shù)量顯著高于對(duì)照(Pb0)。Pb2和Pb3土壤樣本中未能檢測到錐蓋傘屬Conocybesp.群落。Pb0和Pb2土壤樣本中未能檢測到Arrheniasp.群落，Pb1土壤樣本中Arrheniasp.的群落數(shù)量顯著高于Pb3。只有Pb2土壤樣本中能檢測到Thyronectriasp.(0.6%)群落的分布。

兩兩比較的結(jié)果顯示(圖10)，Pb1和Pb02個(gè)土壤樣本顯著差異的真菌群落為157個(gè)屬。Pb2和Pb0土壤樣本間顯著差異真菌群落為156個(gè)屬。Pb3和Pb02個(gè)土壤樣本顯著差異的菌群分屬于156個(gè)屬。Pb1和Pb22個(gè)土壤樣本顯著差異的菌群分屬于154個(gè)屬。Pb1和Pb32個(gè)土壤樣本顯著差異的菌群分屬于143個(gè)屬，Pb1和Pb32個(gè)土壤樣本顯著差異的菌群分屬于131個(gè)屬。

圖10 4種土壤樣本屬分類豐度熱圖Fig.10 Relative abundance heatmap of genus classification from four soli samples

使用genus水平信息繪制，有OTU標(biāo)記的為OTU代表性序列結(jié)果，沒有的為數(shù)據(jù)庫對(duì)應(yīng)序列的結(jié)果Phylogenetic tree were draw using genus level information圖11 所有OTU代表性序列與數(shù)據(jù)庫序列系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹Fig.11 The phylogenetic tree of the all OTU sequences and the database sequence

2.6 進(jìn)化樹分析

根據(jù)最大似然法構(gòu)，采用FastTree軟件建進(jìn)化樹。由圖11 可以看出，不同土壤樣本中真菌群落中大致源于5個(gè)組別。由于未知種群較多，其進(jìn)化趨勢上不明晰，但已知群落進(jìn)化的遺傳距離多數(shù)較短，其親緣關(guān)系較近。

3 討論與結(jié)論

根際是土壤與植物進(jìn)行物質(zhì)交換的界面，通過植物、土壤、微生物的相互關(guān)系維持土壤生態(tài)系統(tǒng)的功能[15]，對(duì)外源污染物極其敏感。因此研究根際土壤微生物的群落構(gòu)成與功能特性對(duì)于揭示外源污染物對(duì)土壤微生態(tài)系統(tǒng)的影響具有重要的意義。利用高通量測序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)輕度和重度鉛污染三葉草根際土壤真菌數(shù)量顯著低于對(duì)照，但中度鉛(600 mg/kg)污染土壤中真菌數(shù)量與對(duì)照差異不顯著，說明中度鉛污染可會(huì)顯著抑制三葉草根際土壤真菌的生長。這與楊菊云[16]的研究結(jié)果有所不同，她發(fā)現(xiàn)鉛污染濃度為100 mg/kg時(shí)，苔草根際土壤中的真菌數(shù)量顯著高于對(duì)照，而隨著外源鉛濃度的增大，根際土壤中真菌的數(shù)量持續(xù)下降。可能是由于2個(gè)試驗(yàn)所用土壤質(zhì)地、養(yǎng)分含量、植物類型以及栽培方式等均不相同，所以造成真菌的生存環(huán)境差異較大，結(jié)果不盡相同。但高濃度外源鉛污染會(huì)抑制植物根際土壤真菌生長這一基本結(jié)果是一致的，主要是因?yàn)殂U對(duì)植物根際土壤真菌有毒害作用，同時(shí)抑制了植物根系的分泌作用，從而減少了真菌生長所必須的碳源和氮源的供給[17]。

研究結(jié)果顯示中度鉛(600 mg/kg)污染土壤中獲得的read數(shù)最高，Shannon值最小，Simpson指數(shù)最大，表明其土壤真菌數(shù)量最多，群落多樣性最低。而輕度鉛(300 mg/kg)污染土壤的Shannon值與對(duì)照一致，重度鉛(900 mg/kg)污染土壤的Shannon值僅略高于對(duì)照。這一結(jié)果說明，雖然輕度(300 mg/kg)和重度(900 mg/kg)鉛污染會(huì)降低土壤中真菌的總量，但對(duì)其群落的多樣性的影響較小。但中度鉛(600 mg/kg)污染會(huì)顯著降低三葉草根際土壤真菌群落的多樣性，對(duì)出現(xiàn)這一結(jié)果的原因仍需進(jìn)一步研究。

雖然鉛污染根際土壤和對(duì)照土壤中優(yōu)勢菌群的種類一致，但其菌群組成和豐度都存在差異。隨著外源鉛濃度的增加，三葉草根際土壤中子囊菌門、小叢殼科真菌的豐度逐漸增加，叢赤殼科的豐度逐漸降低，說明鉛污染會(huì)促進(jìn)子囊菌門、小叢殼科真菌的生長，抑制叢赤殼科真菌的生長。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)輕度(300 mg/kg)和重度鉛污染(900 mg/kg)土壤中未能檢測到亡革菌屬真菌。中度(600 mg/kg)和重度鉛污染(900 mg/kg)土壤中未能檢測到錐蓋傘屬真菌。對(duì)照和中度(600 mg/kg)鉛污染土壤中未能檢測到真菌。只有中度(600 mg/kg)鉛污染土壤中能檢測到少量Thyronectriasp.(0.6%)真菌的分布。這一結(jié)果說明不同種類的真菌對(duì)不同程度鉛污染的適應(yīng)能力不同，鉛污染會(huì)抑制某些類別真菌的生長，也可能促進(jìn)某些類別真菌的生長，同時(shí)不同類型真菌對(duì)鉛污染的適應(yīng)濃度也不同，這與Eevers等[18]和Peng等[19]的研究類似。

外源鉛污染影響三葉草根際土壤真菌群落組成和豐度，不同類型的真菌對(duì)鉛污染的適應(yīng)力不同。輕度(300 mg/kg)和重度(900 mg/kg)外源鉛污染會(huì)抑制三葉草根際土壤真菌的生長，中度外源鉛污染(600 mg/kg)不會(huì)降低三葉草根際土壤真菌的數(shù)量，但會(huì)降低其生物多樣性。后續(xù)應(yīng)分離和鑒定鉛污染土壤中優(yōu)勢菌群，進(jìn)一步研究其抗鉛脅迫的機(jī)制，為開發(fā)修復(fù)鉛污染土壤功能菌株提供參考。

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