漢中天麻多糖抗菌活性研究

陳 琛， 李鑫鑫， 付昀東， 劉 祥， 鄭紅星， 吳三橋， 李曉東

(1.陜西理工大學中德天然產物研究所/陜西理工大學生物科學與工程學院/陜西省天麻山茱萸工程技術研究中心/陜南秦巴山區(qū)生物資源綜合開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西漢中 723000； 2.陜西省略陽縣中藥材技術推廣服務中心，陜西略陽 724300)

天麻(GastrodiaelataBl.)別稱赤箭、定風草、水洋芋等，為蘭科天麻屬與密環(huán)菌特殊共生的多年生草本植物，屬國家三級保護物種，是一種名貴的中藥材，藥用部位為其塊莖[1]，其味甘、性平，具有息風止痙、平抑肝陽、祛風通絡的功能，用于治療頭痛眩暈、肢體麻木、小兒驚風、癲癇、抽搐、破傷風等病癥[2]，同時具有鎮(zhèn)靜、催眠、鎮(zhèn)痛、增強免疫等作用[3-9]。天麻中主要含有天麻素、天麻苷元、天麻多糖等多種成分[10-11]，其中天麻多糖含量高達25%[12]。

多糖是由10個以上的單糖通過糖苷鍵連接而成的一種天然大分子化合物，其種類繁多，廣泛存在于動物、植物、微生物中，目前對植物多糖和微生物多糖的研究較多。大量研究表明，多糖具有多種藥理活性，如增強機體免疫力、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、降血糖、抗輻射和抗衰老等作用[13-14]。通過中國知網(wǎng)(China National Knowledge Infrastructure，簡稱CNKI)和美國國立生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，簡稱NCBI)檢索發(fā)現(xiàn)，目前關于天麻多糖的研究主要集中在天麻多糖的提取工藝優(yōu)化、天麻多糖的分離純化、分子組成分析及結構表征、天麻多糖的增強免疫作用、改善睡眠等方面，未見有關天麻多糖的抗菌活性的研究報道。因此，本試驗以漢中天麻為研究對象，從天麻塊莖中提取多糖并研究抗菌活性，為其進一步開發(fā)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試藥材

鮮天麻，2016年11月采集于陜西省漢中市略陽縣。

1.2 供試菌株

選取的40株菌株中革蘭氏陰性菌(G-)20株、革蘭氏陽性菌(G+)12株、真菌8株。40株菌株中標準菌株庫菌株2株，臨床分離致病菌38株。菌株由大連理工大學生命科學院于海寧教授、蘇州大學藥學院王義鵬副教授提供，具體見表1。

表1 試驗所用菌株

注：肺克桿菌即肺炎克雷伯桿菌。下同。

1.3 主要試劑

酵母浸粉購自英國OXOID公司；葡萄糖標準品來自中國食品藥品檢定研究院；蛋白胨購自索萊寶科技有限公司；雙氧水、95%乙醇、無水乙醇、丙酮、乙醚、苯酚、硫酸均為國產分析純。

1.4 儀器與設備

臺式離心機Rotina 420R購自德國Hettich公司；酶標儀購自美國伯騰儀器有限公司；紫外分光光度計4802S購自尤尼柯上海儀器有限公司；旋轉蒸發(fā)儀RV10購自德國IKA公司；722G可見分光光度計購自上海儀電分析儀器有限公司；真空恒溫干燥箱購自上海實驗儀器廠有限公司；冷凍干燥機LGJ-10D購自北京四環(huán)科學儀器廠有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺購自蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.5 新鮮材料預處理

鮮天麻采收后當天洗凈泥沙，常壓蒸煮30 min，冷卻，切片，105 ℃烘干，粉碎，過40目篩得到天麻粉末[15]。

1.6 天麻多糖提取

精確稱取干天麻40 g，以水作為提取液，按照液料比 45 mL ∶1 g，在66 ℃下超聲提取34 min，在4 500 r/min下離心 20 min，減壓濃縮至1/5，收集上清液用雙氧水進行脫色[16]，以濃氨水(或氫氧化鈉溶液)調節(jié)pH值至8.0左右，50 ℃以下滴加雙氧水至淺黃色，低溫放置2 h。然后緩慢加入5倍量的95%乙醇，邊加邊攪拌后置于4 ℃冰箱沉淀 24 h，離心過濾后取出沉淀物，并分別用乙醚、石油醚、無水乙醇于 4 500 r/min 離心6 min進行洗滌，轉入真空干燥箱，在 45 ℃、0.08 kPa 下干燥[17-18]。

1.7 多糖含量測定

以葡萄糖為對照物，用苯酚-硫酸法[19]測定多糖含量，以葡萄糖濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標，得線性回歸方程y=0.062 6x+0.114 6，r2=0.999 1。

1.8 薄層瓊脂糖孔穴擴散法

采用薄層瓊脂糖孔穴擴散法[20]定性測定天麻多糖抗菌活性。將稀釋后含2×105CFU/mL的菌液均勻涂布于固體LB培養(yǎng)基表面，將經(jīng)過滅菌的直徑為6 mm的濾紙片置于培養(yǎng)基表面，滴加6 μL待測樣品溶液，于37 ℃培養(yǎng)18～20 h，觀察抑菌圈形成與否，有抑菌圈形成的表明有抑菌活性，抑菌圈的大小可以衡量抑菌活性的強弱。各設3個重復，用十字交叉法測量抑菌圈直徑，取平均值。有抑菌圈的進一步采用常量肉湯稀釋法定量測定最小抑菌濃度。

抑菌效果判斷標準：以抑菌圈直徑>20 mm為極敏(++++)，抑菌圈直徑在15～20 mm之間為高敏(+++)，抑菌圈直徑在10～14 mm之間為中敏(++)，抑菌圈直徑<10 mm 為低敏(+)，8 mm即無抑菌圈(-)[21]。

1.9 微量肉湯稀釋法

采用微量肉湯稀釋法定量測定天麻多糖對各種菌株的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，簡稱MIC)。MIC測定采用Wiegand等建立的方法[22-24]并加以改進。將細菌接種于LB固體培養(yǎng)基上，于37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。待菌落長出后，用接種環(huán)挑取單菌落轉接到LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，調整菌液濃度為2×105CFU/mL。在無菌環(huán)境下操作，在無菌96孔板上第1孔中加90 μL MH液體培養(yǎng)基，第2～11孔中加入50 μL MH液體培養(yǎng)基。第1孔中再加入待測樣品10 μL，充分混勻后取 50 μL 加入第2孔，依次倍比稀釋，從第10孔吸出50 μL棄去，在第11孔加50 μL菌液(不加樣品)作為對照，在第12孔加50 μL MH肉湯?；靹蚝蠓胖糜?7 ℃ 、150 r/min培養(yǎng)6～8 h，于600 nm波長處測定吸光度。MIC為能阻止50%以上細菌生長的最小抑菌濃度。用酶標儀在600 nm下對平板進行掃描，提取物MIC按照比對照孔(第11孔)的渾濁程度低50%以上的最小質量濃度計算。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 提取及檢測

濕天麻經(jīng)過蒸煮、切片、干燥、粉碎、過40目篩得到天麻飲片。取40 g天麻飲片制成干粉，經(jīng)過超聲輔助水提醇沉得到13.5 g天麻粗多糖，提取率為33.75%，天麻多糖含量測定結果為16.4%。

2.2 薄層平板瓊脂糖孔穴擴散法定性測定

定性測定菌株共選取10株，包括G-、G+、真菌，既有標準菌株庫菌株，也有臨床致病菌。濃度120 mg/mL的天麻提取物對10株菌株的抑菌圈結果見圖1、表2。

由表2可知，薄層平板瓊脂糖孔穴擴散法測定結果顯示，天麻多糖對10株菌均有抑制作用，其中對銅綠假單胞菌ATCC 27853抑菌活性最好，抑菌圈直徑達到了36 mm，對銅綠假單胞菌08031014的抑菌圈直徑為22 mm，對以上2株菌判定為極敏感；金黃色葡萄球菌08032706、白色念珠菌08022710、大腸桿菌ATCC25922、肺克桿菌08031012、痢疾桿菌表現(xiàn)為高敏；類腸球菌、白色念珠菌08030401表現(xiàn)為中敏。

表2 天麻多糖對各種菌株的抑菌圈直徑

注：“++++”表示極敏；“+++”表示高敏；“++”表示中敏；“+”表示低敏。

2.3 MIC測定

利用二倍稀釋法在96孔板上將天麻多糖稀釋10個濃度梯度，10個濃度梯度分別為120、60、30、15、7.5、3.75、1.875、0.937 5、0.468 75、0.234 375 mg/mL。對20株G-菌、12株G+菌、8株真菌共40株菌株的MIC進行了測定，結果見表3。

由表3可知，天麻多糖對20株G-菌的MIC范圍為 0.468 75～15 mg/mL，對12株G+菌的MIC范圍為 0.937 5～ 120 mg/mL，對8株真菌的MIC測定范圍為0.937 5～ 30 mg/mL。從結果看天麻多糖對G-菌的抑菌活性最好，其次為真菌，對革蘭氏陽性菌的抑菌活性相對較弱。其中天麻多糖對嗜麥芽假單胞菌090223、黏質沙雷氏菌1379、產酸克伯桿菌3株革蘭氏陰性菌的抑菌活性最好，MIC最低，為0.468 75 mg/mL。

3 討論

天麻是蘭科天麻屬多年生草本植物，根狀莖肥厚，無綠葉，蒴果倒卵狀橢圓形。其根莖入藥用以治療頭暈目眩、肢體麻木、小兒驚風等癥并且對一些細菌具有一定的抑制作用[25-26]。從已有報道中可知，烏天麻揮發(fā)油對米曲霉、黃曲霉、小麥紋枯病和茶輪斑病有一定的抑制作用[27]。

本試驗對選取的40株菌(G-菌20株、G+菌12株和8株真菌)進行了抑菌活性研究。從試驗結果可知，天麻多糖具有廣譜抑菌活性，無論是對革蘭氏陽性菌，還是革蘭氏陰性菌或真菌都具有抑制作用并且抑制效果較為明顯。對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌和真菌的MIC值范圍分別為0.468 75～ 15 mg/mL、0.937 5～120 mg/mL、0.937 5～30 mg/mL，其中對革蘭氏陰性菌的抑菌效果更為明顯，表現(xiàn)出很強的抑制效果，對嗜麥芽假單胞菌090223、黏質沙雷氏菌1379、產酸克伯桿菌的最小抑菌濃度更是低至 0.468 75 mg/mL。本研究結果為天麻的進一步研究開發(fā)利用提供了一定的依據(jù)。

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