Connexin43介導胃腸神經-Cajal間質細胞-平滑肌網(wǎng)絡縫隙連接通訊的研究進展*

禹振華 審核：黃忠誠

（湖南師范大學第一附屬醫(yī)院結直腸肛門外科 湖南長沙 410005）

縫隙連接蛋白（Connexin，Cx）廣泛分布于各器官、組織中（紅細胞、骨骼肌除外），目前發(fā)現(xiàn)的Cx至少有 20 種［1］，是構成縫隙連接（Gap junction，GJ）的基本結構和功能蛋白，其中縫隙連接蛋白43（Connexin43，Cx43）的表達最廣泛［2］，迄今已發(fā)現(xiàn)存在于34種組織和46種細胞中［3］。Cx43介導的縫隙連接通迅（gap junction intercellular communication，GJIC）是細胞間信號傳導最主要、最直接的形式，可以快速、可逆地促進相鄰非刺激細胞對外界信號的協(xié)同反應。胃腸神經可直接作用于Cajal間質細胞（interstitial cells of Cajal，ICC），信號由ICC通過GJ通道傳遞給平滑肌細胞 （smooth muscle cell，SMC），從而在胃腸神經-ICC-SMC網(wǎng)絡中實現(xiàn)完整的神經支配平滑肌通路。作為胃腸神經-ICC-SMC網(wǎng)絡結構的重要組成部分，Cx43在縫隙連接通迅方面具有廣闊的研究前景。

1 Cx43的形態(tài)學特點

不同的Cx有不同染色體基因座上的單一基因編碼［4］。人類組織中的Cx43存在2個基因位點：一個在6號染色體上的功能基因位點和一個在5號染色體上的假基因位點。在核酸分子水平上，Cx43是由總長度為2768堿基對（bp）的3條互補脫氧核糖核酸（cDNA）所編碼，該復合cDNA含有21146堿基對（bp）的開放閱讀框，被認為是一種非突變型抑瘤基因，其編碼的Cx相對分子質量為43000，故命名為 Cx43［5］。 在蛋白質分子水平上，Cx43含有 387個氨基酸，具有高度保守的氨基酸序列，其氨基末端、胞質環(huán)和羧基末端位于胞質面，胞質環(huán)和羧基末端的氨基酸序列是非同源性的，這部分特異性結構可能參與不同的生理過程：Cx43磷酸化、結合鈣調蛋白以及蛋白溶解等細胞新陳代謝過程；胞外環(huán)EL1和EL2由兩個二硫鍵連接，便于識別及對接相應的Cx［6］，二硫鍵在氨基酸形成Cx43中起重要作用。

2 Cx43的功能學特點

2．1 Cx43參與縫隙連接構成 縫隙連接（GJ），又稱通訊連接、間隙連接，是由連接相鄰兩個細胞之間的連接通道排列而成的一種特殊膜結構［7］，目前已確認不少疾病和 GJ相關基因突變有關［8、9］。Cx是構成GJ的基本結構和功能蛋白，作為Cx基因家族中分布最廣泛、數(shù)量最豐富的Cx43是構成GJ最重要的Cx，在胚胎時期就已經開始表達［10］。在細胞膜上，每6個跨膜的蛋白亞基圍繞中央孔 （直徑1．5～2．0 nm）排列形成一個連接子 （Connexon）（即半通道，hemichannels），連接子平時漂浮在細胞膜上，半通道呈關閉狀態(tài)，GJIC進行時則與相鄰細胞膜上的連接子以非共價鍵結合，端端對接形成親水性GJ通道［11］。GJ通道允許相鄰細胞的離子以及親水性小分子物質（相對分子質量＜1200）經主動擴散通過，此外許多第二信使如Ca2+、ATP和cAMP等也可以通過GJ在相鄰細胞間擴散［12］。Cx43給相鄰細胞間提供了一個物質交換的代謝偶聯(lián)通道外，還提供了一個電信號傳遞的低阻抗電偶聯(lián)通道，是肌細胞間電興奮快速擴散的關鍵部位，保證了肌細胞間活動的一致性。

2．2 Cx43磷酸化參與縫隙連接通訊調控 蛋白質的磷酸化廣泛存在于真核細胞中，是蛋白質轉錄后加工的一種重要修飾形式，也是真核細胞信號轉導的核心。Cx大多為磷蛋白并且處于不同程度的磷酸化水平［13］，有研究表明磷酸化是其主要的共價修飾［14］。在蛋白激酶和蛋白磷酸化酶的共同作用下，Cx43磷酸化貫穿著GJIC調控中半通道的寡聚化和活性調節(jié)、GJ通道的組裝和控制以及Cx43的降解等Cx43生命周期的多個階段。Cx43處于動態(tài)變化過程，半衰期 1～3 h［15］，它首先在細胞內質網(wǎng)核糖體上合成，然后被轉運到高爾基復合體，6個Cx在高爾基復合體內聚集形成一個連接子后被轉運到細胞膜上，在聚集轉運過程中Cx43被磷酸化［16］。在穩(wěn)態(tài)細胞的生命周期中，Cx43的羧基末端241～382位點為主要的磷酸化區(qū)域，也是多種激素的識別位點，受多種蛋白激酶的調節(jié)，對GJ通道組裝、控制和功能調節(jié)起關鍵性作用［17］。 多種蛋白激酶 （如PKC、MAPK等）及Src家族中絡氨酸激酶都可磷酸化和去磷酸化Cx43羧基末端相應位點，從而調節(jié)GJ通道效應［18］。目前Cx43磷酸化對GJIC影響的具體分子機制仍不明確，有待于進一步研究。

3 Cx43與胃腸神經-ICC-SMC網(wǎng)絡縫隙連接通訊

3．1 Cx43在胃腸壁的分布 Cx43在胃腸壁不同部位出現(xiàn)差異性分布。Kanczuga-Koda等［19］用免疫組化法發(fā)現(xiàn)在人類結腸環(huán)形肌全層特別是環(huán)形肌最內層與黏膜層相交界處及肌下神經叢內Cx43免疫反應較強，而縱行肌層沒有明顯的Cx43免疫反應；黏膜肌層Cx43染色密度高，而黏膜層很少見。近年來眾多研究發(fā)現(xiàn)，Cx43大都存在于胃腸ICC網(wǎng)絡區(qū)域，但Cx43與ICC在胃腸壁中并不具有一致性分布。Seki等［20］發(fā)現(xiàn)，在荷蘭豬消化道肌束中Cx43免疫分布與ICC明顯相反。在小腸外層環(huán)形肌中很少觀察到ICC，而在環(huán)形肌中Cx43免疫染色密度高；在結腸中可觀察到一定量的ICC分布，但在環(huán)形肌層中沒有明顯的Cx43免疫反應。Cx43與ICC分布的數(shù)目在鼠胃中也常是相反的［21］。

3．2 胃腸神經-ICC-SMC網(wǎng)絡 Cajal間質細胞（ICC）是西班牙神經解剖學家Cajal利用甲基藍及嗜銀染色法在胃腸道發(fā)現(xiàn)的特殊類型的間質細胞，主要分布在消化道自主神經末梢與SMC之間，是胃腸電活動的起搏細胞［22］。ICC能自發(fā)產生慢波，慢波決定胃腸道平滑肌收縮的基本電節(jié)律，是胃腸運動的基礎［23］。目前普遍認為，ICC作為胃腸神經與SMC的中介插入胃腸神經和SMC之間，借助GJ與平滑肌細胞相連［24］，三者相互形成獨特的網(wǎng)絡結構，即“胃腸神經-ICC-SMC網(wǎng)絡”。由Cx43參與構成的GJ廣泛存在于SMC之間、SMC與ICC-DMP之間以及ICC-DMP之間。Belzer等［25］在向人小腸的單個 ICCDMP內注射熒光染料熒光黃（LY）后，發(fā)現(xiàn)LY可以透過ICC-DMP間的GJ，且LY透過現(xiàn)象能夠被辛醇阻斷，表明了ICC-DMP間通過GJ進行功能性偶聯(lián)。組織學超微結構進一步研究顯示ICC與SMC之間也存在GJ［26］。以上研究結果為Cx43參與胃腸神經-ICC-SMC網(wǎng)絡構成提供了理論上的證據(jù)。

3．3 胃腸神經支配平滑肌通路 胃腸神經與ICC關系密切，Horiguchi等［27］在犬的胃竇內發(fā)現(xiàn)，胃腸神經末端通過突觸樣連接與ICC緊密相連，突觸間隙約為20 nm，比其與SMC的接觸更緊密。組織學超微結構進一步發(fā)現(xiàn)，在腸神經末端與ICC之間存在突觸樣結構，而腸神經末端與SMC之間沒有突觸樣結構緊密相連［28］。胃腸神經末端通過突觸樣結構與ICC連接，神經遞質主要靶器官是ICC，僅有少量興奮性神經遞質釋放后作用于SMC，既以胃腸神經-ICC-SMC網(wǎng)絡為主及少量胃腸神經-SMC網(wǎng)絡構成的胃腸神經信號傳導網(wǎng)絡結構［29］。因此，胃腸神經信號不是簡單通過神經肌肉間松散的突觸結構傳導，Komuro［28］認為，當 SMC 之間 GJ受損時，ICC 可以通過GJ讓SMC直接接受來自ICC的電化學信號，然而，當SMC之間存在良好的GJ時，SMC與ICC之間只需形成較少GJ接收神經信號。在胃腸神經支配平滑肌通路中，ICC使SMC受到胃腸神經的間接調控，GJ可能是ICC行使其生理功能的基本結構之一。

3．4 胃腸運動 胃腸神經-ICC-SMC形成的網(wǎng)絡結構，是胃腸動力的基本功能單位。Cx43給相鄰細胞提供了一個低阻抗、保證肌肉活動協(xié)調性與同步性的電偶聯(lián)通道，是細胞間電興奮傳導的關鍵部位。在胃腸神經信號傳導中，神經釋放的神經遞質絕大多數(shù)直接通過胃腸神經末梢與ICC之間的突觸樣結構作用于ICC，ICC產生的慢波電位在GJIC中通過ICC與SMC之間存在的GJ，將信號傳導給SMC，慢波電位使其膜電位去極化引發(fā)動作電位，導致SMC內鈣離子濃度變化，進而引起胃腸平滑肌產生相應的機械舒縮運動［30］。國內外許多研究都表明Cx43與胃腸運動有密切關系［27、31］。 Takeda 等［32］發(fā)現(xiàn)，GJ 的裂解劑甘草次酸可通過裂解ICC和SMC之間的GJ，不但能降低犬的回腸和結腸的收縮振幅，還能降低其自發(fā)性收縮頻率。Cx43在胃腸道中的異常表達與分布可能是導致胃腸動力障礙的病理生理學基礎之一。

4 Cx43相關的胃腸動力障礙性疾病

Cx43編碼基因發(fā)生突變、Cx43表達及分布異?；蚣毎gGJ受損，都會導致ICC之間、ICC與SMC之間神經介質、激素及一些神經遞質等物質交換不暢，引起相應部位動作電位傳遞受阻［33，34］。 據(jù)研究報道，在多器官功能障礙綜合征（MODS）大鼠腸道功能障礙機制的研究中發(fā)現(xiàn)，大鼠小腸ICC-DMP之間、ICC-DMP與SMC之間、SMC與SMC之間存在Cx43表達減少及 GJ 受損［35，36］。 另有研究發(fā)現(xiàn)，重型顱腦損傷（SHI）后小鼠小腸平滑肌自主節(jié)律運動紊亂，14天內胃腸動力障礙持續(xù)存在，進一步通過Western blot法檢測發(fā)現(xiàn) Cx43 表達減少［37，38］。 Cx43 減少可能是導致先天性巨結腸發(fā)病的重要原因之一［39］。謝麗微等［40］用免疫組化EliVison法檢測68例先天性巨結腸（HD）和8例無消化道畸形患兒狹窄段與擴張段Cx43的表達，發(fā)現(xiàn)HD患兒腸管擴張段Cx43的表達與對照組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05），而狹窄段 Cx43的表達明顯減弱（P ＜0．05）。 GJ受損可能是導致糖尿病胃輕癱發(fā)病的重要原因之一［41］。吳漢妮等［42］通過建立糖尿病胃輕癱大鼠模型和應用免疫組化法，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠胃體和胃竇部Cx43的分布明顯低于正常對照組，而正常大鼠Cx43密集分布在胃體和胃竇部環(huán)形肌層中。

綜上所述，相鄰細胞通過Cx43提供的GJ通道介導GJIC進行著物質交換、信息交流和能量傳遞，調控細胞的新陳代謝、增殖、分化和凋亡等生理過程，對維持機體內環(huán)境穩(wěn)定、生長發(fā)育及保持宏觀的體內平衡具有重要意義。近幾年來的研究進一步揭示了胃腸神經-ICC-SMC網(wǎng)絡GJIC調節(jié)胃腸道平滑肌運動的機制，但其在胃腸病理損傷狀態(tài)下的具體分子機制尚不明了，并有研究發(fā)現(xiàn)在胃腸神經-ICC-SMC網(wǎng)絡中可能存在GJ以外的連接通訊參與了神經信號傳導［43］，胃腸神經信號傳導的確切機制有待深一步研究，以Cx43作為切入點，可能會為某些胃腸動力障礙性疾病的相關藥物治療提供理論支持，也可能會為一些胃腸動力障礙性疾病的發(fā)生及轉歸提供新的治療思路。

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