淺談建立膿毒癥動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷男路椒?/h1>
2018-06-28 07:48:32劉艷苓張佳麗欒澤柱陳桂榮
當(dāng)代醫(yī)藥論叢 2018年8期
高 宇，陳 慧，劉艷苓，謝 瑩，張佳麗，欒澤柱，陳桂榮
（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 110033）
膿毒癥（sepsis）是指由感染因素所致的全身炎癥反應(yīng)綜合征。該病是導(dǎo)致在重癥監(jiān)護(hù)病房接受治療的非心臟病患者死亡的主要原因，其致死率高達(dá)28%～47%[1]。膿毒癥動(dòng)物模型是臨床上對(duì)膿毒癥的發(fā)病機(jī)制和防治方法進(jìn)行研究所必須的實(shí)驗(yàn)品，也是膿毒癥研究的難點(diǎn)所在。盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（cecal ligation perforation，CLP）是臨床上制備膿毒癥動(dòng)物模型的金標(biāo)準(zhǔn)。但是，用CLP制備的膿毒癥動(dòng)物模型不能完全復(fù)制臨床膿毒癥。由于膿毒癥患者最常見(jiàn)的感染源來(lái)自腹腔，故近年來(lái)，臨床上逐漸嘗試將腹腔感染模型作為常用的膿毒癥動(dòng)物模型[2]。目前，建立與臨床腸源性膿毒癥的發(fā)病機(jī)制較為接近的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵殉蔀獒t(yī)學(xué)界研究的新熱點(diǎn)。在本次研究中，筆者采用向模型大鼠的腹腔內(nèi)注射大鼠糞便勻漿的方法建立腸源性膿毒癥大鼠模型，以期為膿毒癥的研究提供新的參考依據(jù)。
1 儀器與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑
1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 XW-80A微型渦旋混合儀（由上海滬西分析儀器廠有限公司生產(chǎn)）、AS3120A超聲提取器（由天津奧特賽恩斯儀器有限公司生產(chǎn)）、TGL-16C高速離心機(jī)（由上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)）、Sartorious CP 225D型精密天平（由北京塞多斯儀器系統(tǒng)有限公司生產(chǎn)）、eppendorf可調(diào)式移液器（由德國(guó)艾本德公司生產(chǎn)）、DCY-24G型氮吹儀（由青島?？苾x器有限公司生產(chǎn)）、ACO-328型電磁式空氣壓縮機(jī)（由廣東海利集團(tuán)有限公司生產(chǎn)）、FJ-200高速分散均質(zhì)機(jī)（由上海標(biāo)本模型廠生產(chǎn)）。
1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 濃度為95%的乙醇、無(wú)水乙醇、脂多糖（LPS）試劑。
1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
從遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司購(gòu)入60只SD大鼠，其合格證號(hào)為SCXK（遼）2015-0001。這60只大鼠均為雌性、SPF級(jí)大鼠，其體重為180～220 g。
1.3 實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1 對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行分組 將這60只SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)表法分為6組，分別為模型組1、模型組2、模型組3、模型組4、模型組5和空白組，每組各有10只大鼠。對(duì)這6組大鼠依次進(jìn)行稱(chēng)重和編號(hào)。
1.3.2 進(jìn)行內(nèi)毒素血癥大鼠模型的復(fù)制 1）進(jìn)行糞便勻漿上清液的制備。對(duì)這60只SD大鼠進(jìn)行1周的適應(yīng)性飼養(yǎng)后，收集其新鮮成形的糞便。對(duì)大鼠糞便進(jìn)行稱(chēng)量后，向其中加入適量的生理鹽水，然后將該混合物置于勻漿機(jī)中進(jìn)行充分的研磨，制備成濃度為10%的大鼠糞便勻漿。按3000 轉(zhuǎn)/min的轉(zhuǎn)速對(duì)大鼠糞便勻漿進(jìn)行5 min的離心處理，得到上清液，然后用注射器吸取適量的上清液備用。2）進(jìn)行大鼠模型的制備。在進(jìn)行造模前，使1～5組模型組大鼠禁食12 h，然后按1 ml/200 g的劑量向其腹腔內(nèi)注射濃度為10%的大鼠糞便勻漿上清液。在注射完成后，觀察這5組大鼠的體征及表現(xiàn)。這5組大鼠若出現(xiàn)蜷縮、少動(dòng)、精神萎靡、毛發(fā)不榮、寒顫、鼻周有明顯血痕等體征，則表示造模成功。將造模成功的大鼠作為本次的研究對(duì)象。
1.3.3 進(jìn)行血液標(biāo)本的采集 在5組模型組大鼠造模成功10 h后，從這5組模型組大鼠和空白組大鼠的眼眶靜脈叢各采集0.5 ml的血液，將其血液標(biāo)本放入肝素化的Ep管中，按5000 r/min的轉(zhuǎn)速對(duì)其血液標(biāo)本進(jìn)行10 min的離心處理，得到上清液，然后將上清液放置在-80℃的環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.4 進(jìn)行血液標(biāo)本的處理 精密吸取6組大鼠150 μl的血液，將其血液標(biāo)本置于容積為2 ml的離心管中，依次向離心管內(nèi)加入10 μl的內(nèi)標(biāo)液異補(bǔ)骨脂素、600 μl的甲醇，然后進(jìn)行2 min的渦旋，使管內(nèi)容物充分地混勻。按5000 r/min的轉(zhuǎn)速對(duì)離心管內(nèi)的混合液進(jìn)行10 min的離心處理，得到上清液，然后用40 ℃的空氣流吹干上清液，得到上清液殘?jiān)?。向上清液殘?jiān)屑尤?00 μl的甲醇進(jìn)行復(fù)溶，對(duì)復(fù)溶物進(jìn)行1 min的超聲處理、2 min的渦旋，然后用型號(hào)為0.45 μm的微孔濾膜對(duì)復(fù)溶物進(jìn)行濾過(guò)。
1.3.5 進(jìn)行血液樣本的采集和血清LPS水平的測(cè)定 在造模完成48 h后，用乙醚對(duì)6組大鼠進(jìn)行麻醉，用無(wú)熱原的針筒心尖采集其200 μl的血液。向這6組大鼠的血液標(biāo)本中加入200 μl的抗凝劑，充分混勻后，將其血液標(biāo)本置于冰水中，進(jìn)行5 min的低溫離心處理（轉(zhuǎn)速為3000 r/min），得到上清液。將大鼠的血液上清液制備成2倍濃度的稀釋液，取 0.1 ml的該稀釋液，向其中加入0.4 ml的樣本處理液后混勻，制成10倍的稀釋液。將該稀釋液放入70 ℃的水浴箱中加熱10 min后取出，再將其放入冰水中進(jìn)行冷卻。取無(wú)熱原試管，向其中加入0.1 ml的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水、0.1 ml的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液、0.1 ml的血漿供試品、0.1 ml的鱟試劑溶液，將上述液體混勻后放入37 ℃的水浴箱中溫育10 min。在溫育結(jié)束后，向上述的混合液中加入0.1 ml的顯色基質(zhì)，混勻，對(duì)該混合液再次進(jìn)行6 min的溫育，然后向該混合液中依次加入偶氮化試劑1、偶氮化試劑2和偶氮化試劑3（各加入0.5 ml），待混勻后靜置5 min，在λ 545 nm處測(cè)定該混合液的吸光度值。上述實(shí)驗(yàn)中所使用的試管、吸頭和保存管均為無(wú)熱原耗材。
1.3.6 進(jìn)行血清TNF-α 和IL-6水平的測(cè)定 從這6組大鼠的血液標(biāo)本中取40 μl的血液，向其中依次加入10 μl生物素標(biāo)記的二抗、50 μl的酶標(biāo)試劑，在37℃的環(huán)境下反應(yīng)60 min，并洗板5次，再依次向其中加入顯色液A、顯色液B，在37 ℃的環(huán)境下顯色15 min，然后向其中加入終止液，在加入后的10 min內(nèi)測(cè)定其OD值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程計(jì)算對(duì)應(yīng)樣品的濃度。
1.3.7 進(jìn)行臟器組織的病理觀察 迅速對(duì)這6組大鼠進(jìn)行解剖，取其心、肝、脾、肺、腎組織，用生理鹽水對(duì)這些臟器組織進(jìn)行漂洗后，置入濃度為10%的福爾馬林溶液中進(jìn)行固定。對(duì)這6組大鼠的臟器組織進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色，在光鏡下觀察各臟器組織的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，描述各臟器組織的病理變化情況。從這60只大鼠的心、肝、脾、肺、腎組織中各切去約1 cm3的組織塊進(jìn)行脫水，然后用石蠟進(jìn)行包埋。將這些組織塊切成厚度為5 μm的組織切片，對(duì)這些組織切片進(jìn)行脫蠟，用蘇木素-伊紅（HE）對(duì)其進(jìn)行常規(guī)染色，用中性樹(shù)膠對(duì)其進(jìn)行封片，然后在顯微鏡下對(duì)其進(jìn)行觀察。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
應(yīng)用SPFF20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)本次研究中的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 5組模型組大鼠在造模完成后的臨床體征及表現(xiàn)
在向模型組5組大鼠的腹腔內(nèi)注射完濃度為10%的大鼠糞便勻漿后，有80%的大鼠出現(xiàn)喜歡聚集成堆、行動(dòng)能力下降、失去攀爬行為、輕微眼迷離、大便溏稀、對(duì)聲音的敏感度減退、不自主寒顫等表現(xiàn)。在注射完成6 h后，這5組大鼠僅在短時(shí)間內(nèi)分散開(kāi)，仍沒(méi)有運(yùn)動(dòng)行為，其精神萎靡、眼內(nèi)分泌物增加、毛發(fā)豎起且沒(méi)有光澤、呼吸加深加快、不自主寒顫加重，嚴(yán)重者甚至出現(xiàn)死亡。這5組大鼠的死亡高峰期主要集中在注射糞便勻漿后的12～48 h之間，在注射完3 d后其不再死亡。在這5組大鼠中，有30%的大鼠在注射完糞便勻漿的數(shù)小時(shí)后死亡。
2.2 5組模型組大鼠與空白組大鼠血清LPS水平的對(duì)比
與空白組大鼠相比，5組模型組大鼠血清LPS的水平均較高，P＜0.01。
2.3 5組模型組大鼠與空白組大鼠血清IL-6和TNF-α水平的對(duì)比
在注射大鼠糞便勻漿后，5組模型組大鼠血清IL-6和TNF-α的水平迅速升高，且在注射后的6 h達(dá)到高峰，在注射后的48 h逐漸降低至正常水平。與空白組大鼠相比，5組模型組大鼠血清IL-6和TNF-α的水平較高，P＜0.05。詳見(jiàn)表2。
表1 5組模型組大鼠與空白組大鼠血清LPS水平的對(duì)比（EU/ml， ）
表1 5組模型組大鼠與空白組大鼠血清LPS水平的對(duì)比（EU/ml， ）
組別（n=10） LPS水平模型組1 2.15±0.08模型組2 2.36±0.04模型組3 2.45±0.03模型組4 2.19±0.04模型組5 2.28±0.03空白組 0
表2 5組模型組大鼠與空白組大鼠血清IL-6和TNF-α水平的對(duì)比 （ ng/ml， ）
表2 5組模型組大鼠與空白組大鼠血清IL-6和TNF-α水平的對(duì)比 （ ng/ml， ）
組別（n=10） 時(shí)間 IL-6 TNF-α模型組5 注射48 h后 203.8±4.52 101.53±2.30模型組4 注射24 h后 280.6±8.44 151.76±2.42模型組3 注射12 h后 244.4±6.26 130.24±1.49模型組2 注射6 h后 338.4±8.33 181.18±3.24模型組1 注射2 h后 463.8±7.42 279.88±1.69空白組 154.6±7.13 69.65±6.98
2.4 5組模型組大鼠與空白組大鼠臟器組織病理切片的對(duì)比
對(duì)6組大鼠心、肝、脾、肺、腎的病理切片進(jìn)行對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，5組模型組大鼠的脾臟受損的程度均較輕，但其心、肝、肺、腎中均發(fā)現(xiàn)大量的炎性浸潤(rùn)，其心、肝、肺、腎受損均較為明顯。詳見(jiàn)圖1。
圖1 5組模型組大鼠與空白組大鼠臟器組織病理切片的對(duì)比
3 討論
膿毒癥是指血液中的細(xì)菌或病灶將大量的LPS釋放入血液，使血液中LPS的水平超過(guò)機(jī)體所能承受的上限所引發(fā)的一系列病理反應(yīng)[3-4]。發(fā)生燒傷、腸道菌群異位、大面積的嚴(yán)重感染、遭受外傷等均可導(dǎo)致膿毒癥發(fā)生。近年來(lái)，醫(yī)學(xué)界對(duì)膿毒癥的研究日益廣泛。因此，在進(jìn)行膿毒癥的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)選擇合適的造模方法，復(fù)制與臨床上膿毒癥的發(fā)病機(jī)制更為相似的病理模型顯得尤為重要[5-6]。
在本次研究中，筆者通過(guò)向5組SD大鼠的腹腔內(nèi)注射濃度為10%的大鼠糞便勻漿，使其發(fā)生腹膜感染，從而引發(fā)腸道菌群紊亂、異位、內(nèi)毒素釋放入其血液，進(jìn)而使其出現(xiàn)膿毒癥的病理狀態(tài)。在5組大鼠造模完成48 h后，其血清LPS的水平、血清TNF-α和IL-6的水平均明顯高于空白組大鼠。對(duì)這5組模型組大鼠臟器的病理切片進(jìn)行分析的結(jié)果顯示，其心、肝、肺、腎均受到大量炎性因子的浸潤(rùn)，并出現(xiàn)了明顯的損傷。由此可見(jiàn)，本研究中所使用的造模方法較為接近臨床腸源性膿毒癥的發(fā)病機(jī)制。而且，該造模方法可顯著降低進(jìn)行膿毒癥動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究的成本。
[1] Angus DC,Linde-ZwirbleWT,LidickerJ,etal.Epidemiology of se-ve re sepsis in the United States:analysis of incidence,outcome,and associated costs of care [J].Crit Care Med,2001,29(7):1303.
[2] 湯耀卿,李磊.膿毒癥動(dòng)物模型制作方略及應(yīng)用[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2006,23(12):1433-1434.
[3] Levy MM, Fink MP, Marshall JC. 2001 SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS International Sepsis Definitions Conference [J].Intensive Care Med,2003,29:530-538.
[4] Annane D, Aegerter P, Guidet B. Current epidemiology of sept ic shock: the CUB-Rea Network [J]. Am J Respir Crit Care Med,2003,168:165-172.
[5] 姜良鐸,焦揚(yáng),王蕾.從毒論理,從通論治,以調(diào)求平[J].中醫(yī)雜志,2006,47(3):169-171.
[6] 劉清泉.對(duì)膿毒癥中醫(yī)病機(jī)特點(diǎn)及治法的認(rèn)識(shí)[J].北京中醫(yī),2007,26(4):198-200.
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（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 110033）
膿毒癥（sepsis）是指由感染因素所致的全身炎癥反應(yīng)綜合征。該病是導(dǎo)致在重癥監(jiān)護(hù)病房接受治療的非心臟病患者死亡的主要原因，其致死率高達(dá)28%～47%[1]。膿毒癥動(dòng)物模型是臨床上對(duì)膿毒癥的發(fā)病機(jī)制和防治方法進(jìn)行研究所必須的實(shí)驗(yàn)品，也是膿毒癥研究的難點(diǎn)所在。盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（cecal ligation perforation，CLP）是臨床上制備膿毒癥動(dòng)物模型的金標(biāo)準(zhǔn)。但是，用CLP制備的膿毒癥動(dòng)物模型不能完全復(fù)制臨床膿毒癥。由于膿毒癥患者最常見(jiàn)的感染源來(lái)自腹腔，故近年來(lái)，臨床上逐漸嘗試將腹腔感染模型作為常用的膿毒癥動(dòng)物模型[2]。目前，建立與臨床腸源性膿毒癥的發(fā)病機(jī)制較為接近的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵殉蔀獒t(yī)學(xué)界研究的新熱點(diǎn)。在本次研究中，筆者采用向模型大鼠的腹腔內(nèi)注射大鼠糞便勻漿的方法建立腸源性膿毒癥大鼠模型，以期為膿毒癥的研究提供新的參考依據(jù)。
1 儀器與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑
1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 XW-80A微型渦旋混合儀（由上海滬西分析儀器廠有限公司生產(chǎn)）、AS3120A超聲提取器（由天津奧特賽恩斯儀器有限公司生產(chǎn)）、TGL-16C高速離心機(jī)（由上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)）、Sartorious CP 225D型精密天平（由北京塞多斯儀器系統(tǒng)有限公司生產(chǎn)）、eppendorf可調(diào)式移液器（由德國(guó)艾本德公司生產(chǎn)）、DCY-24G型氮吹儀（由青島?？苾x器有限公司生產(chǎn)）、ACO-328型電磁式空氣壓縮機(jī)（由廣東海利集團(tuán)有限公司生產(chǎn)）、FJ-200高速分散均質(zhì)機(jī)（由上海標(biāo)本模型廠生產(chǎn)）。
1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 濃度為95%的乙醇、無(wú)水乙醇、脂多糖（LPS）試劑。
1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
從遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司購(gòu)入60只SD大鼠，其合格證號(hào)為SCXK（遼）2015-0001。這60只大鼠均為雌性、SPF級(jí)大鼠，其體重為180～220 g。
1.3 實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1 對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行分組 將這60只SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)表法分為6組，分別為模型組1、模型組2、模型組3、模型組4、模型組5和空白組，每組各有10只大鼠。對(duì)這6組大鼠依次進(jìn)行稱(chēng)重和編號(hào)。
1.3.2 進(jìn)行內(nèi)毒素血癥大鼠模型的復(fù)制 1）進(jìn)行糞便勻漿上清液的制備。對(duì)這60只SD大鼠進(jìn)行1周的適應(yīng)性飼養(yǎng)后，收集其新鮮成形的糞便。對(duì)大鼠糞便進(jìn)行稱(chēng)量后，向其中加入適量的生理鹽水，然后將該混合物置于勻漿機(jī)中進(jìn)行充分的研磨，制備成濃度為10%的大鼠糞便勻漿。按3000 轉(zhuǎn)/min的轉(zhuǎn)速對(duì)大鼠糞便勻漿進(jìn)行5 min的離心處理，得到上清液，然后用注射器吸取適量的上清液備用。2）進(jìn)行大鼠模型的制備。在進(jìn)行造模前，使1～5組模型組大鼠禁食12 h，然后按1 ml/200 g的劑量向其腹腔內(nèi)注射濃度為10%的大鼠糞便勻漿上清液。在注射完成后，觀察這5組大鼠的體征及表現(xiàn)。這5組大鼠若出現(xiàn)蜷縮、少動(dòng)、精神萎靡、毛發(fā)不榮、寒顫、鼻周有明顯血痕等體征，則表示造模成功。將造模成功的大鼠作為本次的研究對(duì)象。
1.3.3 進(jìn)行血液標(biāo)本的采集 在5組模型組大鼠造模成功10 h后，從這5組模型組大鼠和空白組大鼠的眼眶靜脈叢各采集0.5 ml的血液，將其血液標(biāo)本放入肝素化的Ep管中，按5000 r/min的轉(zhuǎn)速對(duì)其血液標(biāo)本進(jìn)行10 min的離心處理，得到上清液，然后將上清液放置在-80℃的環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.4 進(jìn)行血液標(biāo)本的處理 精密吸取6組大鼠150 μl的血液，將其血液標(biāo)本置于容積為2 ml的離心管中，依次向離心管內(nèi)加入10 μl的內(nèi)標(biāo)液異補(bǔ)骨脂素、600 μl的甲醇，然后進(jìn)行2 min的渦旋，使管內(nèi)容物充分地混勻。按5000 r/min的轉(zhuǎn)速對(duì)離心管內(nèi)的混合液進(jìn)行10 min的離心處理，得到上清液，然后用40 ℃的空氣流吹干上清液，得到上清液殘?jiān)?。向上清液殘?jiān)屑尤?00 μl的甲醇進(jìn)行復(fù)溶，對(duì)復(fù)溶物進(jìn)行1 min的超聲處理、2 min的渦旋，然后用型號(hào)為0.45 μm的微孔濾膜對(duì)復(fù)溶物進(jìn)行濾過(guò)。
1.3.5 進(jìn)行血液樣本的采集和血清LPS水平的測(cè)定 在造模完成48 h后，用乙醚對(duì)6組大鼠進(jìn)行麻醉，用無(wú)熱原的針筒心尖采集其200 μl的血液。向這6組大鼠的血液標(biāo)本中加入200 μl的抗凝劑，充分混勻后，將其血液標(biāo)本置于冰水中，進(jìn)行5 min的低溫離心處理（轉(zhuǎn)速為3000 r/min），得到上清液。將大鼠的血液上清液制備成2倍濃度的稀釋液，取 0.1 ml的該稀釋液，向其中加入0.4 ml的樣本處理液后混勻，制成10倍的稀釋液。將該稀釋液放入70 ℃的水浴箱中加熱10 min后取出，再將其放入冰水中進(jìn)行冷卻。取無(wú)熱原試管，向其中加入0.1 ml的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水、0.1 ml的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液、0.1 ml的血漿供試品、0.1 ml的鱟試劑溶液，將上述液體混勻后放入37 ℃的水浴箱中溫育10 min。在溫育結(jié)束后，向上述的混合液中加入0.1 ml的顯色基質(zhì)，混勻，對(duì)該混合液再次進(jìn)行6 min的溫育，然后向該混合液中依次加入偶氮化試劑1、偶氮化試劑2和偶氮化試劑3（各加入0.5 ml），待混勻后靜置5 min，在λ 545 nm處測(cè)定該混合液的吸光度值。上述實(shí)驗(yàn)中所使用的試管、吸頭和保存管均為無(wú)熱原耗材。
1.3.6 進(jìn)行血清TNF-α 和IL-6水平的測(cè)定 從這6組大鼠的血液標(biāo)本中取40 μl的血液，向其中依次加入10 μl生物素標(biāo)記的二抗、50 μl的酶標(biāo)試劑，在37℃的環(huán)境下反應(yīng)60 min，并洗板5次，再依次向其中加入顯色液A、顯色液B，在37 ℃的環(huán)境下顯色15 min，然后向其中加入終止液，在加入后的10 min內(nèi)測(cè)定其OD值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程計(jì)算對(duì)應(yīng)樣品的濃度。
1.3.7 進(jìn)行臟器組織的病理觀察 迅速對(duì)這6組大鼠進(jìn)行解剖，取其心、肝、脾、肺、腎組織，用生理鹽水對(duì)這些臟器組織進(jìn)行漂洗后，置入濃度為10%的福爾馬林溶液中進(jìn)行固定。對(duì)這6組大鼠的臟器組織進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色，在光鏡下觀察各臟器組織的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，描述各臟器組織的病理變化情況。從這60只大鼠的心、肝、脾、肺、腎組織中各切去約1 cm3的組織塊進(jìn)行脫水，然后用石蠟進(jìn)行包埋。將這些組織塊切成厚度為5 μm的組織切片，對(duì)這些組織切片進(jìn)行脫蠟，用蘇木素-伊紅（HE）對(duì)其進(jìn)行常規(guī)染色，用中性樹(shù)膠對(duì)其進(jìn)行封片，然后在顯微鏡下對(duì)其進(jìn)行觀察。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
應(yīng)用SPFF20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)本次研究中的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 5組模型組大鼠在造模完成后的臨床體征及表現(xiàn)
在向模型組5組大鼠的腹腔內(nèi)注射完濃度為10%的大鼠糞便勻漿后，有80%的大鼠出現(xiàn)喜歡聚集成堆、行動(dòng)能力下降、失去攀爬行為、輕微眼迷離、大便溏稀、對(duì)聲音的敏感度減退、不自主寒顫等表現(xiàn)。在注射完成6 h后，這5組大鼠僅在短時(shí)間內(nèi)分散開(kāi)，仍沒(méi)有運(yùn)動(dòng)行為，其精神萎靡、眼內(nèi)分泌物增加、毛發(fā)豎起且沒(méi)有光澤、呼吸加深加快、不自主寒顫加重，嚴(yán)重者甚至出現(xiàn)死亡。這5組大鼠的死亡高峰期主要集中在注射糞便勻漿后的12～48 h之間，在注射完3 d后其不再死亡。在這5組大鼠中，有30%的大鼠在注射完糞便勻漿的數(shù)小時(shí)后死亡。
2.2 5組模型組大鼠與空白組大鼠血清LPS水平的對(duì)比
與空白組大鼠相比，5組模型組大鼠血清LPS的水平均較高，P＜0.01。
2.3 5組模型組大鼠與空白組大鼠血清IL-6和TNF-α水平的對(duì)比
在注射大鼠糞便勻漿后，5組模型組大鼠血清IL-6和TNF-α的水平迅速升高，且在注射后的6 h達(dá)到高峰，在注射后的48 h逐漸降低至正常水平。與空白組大鼠相比，5組模型組大鼠血清IL-6和TNF-α的水平較高，P＜0.05。詳見(jiàn)表2。
表1 5組模型組大鼠與空白組大鼠血清LPS水平的對(duì)比（EU/ml， ）
表1 5組模型組大鼠與空白組大鼠血清LPS水平的對(duì)比（EU/ml， ）
組別（n=10） LPS水平模型組1 2.15±0.08模型組2 2.36±0.04模型組3 2.45±0.03模型組4 2.19±0.04模型組5 2.28±0.03空白組 0
表2 5組模型組大鼠與空白組大鼠血清IL-6和TNF-α水平的對(duì)比 （ ng/ml， ）
表2 5組模型組大鼠與空白組大鼠血清IL-6和TNF-α水平的對(duì)比 （ ng/ml， ）
組別（n=10） 時(shí)間 IL-6 TNF-α模型組5 注射48 h后 203.8±4.52 101.53±2.30模型組4 注射24 h后 280.6±8.44 151.76±2.42模型組3 注射12 h后 244.4±6.26 130.24±1.49模型組2 注射6 h后 338.4±8.33 181.18±3.24模型組1 注射2 h后 463.8±7.42 279.88±1.69空白組 154.6±7.13 69.65±6.98
2.4 5組模型組大鼠與空白組大鼠臟器組織病理切片的對(duì)比
對(duì)6組大鼠心、肝、脾、肺、腎的病理切片進(jìn)行對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，5組模型組大鼠的脾臟受損的程度均較輕，但其心、肝、肺、腎中均發(fā)現(xiàn)大量的炎性浸潤(rùn)，其心、肝、肺、腎受損均較為明顯。詳見(jiàn)圖1。
圖1 5組模型組大鼠與空白組大鼠臟器組織病理切片的對(duì)比
3 討論
膿毒癥是指血液中的細(xì)菌或病灶將大量的LPS釋放入血液，使血液中LPS的水平超過(guò)機(jī)體所能承受的上限所引發(fā)的一系列病理反應(yīng)[3-4]。發(fā)生燒傷、腸道菌群異位、大面積的嚴(yán)重感染、遭受外傷等均可導(dǎo)致膿毒癥發(fā)生。近年來(lái)，醫(yī)學(xué)界對(duì)膿毒癥的研究日益廣泛。因此，在進(jìn)行膿毒癥的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)選擇合適的造模方法，復(fù)制與臨床上膿毒癥的發(fā)病機(jī)制更為相似的病理模型顯得尤為重要[5-6]。
在本次研究中，筆者通過(guò)向5組SD大鼠的腹腔內(nèi)注射濃度為10%的大鼠糞便勻漿，使其發(fā)生腹膜感染，從而引發(fā)腸道菌群紊亂、異位、內(nèi)毒素釋放入其血液，進(jìn)而使其出現(xiàn)膿毒癥的病理狀態(tài)。在5組大鼠造模完成48 h后，其血清LPS的水平、血清TNF-α和IL-6的水平均明顯高于空白組大鼠。對(duì)這5組模型組大鼠臟器的病理切片進(jìn)行分析的結(jié)果顯示，其心、肝、肺、腎均受到大量炎性因子的浸潤(rùn)，并出現(xiàn)了明顯的損傷。由此可見(jiàn)，本研究中所使用的造模方法較為接近臨床腸源性膿毒癥的發(fā)病機(jī)制。而且，該造模方法可顯著降低進(jìn)行膿毒癥動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究的成本。
[1] Angus DC,Linde-ZwirbleWT,LidickerJ,etal.Epidemiology of se-ve re sepsis in the United States:analysis of incidence,outcome,and associated costs of care [J].Crit Care Med,2001,29(7):1303.
[2] 湯耀卿,李磊.膿毒癥動(dòng)物模型制作方略及應(yīng)用[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2006,23(12):1433-1434.
[3] Levy MM, Fink MP, Marshall JC. 2001 SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS International Sepsis Definitions Conference [J].Intensive Care Med,2003,29:530-538.
[4] Annane D, Aegerter P, Guidet B. Current epidemiology of sept ic shock: the CUB-Rea Network [J]. Am J Respir Crit Care Med,2003,168:165-172.
[5] 姜良鐸,焦揚(yáng),王蕾.從毒論理,從通論治,以調(diào)求平[J].中醫(yī)雜志,2006,47(3):169-171.
[6] 劉清泉.對(duì)膿毒癥中醫(yī)病機(jī)特點(diǎn)及治法的認(rèn)識(shí)[J].北京中醫(yī),2007,26(4):198-200.
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