比伐蘆定對ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化的影響

孔令東 王 耿

（1 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院，遼寧 沈陽 110032；2 沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 心血管內(nèi)科，遼寧 沈陽 110016）

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病 (coronary atherosclerotic heart disease，CHD），簡稱冠心病，以冠狀動脈粥樣硬化為主要病機，由于動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS），斑塊形成，管腔面積變小，血流量減少，致心肌缺血缺氧而引起患者胸悶、胸痛等典型心絞痛癥狀[1]。冠心病心絞痛與中醫(yī)學(xué)中“胸痹”“真心痛”“厥心痛”等疾病在臨床表現(xiàn)上相類似。目前西醫(yī)學(xué)中針對冠心病的治療，分為抗血小板聚集，抑制炎癥，延緩血管內(nèi)皮遭破壞；控制血脂，防止冠狀動脈斑塊形成及破裂。而中醫(yī)主要以活血化瘀治療。中藥水蛭具有破血通經(jīng)，逐瘀消癥的功效，而發(fā)揮作用的主要為其提取物水蛭素，其具有很強的抗凝作用，同時具有一定的降血脂作用。比伐蘆定是合成的水蛭素的衍生物片段，是新型直接凝血酶抑制劑，具有很強的抗凝作用，本研究根據(jù)AS“活血化瘀”的治療理論，觀察比伐蘆定對ApoE-/-小鼠AS的作用。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF級ApoE-/-小鼠20只，同齡具有相同遺傳背景的C57BL/6J小鼠10只，體質(zhì)量18～22 g，8周齡，全部小鼠從北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司購買，許可證號：SCXK（京）2012-0001，雌雄各半。飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物中心，自由攝食與飲水，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（22±2） ℃，相對濕度40%～45%。

1.2 藥材、試劑與儀器 TNF-α、IL-6 Elisa試劑盒購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司；血脂檢測試劑盒從四川邁克生物科技有限公司購買；引物由大連Takara公司設(shè)計合成；RIZOL試劑購于大連Takara公司；氯仿購于上?；瘜W(xué)試劑有限公司；異丙醇購于上?；瘜W(xué)試劑有限公司。酶標儀（美國，Thermo），電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海，天能），7500 Real Time PCR儀（美國，Applied Biosystems）。

2 方法

2.1 動物分組及處理 選擇10只C57BL/6J小鼠作為空白對照組，給予普通小鼠維持飼料喂養(yǎng)，將20只ApoE-/-小鼠隨機分為模型組和治療組，每組10只，給予高脂飼料喂養(yǎng)進行模型復(fù)制，飼養(yǎng)12周。于第9周開始，治療組給予比伐蘆定0.25 mg/kg靜脈注射，每2日1次，正常組和模型組給予等體積生理鹽水靜脈注射。于12周末禁食、水24 h后，分離血清、腹主動脈至胸主動脈，分別保存于-80℃超低溫冰箱。

2.2 檢測指標及方法

2.2.1 血清膽固醇水平檢測 采用全自動生化分析儀檢測3組小鼠血清中膽固醇（TC）、三酰甘油 （TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）及高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）。

2.2.2 血清TNF-α、IL-6水平檢測 采用Elisa法檢測各組小鼠血清腫瘤壞死因子（TNF-α）、白介素6（IL-6）水平，具體操作步驟遵照試劑盒說明書進行。

2.2.3 主動脈血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、金屬蛋白酶-9（MMP-9）、缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）mRNA表達水平檢測 采用RT-PCR法檢測各組小鼠主動脈相關(guān)基因mRNA表達水平，取100 mg主動脈組織置于研缽中，加入液氮研磨后進行水相分離，加入1 mL Trizol，轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，加入氯仿0.2 mL，離心后吸取上層水相，加入等量異丙醇混合沉淀RNA，離心，緩慢加入75%乙醇洗滌，離心，空氣風(fēng)干后加入無RNA酶水溶解。紫外吸收測定法，測得260 nm和280 nm OD值，計算RNA濃度和純度。逆轉(zhuǎn)錄成cDNA模板，采用SYBR Green進行實時熒光PCR（基因及引物序列見表1），反應(yīng)參數(shù)為95℃ 30 s，1個循環(huán)；95℃ 5 s，55℃ 10 s，40個循環(huán)反應(yīng)。實驗重復(fù)3次，采用ΔΔCt方法進行數(shù)據(jù)分析。

表1 引物序列表

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)均為計量資料，用 （x±s）表示，采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，組間比較首先進行單因素方差齊性分析，若方差齊，組間比較采用LSD法檢驗，若方差不齊，組間比較采用Tamhane法檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 3組小鼠血脂水平比較 血脂水平檢測結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組小鼠血清TC、TG、LDL-C水平顯著升高（P<0.01），HDL-C水平顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，治療組TC、TG、LDL-C水平顯著降低（P<0.01），HDL-C水平顯著升高 （P<0.01）。見表2。

表2 3組小鼠血脂水平比較 （x±s，mmol/L）

3.2 3組小鼠血清TNF-α、IL-6水平比較 血清Elisa檢測結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組TNF-α、IL-6水平顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，各治療組TNF-α、IL-6水平顯著降低（P<0.01）。見表3。

表3 3組小鼠血清TNF-α、IL-6水平比較 （x±s，pg/mL）

3.3 3組小鼠主動脈VEGF、MMP-9、HIF-1αmRNA表達水平比較 RT-PCR檢測主動脈VEGF、MMP-9、HIF-1αmRNA表達結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組小鼠主動脈VEGF、MMP-9、HIF1-αmRNA表達水平顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，治療組小鼠主動脈VEGF、MMP-9、HIF1-αmRNA表達水平明顯降低（P<0.01）。見圖1

圖1 主動脈VEGF、MMP-9、HIF-1αmRNA表達水平

4 討論

“胸痹”“心痛”為我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中記載的病名，《金匱要略》論述其主要病機為“陽微陰弦”，陽是指主管人體精液運行的功能，陰指有形之精血津液，陽微即人體陽氣不足，推動運化能力不足，導(dǎo)致氣機運行不暢，痰濁瘀血等有形之物積滯于胸中，反過來影響氣機的運行，氣機不通，則引起疼痛，中醫(yī)學(xué)記載的這一過程與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中動脈粥樣硬化斑塊的形成機制相類似。中醫(yī)學(xué)中治療胸痹多以活血化瘀通絡(luò)法為主，活血即應(yīng)用具有行氣活血作用的中藥，使血液運行調(diào)和，改善血液流通緩慢的狀態(tài)，瘀多是由痰濁瘀血沉積在血脈內(nèi)，引起脈道不利，化瘀即將附著于脈道內(nèi)的濁邪消除，使脈道通暢。絡(luò)即絡(luò)脈，是附著于血脈的小血管，微循環(huán)，絡(luò)脈不通，亦會阻滯氣機，從而影響周身氣血運行，通絡(luò)使絡(luò)脈暢達，血液循環(huán)無端。總之，活血化瘀通絡(luò)能夠使氣機通暢，脈道通利，血液循環(huán)正常，從西醫(yī)角度來看，活血化瘀通絡(luò)之法能夠擴張冠脈，抗血小板聚集，抗凝，防止動脈硬化，穩(wěn)定斑塊，從而改善血液流變，降低高黏附狀態(tài)，改善心肌供氧，進而改善心功能。

中藥水蛭具有破血通經(jīng)，逐瘀消癥的作用，破血之力較活血之力更強，通經(jīng)即通暢經(jīng)絡(luò)，逐瘀與化瘀相類似，消癥即消除瘀積于體內(nèi)的毒邪，整體上也兼具活血化瘀通絡(luò)之功效。現(xiàn)代藥理學(xué)表明[2]，水蛭的主要有效提取物為水蛭素，能夠延長纖維蛋白凝聚時間，且抑制血小板聚集，改善血液流變學(xué)，降低血脂，消退動脈斑塊，增加心肌血流量，對大鼠實驗表明，能夠抑制大鼠體內(nèi)血栓形成。

天然水蛭素含量極少，目前通過人工化學(xué)方法制備水蛭素衍生物片段，將其命名為比伐蘆定，它是一種由20個氨基酸所構(gòu)成的直接凝血酶抑制劑，相對分子量為2180Da，可直接限制纖維蛋白及凝血酶的形成[3]，其抗凝特性具有直接、特異、短暫、可逆地與凝血酶進行結(jié)合的特點[4-5]，作為水蛭素的替代品應(yīng)用于臨床。

AS與血脂代謝異常和炎癥反應(yīng)相關(guān)，血脂是動脈斑塊形成的基礎(chǔ)，炎癥是誘發(fā)斑塊不穩(wěn)定的重要因素[6]，TC、TG、LDL-C是反映生物體內(nèi)脂質(zhì)含量的敏感物質(zhì)，能夠預(yù)測AS風(fēng)險。HDL-C具有抗氧化、抗炎等作用，其含量越高，冠心病發(fā)生風(fēng)險越低，對冠心病發(fā)病有一定預(yù)測作用[7-8]。TNF-α、IL-6是生物體炎癥反應(yīng)的重要指標[9]，AS也存在炎癥反應(yīng)過程。血管內(nèi)皮缺氧，易加重脂質(zhì)氧化，導(dǎo)致蛋白質(zhì)和核酸變性，從而進一步加重AS進程[10]。缺氧狀態(tài)下，HIF-1α由巨噬細胞等合成，具有促進血管新生的功能，促進AS斑塊內(nèi)炎癥浸潤和平滑肌細胞增殖、遷移，亦能夠促進巨噬細胞泡沫化[11-13]。VEGF是一種能夠特異性地作用于血管內(nèi)皮的多功能細胞因子，能夠促進AS斑塊中血管新生，同時通過改變血管滲透性而引起血管壁水腫，也會加重AS[14]。MMP-9參與AS斑塊的形成到破裂的全過程，能夠降解細胞外基質(zhì)的各種蛋白成分，誘發(fā)斑塊破裂，形成急性血栓[15]。因此，本研究將TC、TG、LDL-C、HDL-C、TNF-α、IL-6水平作為研究指標，通過檢測VEGF、MMP-9、HIF-1αmRNA表達水平，能夠很好地反映比伐蘆定對ApoE-/-小鼠AS的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，比伐蘆定能夠有效改善ApoE-/-小鼠AS血脂水平，與空白對照組比較，模型組小鼠血清TC、TG、LDL-C水平顯著升高（P<0.01），HDL-C水平顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，治療組TC、TG、LDL-C水平顯著降低（P<0.01），HDL-C水平顯著升高（P<0.01）。比伐蘆定能夠有效改善血清炎癥因子水平，與空白對照組比較，模型組TNF-α、IL-6水平顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，各治療組TNF-α、IL-6水平顯著降低（P<0.01）。RT-PCR檢測主動脈VEGF、MMP-9、HIF-1αmRNA表達結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組小鼠主動脈VEGF、MMP-9、HIF1-αmRNA表達水平顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，治療組小鼠主動脈VEGF、MMP-9、HIF1-αmRNA表達水平明顯降低 （P<0.01）。

綜上所述，本研究認為比伐蘆定能夠通過改善血脂水平，血清炎癥因子水平及血管新生等方面發(fā)揮抗AS作用。

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