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    納米銀對水體中硝化細(xì)菌活性的影響

    2018-06-27 07:54:00陳姝穎李海毅李昭陽
    關(guān)鍵詞:納米銀抑制率顆粒物

    陳姝穎,李海毅,李昭陽

    (吉林大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院,吉林 長春 130012)

    隨著納米技術(shù)的快速發(fā)展,納米材料已廣泛應(yīng)用到工業(yè)、農(nóng)業(yè)和畜牧養(yǎng)殖業(yè)等領(lǐng)域,進(jìn)入環(huán)境中的納米材料逐年增加,同時(shí)也不可避免地進(jìn)入到水體中,[1]特別是銀納米粒子,一種常用的抗菌性納米粒子.在眾多抗菌材料中,無機(jī)含銀納米抗菌材料具有較廣的抗菌范圍,殺菌能力很強(qiáng)并且對環(huán)境的毒性效應(yīng)較低,是目前使用范圍最大的抗菌材料之一[2].然而隨著納米銀的大量使用,其在環(huán)境中的影響和作用機(jī)制也引起了學(xué)者的廣泛關(guān)注[3-5].

    以往,研究人員對納米銀(AgNPs)進(jìn)行了許多的體外毒性實(shí)驗(yàn)及其毒性作用機(jī)制的探討.有研究[6-7]表明,納米銀包被材料的種類和直徑大小可能對其毒害效果產(chǎn)生影響;針對不一樣的細(xì)胞類型,例如對放線菌、細(xì)菌、真菌,其毒害效果也有所差異.B?hmert等[8]發(fā)現(xiàn)納米銀會(huì)產(chǎn)生活性氧和超氧陰離子,這些活性物質(zhì)可以氧化細(xì)胞膜和脂質(zhì)導(dǎo)致生物體細(xì)胞的受損和死亡.納米銀的毒性作用與納米顆粒的粒徑大小有關(guān),Choi等[9]發(fā)現(xiàn)納米銀的粒徑小于5 nm 時(shí)對細(xì)菌的毒性最強(qiáng).硝化細(xì)菌在自然環(huán)境的氮循環(huán)中發(fā)揮著重要作用,而在水生態(tài)系統(tǒng)中由于納米銀的進(jìn)入對硝化細(xì)菌產(chǎn)生的影響情況還知之甚少,所以本文研究了在不同AgNPs濃度、pH和天然有機(jī)質(zhì)的條件下,納米銀對水體中硝化細(xì)菌的影響,以為水環(huán)境中納米銀的毒性效應(yīng)研究提供一定的理論依據(jù).

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    納米銀(AgNPs,1 mg/mL,粒徑≤15 nm)購自廣州艾普納米科技有限公司;硝化細(xì)菌購自中國普通微生物菌種保藏管理中心.實(shí)驗(yàn)用水為實(shí)驗(yàn)室配水,供試水體的基本性質(zhì)見表1.

    表1 供試水體基本性質(zhì)

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    將細(xì)菌樣品分散到配制的供試水體中,混勻后逐級稀釋至適當(dāng)倍數(shù).取100 μL稀釋液涂布于斯蒂芬遜培養(yǎng)基平板上,恒溫(25℃)恒濕培養(yǎng),通過菌落數(shù)和稀釋倍數(shù)計(jì)算出實(shí)際菌量.所有實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行,每個(gè)平行2次重復(fù).

    抑菌率(%)=100×(空白對照組菌量-處理組菌量)/空白對照組菌量.

    1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

    實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和圖表制作采用 IBM SPSS Statistics 19,Microsoft Office Excel 2010和OriginPro8.SR3軟件.

    2 結(jié)果與討論

    2.1 不同質(zhì)量濃度的納米銀對硝化細(xì)菌活性的影響

    將一定量硝化細(xì)菌加入到AgNPs質(zhì)量濃度分別為0,5,10,15和20 μg/mL的1 mL水體中,混勻后分別取出100 μL在培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為25℃,pH=7.2.在培養(yǎng)的第0,2,4,6,8和10天分別計(jì)數(shù).AgNPs對硝化細(xì)菌活性的影響結(jié)果見圖1.

    由圖1可見,整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間未添加AgNPs水體的空白對照組硝化細(xì)菌的數(shù)量均高于添加組,且差異均顯著;AgNPs質(zhì)量濃度為0和5 μg/mL的兩個(gè)處理組隨著處理時(shí)間的增加硝化細(xì)菌的數(shù)量先增加后降低,這是由于土壤中一開始有可供應(yīng)硝化細(xì)菌生長繁殖的營養(yǎng)物質(zhì),隨著硝化細(xì)菌的增加,營養(yǎng)物質(zhì)減少,細(xì)菌產(chǎn)生了競爭和饑餓導(dǎo)致數(shù)量減少.AgNPs質(zhì)量濃度為10,15,20 μg/mL的3個(gè)處理組,硝化細(xì)菌的數(shù)量呈先下降、后上升、再下降的變化趨勢,產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是由于最初AgNPs的質(zhì)量濃度較高,對硝化細(xì)菌的毒性較大,進(jìn)而導(dǎo)致硝化細(xì)菌死亡;隨后硝化細(xì)菌產(chǎn)生抗性并進(jìn)行繁殖,數(shù)量有所回升;而后期營養(yǎng)物質(zhì)減少又導(dǎo)致數(shù)量再次下降.由此可知,AgNPs對硝化細(xì)菌有一定的抑制作用.AgNPs與生物分子相似而且粒徑細(xì)小,很容易被生物攝入細(xì)胞內(nèi),破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu),擾亂細(xì)胞的正常代謝循環(huán);同時(shí),也可以溶解出相應(yīng)的金屬離子,造成一定的毒性.AgNPs對硝化細(xì)菌活性的抑制情況見圖2.

    圖1 不同濃度AgNPs對硝化細(xì)菌的影響

    由圖2可見,硝化細(xì)菌的抑制率隨添加的AgNPs質(zhì)量濃度的增加而增大.AgNPs質(zhì)量濃度為20 μg/mL時(shí),在第2天硝化細(xì)菌的抑制率就達(dá)到了95%,在第10天達(dá)到了98%;AgNPs為5 μg/mL時(shí),硝化細(xì)菌的抑制率在第4天才達(dá)到最大,為32.74%.所以高濃度和低濃度的AgNPs都會(huì)對硝化細(xì)菌造成一定的抑制作用.從圖2還可以看出,AgNPs質(zhì)量濃度為15和20 μg/mL時(shí)抑制率先增加然后逐漸達(dá)到平穩(wěn),說明硝化細(xì)菌對高濃度的AgNPs抵制能力較弱,進(jìn)而很快受了抑制;而在AgNPs質(zhì)量濃度為5和10 μg/mL時(shí),硝化細(xì)菌的抑制率都是先增加后降低然后再增加,說明低濃度的AgNPs,對硝化細(xì)菌一開始有一定的抑制作用,但隨著時(shí)間增加硝化細(xì)菌產(chǎn)生了抗性,進(jìn)而繼續(xù)生長繁殖數(shù)量增多,到后期在AgNPs和營養(yǎng)物質(zhì)減少的雙重作用下,細(xì)菌數(shù)量再一次降低,進(jìn)而導(dǎo)致抑制率又上升.謝小保等[10]研究了納米銀粒子對大腸桿菌細(xì)胞的影響機(jī)制發(fā)現(xiàn),納米銀粒子通過破壞細(xì)胞壁產(chǎn)生孔洞后進(jìn)入周質(zhì)空間,導(dǎo)致細(xì)胞膜成分滲漏,在破壞細(xì)胞膜的同時(shí)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部,對細(xì)胞造成損傷;Kim等[11]研究了納米銀對白色念珠菌的作用,也發(fā)現(xiàn)了納米銀會(huì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部并對細(xì)胞內(nèi)的DNA和細(xì)胞質(zhì)造成傷害,導(dǎo)致細(xì)菌最終死亡.還有學(xué)者[12]研究了納米銀對大腸桿菌的影響,發(fā)現(xiàn)納米銀濃度會(huì)影響大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)脫氫酶的活性,并且隨著納米銀濃度的增高而降低.Abbasi等[13]的研究表明,納米銀產(chǎn)生的活性氧既可以直接對細(xì)菌產(chǎn)生強(qiáng)氧化作用使細(xì)胞死亡,同時(shí)活性氧還可以對呼吸酶產(chǎn)生一定的抑制作用,間接導(dǎo)致細(xì)菌死亡.

    2.2 納米銀對不同pH水體硝化細(xì)菌活性的影響

    水體的pH是影響水體中微生物活動(dòng)的重要理化性質(zhì)之一,pH過高或過低都會(huì)對微生物的活性產(chǎn)生影響.而pH對AgNPs的環(huán)境行為也有一定的影響.將細(xì)菌分別加入到pH為3,5,7,9和11的AgNPs質(zhì)量濃度均為10 μg/mL的水樣中,混勻后取出100 μL進(jìn)行培養(yǎng).培養(yǎng)溫度為25℃.在培養(yǎng)的第0,2,4,6,8和10天分別進(jìn)行計(jì)數(shù),結(jié)果見圖3.不添加AgNPs時(shí),pH對硝化細(xì)菌也有一定的抑制作用,抑制情況如圖4所示.

    圖3 AgNPs對不同pH水體硝化細(xì)菌活性的抑制率

    由圖3可見,低pH值條件下AgNPs對硝化細(xì)菌的抑制率較強(qiáng),而在高pH值條件下AgNPs對硝化細(xì)菌的抑制率有所減弱.在pH=3和pH=5時(shí),抑制率在第6天達(dá)到最大,分別為96.97%和93.86%;而pH=11時(shí),抑制率先上升再降低,在第6天達(dá)到最大為60.48%,而在第10天降到54.83%.由圖4可見,不同的pH對硝化細(xì)菌也有一定的影響.當(dāng)pH=7時(shí),對硝化細(xì)菌先有一定的抑制作用,而隨著時(shí)間的增加對硝化細(xì)菌的生長繁殖有一定的促進(jìn)作用,但變化波動(dòng)范圍不大,在0.05%左右波動(dòng);而其他pH條件對硝化細(xì)菌也有一定的抑制作用,但是抑制率均在10%以內(nèi),pH=3時(shí),抑制率在第2天為7.84%,之后趨于平緩.所以綜上可以看出抑制硝化細(xì)菌的主要因素不是pH.

    有研究[14]表明,低pH值條件下金屬納米顆粒易于金屬離子釋放,而高pH值條件則容易發(fā)生團(tuán)聚.在pH值較低時(shí),AgNPs釋放大量的Ag+,較高濃度的Ag+會(huì)與細(xì)菌相互作用,對硝化細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生毒性和脅迫導(dǎo)致細(xì)胞破裂和死亡,而Ag+和AgNPs的復(fù)合作用導(dǎo)致對細(xì)菌的毒性加強(qiáng);pH值較高時(shí),由于AgNPs發(fā)生團(tuán)聚,降低了AgNPs與細(xì)菌接觸的概率,毒性作用減弱,從而導(dǎo)致硝化細(xì)菌抑制率降低.

    圖5 水中添加腐殖酸AgNPs對硝化細(xì)菌活性的抑制率

    2.3 納米銀對腐殖酸水體中硝化細(xì)菌活性的影響

    天然有機(jī)質(zhì)是水體和土壤環(huán)境中植物或微生物殘骸經(jīng)過一定的生物過程而廣泛存在的一類復(fù)雜的有機(jī)物質(zhì)[15].有研究表明,自然環(huán)境中存在的天然有機(jī)質(zhì)會(huì)影響納米顆粒物在環(huán)境中的行為[16].在pH=7.2,AgNPs質(zhì)量濃度為10 μg/mL條件下,細(xì)菌培養(yǎng)溫度為25℃時(shí),本實(shí)驗(yàn)研究了腐殖酸的存在是否影響AgNPs對水體硝化細(xì)菌的抑制作用,結(jié)果見圖5.體系中腐殖酸的濃度固定為50 mmol/L(以C計(jì)).

    由圖5可見,水體中添加腐殖酸明顯降低了AgNPs對硝化細(xì)菌的抑制作用,隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加硝化細(xì)菌的抑制率先增加,在第4天抑制率達(dá)到最高,為13.38%;隨后抑制率降低,第10天的抑制率僅為6.35%.由此可以看出,環(huán)境中廣泛存在的天然有機(jī)質(zhì)腐殖酸能夠影響納米顆粒物對水體中微生物的毒害作用.有研究[17]表明,納米顆粒物的表面電荷會(huì)受到天然有機(jī)質(zhì)的影響,天然有機(jī)質(zhì)可以增強(qiáng)納米顆粒物膠體的熱穩(wěn)定性以及提供靜電斥力和空間位阻穩(wěn)定納米顆粒物膠體,從而可以使納米顆粒物在水體環(huán)境中產(chǎn)生的團(tuán)聚現(xiàn)象趨于穩(wěn)定,并且降低納米顆粒物對水體中生物的毒性.還有研究[18]發(fā)現(xiàn),納米顆粒物的表面包被了天然有機(jī)質(zhì),在水環(huán)境中減少了納米顆粒和生物的接觸概率,相應(yīng)降低了納米顆粒對水體生物的毒害作用.

    3 結(jié)論

    本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明,AgNPs在質(zhì)量濃度0~20 μg/mL范圍內(nèi)均對硝化細(xì)菌有抑制作用,且濃度越高抑制率越高.低pH值條件下AgNPs易于金屬離子釋放,對硝化細(xì)菌的抑制率較高;而高pH值條件下AgNPs容易發(fā)生團(tuán)聚,對硝化細(xì)菌的毒性作用減弱.腐殖酸能夠促使水體中AgNPs的團(tuán)聚趨于穩(wěn)定,并且還能夠包覆AgNPs降低對硝化細(xì)菌的毒性作用.

    [參 考 文 獻(xiàn)]

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